基于外周血游离RNA分析预测孕妇子痫前期的研究进展

Abstract

子痫前期严重影响母婴健康，目前缺乏基于相关发病机制基础上的治疗方法，亦无独立可靠的早期预测子痫前期的临床指标。近期有研究表明通过对孕妇外周血游离RNA的分析发现，游离RNA检测可以在临床症状出现前提前预测子痫前期的发生。本文对于母体中游离RNA分析用于预测子痫前期的研究现状与进展进行阐述，同时指出外周血游离RNA分析可能会成为一种具有潜力、实时、无创的监测手段，可用于探索子痫前期发病机制、病理生理变化以及识别子痫前期的不同亚型。

子痫前期（preeclampsia, PE）是妊娠期特有的一种全身性疾病，是指在妊娠20周之后出现血压升高，大于140/90 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa），或之后伴有≥1种以下新发疾病：异常蛋白尿，母体器官功能障碍，或子宫胎盘功能障碍^[1-3]。早发型PE是导致孕产妇死亡的重要原因之一，全球发病率为2%～8%^[4]。目前比较公认的PE发病机制为“两阶段”模型，根据PE的分型，早发型PE（在妊娠34周前发生）与胎盘功能障碍相关的并发症高度相关，而晚发型PE（在妊娠34周或之后发生）被认为是一种没有胎盘不良的母体综合征^[5]。目前PE的病因及发病机制尚未完全阐明，可能是遗传、免疫系统失衡、全身炎症反应激活、孕妇各种高危因素等综合原因导致的一种母体-胎盘-胎儿的综合征^[6]。

PE对母儿危害大，预防、预测PE的发生非常重要。2017年ASPRE研究表明妊娠11～13周被确定为有PE高风险的孕妇，从妊娠11～14周（最晚16周前）到妊娠36周服用小剂量阿司匹林可使早产PE发病率降低62%^[7]。目前以应用孕产妇和妊娠特征为依据的危险因素风险评分，对PE的检出率仅30%～40%^[8]。而由母体因素和平均动脉压、子宫动脉搏动指数和血清胎盘生长因子（placental growth factor, PlGF）的测量值组合的早期妊娠预测模型，对早期和早产PE的检出率分别为90%和75%^[9]。其它预测方法，如子宫动脉多普勒PI（UAPI）^[10]、PlGF浓度^[11]以及可溶性血管内皮生长因子受体-1（soluble fms-like tyrosine kinase 1, sFlt1）∶PlGF（sFlt1∶PlGF）比率>38阳性作为截止值^[12]，均可在一定程度上预防PE的发生。虽然目前这些方法取得了令人兴奋的进展，但普遍存在阳性预测值、敏感性低以及应用范围局限的问题，仍然没有可以普遍应用、具有足够强的区分效能的测试以及在临床症状发生前可靠地预测PE的方法。最近斯坦福大学Stephen R Quake小组^[13]通过对孕妇外周血游离RNA（cell-free RNA, cf-RNA）的分析发现，cf-RNA转录表达变化可以在整个妊娠过程中区分血压正常和PE患者，而与PE的亚型无关，这些cf-RNA的变化远在临床症状出现之前就表现出明显差异，可以较早地预测PE的发生。一个大样本队列研究（1840份新鲜血，2539份冻存血）评估了孕中期（16～27周）血浆中cf-RNA的变化，发现其在设定敏感性为75%时，阳性预测值可达到32%，说明约1/3的在本研究中判断为高风险的孕妇在后期出现了PE，同时表明cf-RNA是一个独立的疾病预测因子，体质量指数、年龄、种族等因素均不影响该研究的结论。该研究还指出，其中一些cf-RNA表达的转录产物可以独立于临床因素准确跟踪妊娠进展，并能在疾病出现前几个月可靠地识别有发生PE风险的女性^[14]。孕期母体外周血cf-RNA水平的检测对于预测PE具有重要的价值，它有可能成为PE的早期检测分子标记物。

在怀孕过程中，母亲循环内会产生cf-RNA，这些cf-RNA分别从子代、胎盘与母体释放而来。母体外周血cf-RNA是不同类型组织细胞凋亡后释放的RNA的总和，包括母体cf-RNA和游离胎儿RNA（cell-free fetal RNA, cff-RNA）。而cff-RNA又分为mRNA和非编码RNA（ncRNA），而ncRNA又可分为长链非编码RNA（lncRNAs）、环状RNA（circRNAs）以及微小RNA（miRNAs）等^[15]。下面分别对各类RNA的特性及用途做一简要介绍。

1. 母体cf-RNA

WEINER等^[16]最近一项在使用母体血浆RNA预测自然早产的模型中扩展出对PE的预测研究表明，其中与早产相关的血浆cf-RNA（NAMPT、APOA1 ）对早发型PE和PE均有预测作用。而另一项研究也证实了使用来自怀孕16～20周母体外周血中的cf-RNA以及母体特征和病史的模型对早发型PE也具有极好的预测能力^[17]。有研究表明异常的cf-RNA通过上调和下调基因的表达来参与PE发病机制，上调基因主要为调节以结构细胞功能为主的通路，而大多数下调基因主要调节途径与免疫途径有关^[14]。斯坦福大学Stephen R Quake小组通过对母体外周血cf-RNA的分析发现，这些母体cf-RNA的变化远在临床症状出现之前就表现为明显差异^[13]。他们认为神经肌肉、内皮、免疫细胞类型和组织的病理生理反应引起了这些cf-RNA的变化，这也与既往PE发病机制的母胎界面研究一致。且研究中母体血浆中cf-RNA的变化可以至少反映母体5个器官系统（脑、肝、肾、肌肉和骨髓）的功能障碍，并可能进一步区分是否伴有严重症状^[13]。这在预测PE及判断病情发展程度方面有了质的改变。

2. 母体外周血cff-RNA

2000年POON等^[18]首次报道了母体外周血存在cff-RNA。2003年NG等^[19]证明了胎盘是将cff-RNA释放到母体血浆中的重要器官，同时证实cff-RNA在母体血浆中有一定的稳定性。而另一项研究表明，cff-RNA占母体外周血总RNA的比例从孕早期的0.4%增加到孕中期的3.4%，孕晚期可达15.4%，呈现随孕周增加逐渐增多，孕晚期达最高峰，产后快速被清除的趋势^[20]。

2.1. mRNA

既往有研究表明，与健康孕妇相比，PE患者母体外周血内胎儿游离mRNA有明显的差异，它有可能成为PE早期检测的生物标记物^{[13-14, 21-22]}。NG等^[23]报告PE孕妇血浆中胎儿促肾上腺皮质激素释放激素（CRH）mRNA水平显著高于正常孕妇，其表达水平与PE的严重程度呈正相关，考虑CRH mRNA来源于胎盘，可能参与PE的病理生理。胎盘基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase, MMP）家族与滋养层细胞侵入有关，而早发型PE的发生机制与滋养层细胞侵入不足密切相关，有研究发现，孕28周时健康孕妇的MMPs mRNA（MMP-2，MMP-9，MMP-14，MMP-15，MMP-26）表达水平显著高于孕14周，而早发型PE患者孕14周和28周血浆中MMP-2、MMP-9、MMP-15 mRNA水平显著升高，MMP-14 mRNA表达降低^[24]。肾上腺髓质素（ADM）是促血管生成素，WHIGHAM等^[25]发现，与健康孕妇相比，PE患者循环ADM mRNA在孕28周和孕36周均减少，而早发型PE患者则进一步降低。在诊断足月PE前10～12周即可监测到母体外周血中ADM mRNA水平降低，表明它可能来源于内皮或胎盘^[25]。由此可见，母体外周血中CRH mRNA、ADM mRNA、MMPs mRNA的异常表达均与PE有关，且能在一定程度上区分PE的严重程度。RASMUSSEN等^[14]构建了与PE相关的7个RNA转录基因（CLDN7、PAPP-A2、SNORD14A、PLEKHH1、MAGEA10、TLE6和FABP1）的模型，结果显示在75%的灵敏度下，该模型获得了32.3%（标准差3%）的阳性预测值，优于目前临床最先进模型报告的筛查阳性率10%^[26]。

母体外周血胎儿游离mRNA水平直接反映了胎儿基因表达模式，理论上可以作为PE早期检测的生物标记物，以及区分PE不同亚型的良好预测因子，但mRNA的全长较长，会产生较多的降解产物，因此不同的引物产生的结果可能有较大的差异，但仍需大量临床研究提供更多的数据支持。

2.2. ncRNA

ncRNA的异常表达或其异常相互作用会导致多种疾病的发展，包括PE和心血管疾病。ncRNA可能通过调节多种信号通路、抑制滋养层细胞的迁移和侵袭、增殖，诱导胎盘滋养层细胞凋亡，引发内皮功能障碍等机制参与PE的发生。一项Meta分析研究表明循环ncRNA检测阳性患者发生PE的概率是对照组的13倍，验证了血清ncRNA可作为非侵入性生物标记物，同时联合生物标记物，如sFlt1∶PlGF和妊娠相关血浆蛋白A，分析表现会更好^[24]。

2.2.1. lncRNAs

LncRNA NORAD作为一种调节因子，在妊娠期高血压中的表达水平高于健康人，而在PE中NORAD的表达水平高于妊娠期高血压及健康人，表明LncRNA NORAD可能作为妊娠期高血压疾病诊断的生物标志物^[27]。此外，SUN等^[28]对PE患者全血中上调的lncRNA BC030099进行分析，确定lncRNA BC030099是PE的独立预测因子。LUO等认为血清AF085938、G36948和AK002210可以作为PE的潜在诊断生物标记物（AUC分别为0.7673、0.7956和0.7575）。而WANG等^[29]表明lncRNA H19、MALAT1和MEG3参与早期胎盘形成和PE的发展。OGOYAMA等^[30]提及在那些后来发展为PE的孕妇血浆中，lncRNA H19显著上调，这些孕早期的母体外周血lncRNAs有望成为早产PE的可能生物标志物。目前关于lncRNAs在早期胎盘中的表达和功能的信息有限，需要对早孕期孕妇的更多血液样本进行前瞻性队列研究。

2.2.2. circRNAs

circRNAs已被证明可调节滋养层细胞的生物学功能并介导PE的进展。近期有研究表明，circRNAs可以作为miRNAs的中介并调节基因表达。circ_0055724在PE组织中低表达，circ_0055724可能通过降低miR-136诱导N-cadherin表达，调节滋养层细胞的增殖、迁移和侵袭，可作为PE患者早期诊断和预后的有希望的生物标志物^[31]。而既往研究也表明circ_0055724可作为早期PE的潜在新型血液生物标志物^[32]。circ_0085296可以通过调节miR-942-5p/血小板反应蛋白2（THBS2）的表达，抑制滋养层细胞的增殖、迁移、侵袭和血管生成，证实circ_0085296可能是PE的潜在治疗靶点^[33]。SUN等^[22]通过ROC曲线分析比较，发现循环中circRNAs的AUC波动于0.611～0.995，而JIANG等^[34]发现circ-0004904和circ-0001855与血清妊娠相关血浆蛋白-A结合可能是检测PE的有希望的生物标志物。circRNAs检测的好处是环状RNA不存在明显的降解。目前对circRNAs预测PE发生的研究相对较少，相信在未来会有越来越多的circRNAs被发现，而这些类型的circRNAs可能作为预测PE可行和有用的生物标志物。

2.2.3. miRNAs

在孕11～13周对35名后来发生早发型PE孕妇和40名正常孕妇的血浆样本进行了RNA测序分析，并确定了25个表达水平显著改变的ncRNA，包括12个miRNAs可作为预测早发型PE的候选生物标志物^[35]。一项Meta分析研究表明miRNAs在PE预测中显示出相对较高的预测准确性，是更强的预测因子^[21]。近期一篇综述中总结了PE患者中胎盘来源miRNAs表达显著异常，参与了PE孕妇胎盘生理功能和病理发育的调节，可以将miRNAs作为妊娠相关生物标记物，如PE、胎儿生长受限等^[36]。例如，miR-125b通过抑制其靶标STAT3的表达来抑制绒毛外滋养细胞的迁移和侵袭，而STAT3在细胞浸润和血管增殖中起关键作用^[37]。此外，miR-17～92和miR-106a～363簇的上调表达被证明可抑制滋养层细胞分化^[38]，这些均与PE的发病机制有关。miR-17已被证明对人类早期胎盘发育至关重要，它通过靶向肝细胞受体B4和促红细胞生产素生成肝癌相互作用体B2阻碍滋养层细胞功能，可能引起PE的发生^[39]。而ABDELAZIM等^[40]对160名孕妇进行研究表明，PE患者循环中miR-363和肺腺癌转移相关转录物1（MALAT-1）下调，miR-17则呈上调趋势，而miR-363在早发型PE中明显下降，MALAT-1在严重PE中明显下降，证实MALAT-1、miR-17和miR-363有诊断及区分严重PE的潜力。既往研究表明，19号染色体miRNAs衍生的miRNAs（例如，miR-517-5p、miR-518b和miR-520h）、缺氧诱导型miRNAs（miR-210）在后来发展为PE的孕妇中有明显变化^[30]。而另一项研究表明miR-210主要来自胎盘，也可能来源于受损的内皮，它在出现临床症状前8～12周的PE患者血清中的浓度较健康孕妇增加^[41]。miR-210在绒毛滋养细胞分化为绒毛外滋养细胞的过程中其表达降低，似乎与绒毛外滋养细胞的侵袭能力和早期胎盘形成有关^[30]。故miR-210具有作为妊娠早期PE循环预测生物标志物的潜力^{[29-30, 41]}。最近，也有人提出母体外周血中外泌体miRNAs种类在PE女性和正常妊娠女性体内存在差异表达^[42]。2018年MOTAWI等^[43]研究表明与正常妊娠相比，PE患者母体外周血中胎盘外泌体miRNA-136、494和495的表达水平显著升高，令人兴奋的是miRNA-136对PE的预测敏感性为95%，特异性为100%，表明母体外周血中的胎盘外泌体可作为PE发病机制的介质和PE诊断的早期生物标志物。HROMADNIKOVA等^[44]表明miR-517-5p、miR-518b和miR-520h的过表达与晚发型PE有关，血浆miR-517-5p对PE的预测性能最好，敏感性为42.9%，特异性为86.2%，阳性预测值为52.9%，阴性预测值为80.6%，它可能成为PE早期筛查的指标。胎盘来源的外泌体在早发型PE中的血浆含量较晚发型PE含量高^[45]。有趣的是，从妊娠的前三个月就可以观察到后来患有PE的女性血液循环中总外泌体和胎盘外泌体数量的增加，这支持了使用胎盘外泌体作为PE候选非侵入性生物标志物的观点^[46-47]。其他研究发现在孕11～13周时母体循环中胎盘来源的miR-202-3p在未来发生严重先兆子痫的妊娠早期过表达，在严重PE发病组中较健康孕妇高出7倍，也可能为潜在的预测严重子痫前期的标志物^[48]。

现有miRNAs的研究显示出对PE相对较高的预测准确性，可能为更强的预测因子。但PE的分子机制尚不完全了解，以及组织特异性miRNAs表达差异，仍需大量的临床研究证实。

3. 小结与展望

相较目前临床中所用的其他预测方法，孕妇外周血中cf-RNA有许多优点：cff-RNA与胎儿性别和染色体多态性无关，即某些妊娠特异性RNA能排除母体背景的干扰，反映了胎儿基因的表达水平，可用于较多RNA分子的标记。母体外周血cf-RNA转录产物在妊娠早期的可检测性，在母体循环中稳定存在，且能在临床症状出现前发生变化，一定程度上反映了PE疾病的发病机制、病理生理发展过程，以及作为一种非侵入性的监测母体特定器官损伤风险的方法，既可以作为科研和临床工具在人体中研究发病机制，通过实时标记和分层分析，也可以作为孕产妇的疾病预测指标。

目前对于母体外周血中cf-RNA的主要来源，主要认为血液中的血小板与内皮细胞可以释放母体cf-RNA，进一步的RNA分析也发现其与免疫细胞有密切的关系^[13]。通过对母体外周血中cf-RNA的来源分析，发现其可以反映五个脏器的病理生理改变——大脑、肝脏、肾脏、肌肉和骨髓^[13]，因此对于外周血中cf-RNA的分析可望更有效地区分PE是否具有严重合并症。但目前对母体外周血cf-RNA的研究仍处于实验阶段，并未实践于临床，也无公认的良好预测因子，且很多研究仅区分了正常妊娠与PE患者之间的联系，对PE的亚型（早发型PE与晚发型PE），cf-RNA在其中表达的差异仍不明确。另外，如何区分母体外周血中cf-RNA的来源、确定检测的最佳时间、如何确定其与妊娠期相关疾病，尤其是区分PE的不同亚型等，这些问题未得到完全解决，使cf-RNA从科研转为临床应用充满挑战。基于现有的研究，母体外周血中cf-RNA有望成为预测PE的新指标，一方面，需要独立的回顾性样本的交叉验证，另一方面，目前筛选出的外周血cf-RNA需大规模前瞻性的临床研究验证后方可应用于临床实践。总之，在未来母体外周血cf-RNA可能会成为一种具有潜力的、实时、无创的监测手段，同时应用于探索PE发病机制、识别不同亚型之间的病理生理变化，为临床应用搭建桥梁。

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