Abstract
目的
通过检测机械应力相关调控蛋白〔肌动蛋白纤维（F-actin）、非肌肉肌球蛋白ⅡB（non-muscle myosin ⅡB，NMⅡB）和细胞黏着斑蛋白Vinculin〕在牙发育过程的时空性表达，探究机械应力与牙早期发育之间可能的联系。
方法
以小鼠磨牙为研究模型，通过免疫荧光染色，检测构成化学机械系统的重要分子F-actin、NMⅡB和Vinculin在牙发育蕾状期、帽状期、钟状早期和钟状末期的表达。
结果
染色结果显示F-actin、NMⅡB和Vinculin均在牙发育各阶段广泛或局限性表达于牙上皮，其中F-actin亦稳定表达于间充质细胞中。荧光表达强度定量分析显示，F-actin和NMⅡB的表达均在牙发育早期阶段有明显上升，但分别于钟状早期和钟状末期回落，相邻发育阶段间的表达变化差异均有统计学意义（P<0.05），而Vinculin的表达相对稳定，仅钟状末期较钟状早期有所升高（P<0.05）。
结论
机械应力参与牙早期发育过程。其中，F-actin可能在分散和传导机械应力的方面发挥重要作用，NMⅡB作用于牙发育中的牙上皮内陷及牙尖形成，Vinculin可响应力学刺激并与细胞黏附分子相互作用影响牙发育过程，而由肌动蛋白与肌球蛋白结合形成的肌动球蛋白复合体和细胞黏附分子在牙发育中的联系及具体作用机制依然有待进一步探究。
Keywords: 机械应力, 牙发育, 肌动蛋白纤维, 非肌肉肌球蛋白, 细胞黏着斑蛋白
Abstract
Objective
In order to better understand the role of mechanical stress in early tooth development, we examined the spatiotemporal expression patterns of mechanical-stress related regulatory protein (actin filament, or F-actin), non-muscle myosin ⅡB (NMⅡB) and vinculin at different stages of tooth development in mice.
Methods
Mouse first mandible molars were used as the research model. Immunofluorescence staining was performed to detect the expression patterns of F-actin, NMⅡB and Vinculin, the key molecules constituting the chemical mechanical system, at bud, cap, early bell and late bell stages of tooth.
Results
F-actin, NMⅡB and vinculin were all expressed in the tooth epithelium in an extensive or a limited way at different stages of tooth development, while F-actin was also expressed steadily in the mesenchymal cells. The quantitative analysis of fluorescence intensity showed that F-actin and NMⅡB exhibited significantly increase in the early stage of tooth development, but then dropped to their basal levels at the end of the late bell stage and the early bell stage respectively, with the differences of expression changes between successive developmental stages showing statistically significance (P<0.05). Vinculin expression, however, remained at a relatively constant level except for the late bell stage when vinculin expression was slightly elevated compared to that of the early bell stage (P<0.05).
Conclusions
The findings suggest that mechanical stress is involved in early tooth development. F-actin may have an important role in dispersing and transmitting mechanical stress while NMⅡB may participate in tooth epithelial invagination and cusps formation. The findings also suggest that vinculin can respond to the mechanical stimuli and its interaction with cell adhesion molecules may play a role in tooth development. The mechanism of how actomyosin and cell adhesion interact with each other in regulating tooth development still needs further investigation.
Keywords: Mechanical stress, Tooth development, F-actin, NMⅡB, Vinculin
牙是脊柱动物的一个特征性器官，牙的正常发育对于人类口腔的生理功能和美观都有着非常重要的意义。牙发育依赖于来自颅神经嵴的间充质细胞和来源于外胚层的上皮细胞相互作用，经历牙板、蕾状期、帽状期以及钟状期，逐渐分化为不同的牙体组织，并形成特定牙齿形态[1]。已有大量研究结果显示，在牙发育过程中，不同化学信号分子构成庞大的信号网络，调控牙发育过程[2]，而机械应力在牙发育过程中的重要性也日益受到关注[3]。
文献显示，在胚胎和组织发育中，机械应力扮演了十分重要的角色。例如，在颅面发育过程中，机械应力能通过作用于软骨细胞促进其增殖分化，调节血管生成，最终影响颅底软骨的联合[4]；在肌腱发育过程中，机械应力可直接作用于细胞外基质，促进细胞外活性转化生长因子-β（transforming growth factor-β, TGF -β）的释放从而调节肌腱的伸长和分支[5]；在果蝇腹沟形成过程中，组织内的机械应力可促进原肠胚形成所需的组织内陷[6]。
近期研究提示机械应力同样存在于牙发育中。在牙发育初期，由牙板向蕾状期发育时，牙上皮基底上层的平面收缩，产生引导牙上皮弯曲的侧向拉力，导致牙上皮内陷，该侧向拉力可能与细胞运动相关的肌动蛋白和肌球蛋白有着密切联系[7]。此外，肌动蛋白纤维、肌动蛋白结合蛋白与肌球蛋白共同组成细胞力学传导中的化学机械系统，可通过利用ATP水解释放的化学能产生运动。其中，肌动蛋白纤维（actin filament，F-actin）是由肌动蛋白组成的骨架纤维，是细胞骨架重要结构之一；黏着斑蛋白Vinculin是一类重要的肌动蛋白结合蛋白，能够使F-actin固定到细胞膜上；而肌球蛋白Ⅱ是肌球蛋白中的重要分型，可以通过利用ATP，向肌动蛋白纤维的正极趋向地运动。
目前，针对机械应力相关调控蛋白在牙早期发育中的研究较少。本研究拟以小鼠磨牙为研究模型，通过检测标记F-actin、非肌肉肌球蛋白ⅡB（non-muscle myosin ⅡB，NMⅡB）和细胞黏着斑蛋白Vinculin在牙发育时期各阶段的表达，探究机械应力相关调控蛋白与牙发育之间存在的联系，为牙发育及再生的研究提供新的生物学基础及认知。
1. 材料与方法
1.1. 动物样本
本实验采用的野生型（C57BL/6）小鼠由四川大学实验动物中心提供。本研究获四川大学华西口腔医学院伦理委员会批准（编号：WCCSIRB-D-2019-136）。将雄性小鼠与雌性小鼠进行合笼，每天清晨检查雌鼠阴道，待发现阴道栓当天正午12点确定为E0.5；对E13.5、E14.5、E16.5、E18.5孕鼠行CO2安乐死，收取胎鼠。磷酸盐缓冲液（PBS）清洗后，用刀片小心分割并收集胎鼠头部，分离下颌组织，放置于体积分数为4%多聚甲醛溶液中过夜固定待用。E18.5胎鼠下颌组织经多聚甲醛过夜固定后放入EDTA溶液脱钙一周后待用。
1.2. 主要试剂和仪器
PBS粉剂（武汉博士德生物工程公司）；F-actin染色剂Alexa Fluo 488 Phalloidin（Thermo Fisher，A12379）；抗兔NMⅡB多克隆抗体（Biolegend，909901）；抗兔Vinculin单克隆抗体（Cell Signaling，13901）；山羊抗兔IgG多克隆（H+L）抗体Alexa Fluor 488（Thermo Fisher，A27034）；荧光共聚焦显微镜（ZEISS LSM780）；冰冻切片机（Leica RM2235）；全密封式组织脱水机（Leica ASP300S）；石蜡切片机（Leica CM3050 S）。
1.3. 冰冻切片
冰冻切片样本适用于鬼笔环肽染色（Phalloidin染色）对F-actin进行标记。将各时期胎鼠下颌组织样本逐步置于体积分数为5%、10%、20%的蔗糖PBS溶液，每次1 h，再置于体积分数为30%蔗糖PBS溶液过夜；将样本从30%蔗糖溶液中转移到用30%蔗糖溶液按1∶1比例稀释OCT的溶液中过夜；将样本转移至OCT中2 h，按固定角度转移至新鲜OCT，干冰冷却包埋；冰冻切片机按照10 μm厚度，冠状面切片。
1.4. 石蜡切片
石蜡切片样本用于NMⅡB和Vinculin免疫荧光染色。将各时期胎鼠下颌组织样本逐步置于体积分数为25%、50%、75%乙醇蒸馏水溶液中，每次1 h；使用全密封式组织脱水机脱水浸蜡，石蜡包埋样本，使用石蜡切片机冠状面切片，厚度7 μm，37 ℃烤片过夜。
1.5. 免疫荧光染色
1.5.1. Phalloidin免疫荧光染色
PBS洗2次，各5 min；PBS+0.1%TritonX-100，15 min，2%BSA室温封闭30 min～1 h；加入F-actin染色剂Alexa Fluo 488 Phalloidin避光孵育45 min～1 h，加入PBS，洗2次，每次5 min；DAPI核染5 min。防淬灭封片剂封片，4 ℃保存。荧光共聚焦显微镜采图。利用软件Fiji对牙上皮荧光表达强度进行定量分析。
1.5.2. NMⅡB和Vinculin免疫荧光染色
染色前60 ℃烤片45～60 min；二甲苯2次，每次5 min；体积分数100%的乙醇2次、95%乙醇2次，每次10 min；自来水2次，每次5 min；PBS及PBST各5 min；2%BSA室温条件下1 h；加入抗兔NMⅡB多克隆抗体（1∶100）、抗兔Vinculin单克隆抗体（1∶100）4 ℃孵育过夜；次日于PBST中清洗3次，每次5 min；加入山羊抗兔IgG多克隆（H+L）抗体Alexa Fluor 488（1∶250），避光室温孵育1 h，PBST洗2次，每次5 min；之后进行DNA核染：将DAPI和PBST以体积比1∶1 000比例稀释，室温孵育5 min；防淬灭封片剂封片，4 ℃保存。荧光共聚焦显微镜采图。利用软件Fiji对牙上皮荧光表达强度进行定量分析。
1.6. 统计学方法
利用软件Prism 8对荧光表达强度进行统计学分析。采用单因素方差分析（One-Way ANOVA）检验同一蛋白在不同发育阶段荧光强度表达水平的差异，若差异有统计学意义，通过Tukey法（Tukey’s HSD）对相邻发育阶段进行两两比较，P<0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1. F-actin在小鼠磨牙发育过程中的表达
Phalloidin免疫荧光染色结果显示（图1），F-actin在蕾状期（E13.5）、帽状期（E14.5）、钟状早期（E16.5）和钟状末期（E18.5）均广泛表达于牙上皮及间充质细胞。其中，在E13.5时基底上层细胞内F-actin较基底层略有增加，最表层的牙颈部细胞处更为明显；在E14.5及E16.5时，F-actin更集中表达于内釉上皮外侧顶端处、星网状层和表层牙颈部细胞，而E14.5时釉结处表达不明显；在E18.5时，F-actin高表达在呈高柱状的内釉上皮层细胞两端。
图 1.
Expression of F-actin in mouse molar development (immunofluorescence staining)
F-actin在小鼠磨牙发育过程中的表达（免疫荧光染色）
The dashed white lines indicate the borders between the dental epithelium and mesenchyme.
2.2. NMⅡB在小鼠磨牙发育过程中的表达
NMⅡB免疫荧光染色显示（图2），NMⅡB在E13.5、E14.5的小鼠磨牙牙胚中广泛表达于整个牙上皮以及间充质细胞，在牙上皮基底层细胞基底一侧更集中，且在E14.5釉结处表达；在E16.5和E18.5，NMⅡB在内釉上皮层，特别是内釉上皮层及星网状层细胞交接处表达增强，而其在间充质中的表达稍有减弱。
图 2.
Expression of NMⅡB in mouse molar development (immunofluorescence staining)
NMⅡB在小鼠磨牙发育过程中的表达（免疫荧光染色）
The dashed white lines indicate the borders between the dental epithelium and mesenchyme.
2.3. Vinculin在小鼠磨牙发育过程中的表达
Vinculin免疫荧光染色显示（图3），Vinculin在E13.5表达于牙上皮的基底上层和牙胚颈部，基底层细胞仅存在较弱表达且集中于靠基底一侧；E14.5时，Vinculin主要表达于星网状层和牙胚颈部，釉结处无明显表达；E16.5时，Vinculin仍主要表达于星网状层和牙胚颈部，同时颊舌侧颈环处外釉上皮层处表达稍有升高；而在E18.5时，Vinculin主要表达于内釉上皮层及牙颈部。
图 3.
Expression of Vinculin in mouse molar development (immunofluorescence staining)
Vinculin在小鼠磨牙发育过程中的表达（免疫荧光染色）
The dashed white lines indicate the borders between the dental epithelium and mesenchyme.
2.4. F-actin、NMⅡB和Vinculin在小鼠磨牙发育过程中的相对表达水平
荧光表达强度定量分析显示（图4），这3种机械应力相关调控蛋白在牙上皮发育阶段均有明显表达。其中，F-actin在E16.5之前的表达呈逐渐升高趋势，而到E18.5后表达下降，统计学分析显示相邻时期荧光表达强度的差异均有统计学意义（P<0.001）；NMⅡB从E13.5至E14.5表达水平明显升高，但E16.5时下降，并于E18.5再次回升，相邻发育阶段表达变化仍有统计学意义（P<0.05）；Vinculin的表达在E16.5前始终维持在相对稳定的水平，仅于E18.5开始有所升高（P<0.05）。
图 4.
Fluorescence intensity of F-actin, NMⅡB and Vinculin in tooth epithelium during mouse molar development
F-actin、NMⅡB和Vinculin在牙上皮中的荧光强度
*P<0.05, ***P<0.001.
3. 讨论
近年来，机械应力在牙发育中可能起到的作用逐渐引起重视。最近研究发现，在乳牙萌出之前，牙的发育速率显著高于颌骨发育速率，产生颌骨内应力。维持该应力情况下，恒牙的启动发育受到抑制。一旦乳牙萌出，该颌骨内应力即被释放，进而启动恒牙发育[8]。该研究提示机械应力在牙的萌出和更替过程中的重要地位。同时，研究表明在早期牙发育过程中，由牙胚上皮细胞形成的成釉器结构也存在张力。当E11.5磨牙胚外侧的上皮被完全剪断时，磨牙胚上皮从切口处向内快速收缩卷曲；若在牙上皮中部施加一个位于基底上层内的切口，而不破坏基底层，则牙上皮会从切口处向两侧收缩，切口扩大；如果两个切口同时施加，则牙上皮快速从外侧切口向内收缩的现象消失[7]。以上结果表明，在牙早期发育过程中，牙胚基底上层内存在张力，且该张力在牙上皮内陷进入蕾状期及进一步发育的过程中发挥重要作用。该实验进一步发现，在该模型条件下加入肌动蛋白聚合抑制剂Cytochalasin，或加入非肌肉肌球蛋白ⅡATP酶抑制剂Blebbistatin，均无法观察到施加切口后的牙上皮收缩现象[7]，提示与机械应力相关的肌动蛋白和肌球蛋白与牙上皮内部张力密切相关。本研究拟通过对F-actin、NMⅡB和肌动蛋白结合蛋白Vinculin在小鼠磨牙发育时期各阶段的时空表达，验证并探讨机械应力与牙发育之间可能存在的关系。
Phalloidin是一种环状七肽毒素，可与F-actin相结合。这种特殊性质使Phalloidin成为标记和研究细胞内F-actin的有力工具。F-actin是动态的细胞骨架结构和组件，当这些F-actin聚合在细胞膜或细胞核膜上时会产生推力[9]，而肌动蛋白和非肌肉肌球蛋白间的滑动可产生收缩力[10]。本研究中检测到F-actin在牙上皮以及间充质均存在广泛表达。其中，F-actin在牙上皮基底上层的广泛表达以及E16.5之前牙上皮内Phalloidin荧光表达水平的逐渐上升提示F-actin与牙发育早期牙上皮内部的张力及牙上皮内陷有关，而位于牙颈部及内釉上皮层的表达提示F-actin可能在分散和传导机械应力等方面发挥重要的作用。
肌球蛋白是沿肌动蛋白纤维轨道运动的分子马达超大家族。肌球蛋白Ⅱ作为肌球蛋白中的重要分型，可以向肌动蛋白纤维的正极趋向运动。肌球蛋白Ⅱ最初于肌肉组织中被发现，后亦被发现于非肌肉细胞，可以为细胞内各种分子活动提供动力[11]。由非肌肉肌球蛋白Ⅱ介导产生的机械应力被认为是细胞形变、组织形态发生的重要因素。例如蝇原肠形成时，中胚层细胞的非肌肉肌球蛋白Ⅱ动态性增强改变局部机械应力，从而使中胚层细胞向顶部移动，造成周期性收缩而促进中胚层内陷[12]。由肌动蛋白与肌球蛋白结合形成的肌动球蛋白复合体所驱动的组织形变也被证明与内耳、舌乳头原基发育初期的上皮内陷有关[13-14]。结合本研究中NMⅡB在牙发育早期的广泛表达以及在帽状期前显著升高的上皮内表达水平，亦可推测在整个牙发育过程中NMⅡB在早期有着更重要的作用，很可能参与调控牙上皮内陷进程。进入钟状期后，NMⅡB在内釉上皮层的表达，提示其参与牙尖形态的形成。
而黏着斑蛋白Vinculin作为一类重要的肌动蛋白结合蛋白，能够使F-actin固定到细胞膜上，从而连接细胞骨架和胞外基质，参与细胞力-化学信号转导过程[15]。本研究中，Vinculin 在帽状期之前主要表达于牙上皮的基底上层或星网状层以及牙胚颈部，且釉结处表达不明显， 与同时期 F-actin表达 具有一定相似性，但引起这种相似性的内在机制尚不明确。与此同时，Vinculin与多种细胞黏附相关分子如整合素及钙黏附素也有着密切关系[16-18]，而后者介导的细胞黏附连接在牙发育中也扮演重要角色[19-20]。结合以上结果，提示牙发育过程中Vinculin可能发挥双重作用，不仅能响应机械应力刺激，同时能与细胞黏附连接相互作用，影响牙发育过程。而以肌动球蛋白为代表的机械应力调控蛋白和细胞黏附连接在牙发育过程中的相关联系及相互作用机制依然有待进一步探究。
本研究将3种机械应力相关调控蛋白在牙发育过程中表达时间与表达部位进行了定位，初步明确了机械应力参与牙早期发育过程，但仍缺乏对相关调控机制的研究。在下一步实验中，拟运用转基因敲除小鼠，对机械应力相关调控蛋白编码基因做条件性敲除，探究其对牙发育过程的影响，进一步结合体外培养牙胚组织和细胞，深入研究机械应力相关蛋白调控牙早期发育的分子机制。
Funding Statement
中国博士后科学基金面上项目（No. 2019M663526）资助
Contributor Information
文 杜 (Wen DU), Email: wendu@scu.edu.cn.
海洋 于 (Hai-yang YU), Email: yhyang6812@scu.edu.cn.
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