乳腺癌细胞来源的细胞膜纳米囊泡制备及靶向特性

Abstract

Objective

To prepare cell membrane nanovesicles (NVs) derived from breast cancer cells, to explore their basic characteristics, tumor cell endocytosis, and in vivo distribution in a tumor-bearing mouse model, and to investigate their tumor targeting properties.

Methods

4T1 breast cancer cells were cultured in vitro. The cell membrane of 4T1 cells was isolated through ultracentrifugation and NVs were formulated with a liposome extruder. The size distribution of NVs was determined by way of dynamic light scattering, and the morphology properties of the NVs were examined with transmission electron microscope. The stability of NVs was analyzed by measuring the diameter changes of NVs submerged in phosphate-buffered saline (PBS). The biocompatibility of NVs was investigated by measuring the viability of dendritic cells treated with NVs at different concentrations (5, 10, 20, 50, and 100 mg·L⁻¹) by CCK-8 assay. Fluorescence microscopy was used to analyze the cellular uptake of NVs by breast cancer cells. A mice model of breast cancer model was established with mice bearing subcutaneous xenograft of 4T1 cells. The mice were treated with Cy5.5-labeled NVs injected via the tail vein and the in vivo distribution of NVs was analyzed with an imaging system for small live animals.

Results

The results showed that NVs derived from 4T1 breast cancer cells were successfully prepared. The NVs had a mean diameter of 123.2 nm and exhibited a hollow spherical structure under transmission electron microscope. No obvious change in the size of the NVs was observed after 7 days of incubation in PBS solution. CCK-8 assay results showed that the viability of dendritic cells treated with NVs at different concentrations was always higher than 90%. Fluorescence microscopic imaging showed that NVs could be efficiently internalized into breast cancer cells. in vivo biodistribution analysis revealed that breast cancer cell-derived NVs showed higher distribution in tumor tissue than the NVs prepared with normal cells did.

Conclusion

We successfully prepared cell membrane NVs derived from 4T1 breast cancer cells. These NVs had efficient cellular uptake by breast cancer cells and sound tumor targeting properties.

化学治疗仍是当前肿瘤治疗的主要策略之一，然而传统化疗药物的严重毒副作用限制了临床的进一步应用^[1]。药物递送载体可以提高化疗药物的利用率，减少毒副作用，因此近年来成为抗肿瘤研究的热点领域^[2-3]。由于肿瘤部位的高通透性和滞留效应（enhanced permeability and retention effect, EPR）^[4-6]，纳米载体可以被动地靶向肿瘤组织，提高药物的肿瘤蓄积；此外纳米载体表面通过抗体、多肽、核酸等靶向基团还可以主动靶向肿瘤细胞^[7]，提高药物递送效率。具有良好生物相容性及肿瘤靶向特性的递送载体成为近年来热点课题。

近年来，天然来源的细胞膜作为理想的载体材料被用于药物递送系统制备^[8-9]，例如利用红细胞膜^[10-11]、血小板膜^[12-13]、白细胞膜^[14]及细菌外膜^[15]等材料制备的细胞膜囊泡^[16]近年来被广泛用于药物输送、基因输送、纳米疫苗、活体成像等生物医学领域。同源粘连效应（homologous adhesion）是指肿瘤细胞由于其异常表达的细胞黏附因子（cell adhesion molecule, CAM）^{[8, 17]}与一些细胞间因子^[18]而产生的不同于其他正常细胞的一种黏附同源细胞的自我靶向能力。与其他细胞来源的细胞膜相比，肿瘤细胞膜因同源靶向特性在药物递送系统有着更加广阔的前景。此外，肿瘤细胞膜有效保留肿瘤相关抗原等刺激抗原呈递系统^[19]，还可以诱导高水平的CD80、CD86和干扰素-γ生成^[20-21]，该项特性也使得肿瘤细胞膜在肿瘤疫苗领域中具有重要价值。

基于肿瘤细胞膜的同源靶向特性，本研究以乳腺癌细胞4T1细胞膜为原料制备一种肿瘤细胞来源的纳米囊泡（nanovesicles, NVs），研究NVs的生物相容性、肿瘤细胞内吞及体内的肿瘤靶向特性，为设计开发靶向肿瘤的药物递送系统提供重要参考。

1. 材料与方法

1.1. 小鼠、细胞、主要试剂和仪器

小鼠乳腺癌4T1细胞、人胚胎肾HEK293T细胞和小鼠树突状DC2.4细胞由本实验室细胞库提供，雌性BLAB/c 小鼠于长春亿斯实验动物技术有限责任本公司购置〔生产许可证：SCXK（吉）2020-0002〕苯甲基磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fluoride, PMSF）、4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（4′,6-diamidino-2-pHenylindole, DAPI）、细胞膜绿色荧光探针（3,3′-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate, DiO）和BCA蛋白定量试剂盒于上海碧云天生物技术公司购置，改良Eagle培养基（Dulbecco's modification of Eagle's Medium, DMEM）和胎牛血清（fatal bovine serum, FBS）于生工生物工程（上海）股份有限公司购置；CCK8购于AbMole Biosciences生物技术公司；细胞计数仪于美国DENOVIX公司，纳米粒度及Zeta电位分析仪（MicrotracNanotrac WaveⅡ）购置于美国麦奇克有限公司，LF10脂质体挤出仪于加拿大AVESTIN公司购置，M200多功能酶标仪于瑞士TECAN公司购置，可视荧光倒置显微镜于美国Thermo Fisher Scientific公司购置，Kodak多模式活体成像系统于美国柯达公司购置。

1.2. 细胞培养

小鼠乳腺癌4T1细胞、人胚胎肾HEK293T细胞和小鼠树突状DC2.4细胞在10%FBS以及1%青霉素-链霉素溶液的DMEM中培养，培养条件为37 ℃，体积分数5%CO₂，在细胞处于对数期时进行传代培养。

1.3. 方法

1.3.1. 细胞膜NVs制备

将处于对数生长期的4T1与HEK293T细胞分别用胰蛋白酶消化后进行收集，在1000 r/min条件下离心5 min收集细胞沉淀后用PBS缓冲液冲洗3次，使用HM 缓冲液(1 mmol·L⁻¹ EDTA、20 mmol·L⁻¹ Hepes-NaOH pH7.4、1 mmol·L⁻¹ PMSF) 重悬细胞，将匀浆器置于冰中，将细胞悬液加入匀浆器进行挤压50次，收集挤压后液体于1500 r/min条件下离心10 min，收集上清液进行超高速离心(35 000 r/min, 2 h)，弃去上清液收集，所得沉淀用PBS缓冲液重悬3次。用DiO染料于室温条件下染20 min后再次超速离心弃去游离染料后重悬，将沉淀重悬后依次通过含有1 μm、0.4 μm和0.2 μm聚碳酸酯滤膜的挤出仪中挤压20次得到细胞膜NVs，应用BCA蛋白定量试剂盒检测囊泡蛋白质量浓度表示细胞膜NVs质量浓度（mg·L⁻¹），NVs的粒径分布用纳米粒度分析仪MicrotracNanotrac Wave Ⅱ进行检测。使用透射电子显微镜观察NVs的尺寸结构。

1.3.2. 细胞膜NVs体外稳定性检测

NVs体外稳定性通过检测囊泡在PBS缓冲液中的粒径变化分析。在4 ℃条件下，将NVs悬于pH7.4 PBS缓冲液中，连续检测7 d，每隔24 h用纳米粒度分析仪检测NVs粒径分布。

1.3.3. 细胞膜NVs的生物相容性分析

利用CCK8法研究NVs的细胞相容性。将处于对数生长期的DC2.4细胞用胰蛋白酶消化后细胞计数，在96孔细胞培养板（每孔含5000个细胞）过夜培养后，加入含有不同密度（5、10、20、50和100 mg·L⁻¹）NVs的完全培养基， 37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中培养48 h，加入10 μL CCK8溶液后继续培养4 h后应用酶标仪（M200pro，瑞士TECAN）检测450 nm处吸光度（A）值。

1.3.4. 细胞膜NVs的细胞内吞

利用亲脂性荧光染料DiO制备绿色荧光标记的细胞膜NVs用于追踪细胞内分布。将对数生长期的4T1细胞接种于24孔细胞培养板中，过夜培养后加入含有细胞膜NVs（细胞膜总蛋白质量浓度：200 mg·L⁻¹）的培养基，培养3 h弃去培养基，用PBS缓冲液清洗3次，加入质量分数4%多聚甲醛固定20 min，PBS缓冲液冲洗3次后加入DAPI室温条件下染色10 min后用PBS清洗3次，应用荧光显微镜进行荧光成像。

1.3.5. 建立皮下乳腺癌荷瘤小鼠模型

利用4T1细胞注射雌性BLAB/c小鼠（6 周龄，15～20 g）建立皮下乳腺癌小鼠模型：用胰蛋白酶消化培养中的鼠源4T1细胞，用PBS洗涤3次后用细胞计数仪计数1×10⁶个细胞用PBS重悬接种于小鼠右侧腋下皮下，当肿瘤体积约为60～100 mm³时，将小鼠随机分为正常细胞囊泡组与肿瘤细胞囊泡组（n=3），通过尾静脉注射荧光标记的纳米囊泡进行体内分布实验。

1.3.6. 细胞膜NVs的小鼠体内分布

利用近红外荧光染料Cy5.5制备Cy5.5标记的NVs用于小鼠组织分布研究。将含有300 μg蛋白的NVs溶液与30 μL Cy5.5（5 μmol·L⁻¹）溶液混合均匀，4 ℃孵育过夜，得到Cy5.5标记的NVs。次日将Cy5.5标记的NVs通过尾静脉注射到上述分组的小鼠体内（每只小鼠300 μg），48 h后处死小鼠，将主要器官和肿瘤组织取出进行荧光成像，并对各组织中荧光强度进行定量分析。

1.3.7. 统计学方法

采用 GraphPad Prism 8.0统计软件进行统计学分析。各组细胞存活率、NVs生物稳定性和荧光强度经正态分布检验均呈正态分布，以表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间数据比较采用两独立样本t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2. 结果

2.1. 细胞膜NVs的粒径分布

动态光散射结果显示，细胞膜NVs的平均粒径为123.2 nm（图1A）；利用透射电镜分析囊泡的形貌结果显示，囊泡在电镜下呈空心球形结构（图1B）。

图 1.

Size distribution of cell membrane NVs (A) and morphology analysis of NVs by transmission electron microscopy (B)

细胞膜NVs的粒径尺寸（A）和透射电镜下细胞膜NVs的形态（B）

2.2. 细胞膜NVs的稳定性分析

结果如图2A显示，NVs孵育7 d后粒径无明显变化，体现出良好的生物稳定性。

图 2.

in vivo stability analysis of cell membrane NVs in PBS at pH 7.4 (A, n=3), biocompatibility analysis of cell membrane NVs with DC2.4 cells by CCK-8 assay (B, n=5), and cellular uptake analysis of NVs in 4T1 cells by fluorescence microscopy (C, scale bar: 20 nm)

细胞膜NVs在pH7.4时的体外稳定性分析（A），CCK8法检测细胞膜NVs与DC2.4细胞的生物相容性（B）和荧光显微镜检测NVs的乳腺癌细胞内吞情况（C，标尺：20 nm）

2.3. 细胞膜的生物相容性分析

结果显示，将细胞膜NVs与DC2.4细胞孵育48 h后，所有测试密度下，DC2.4细胞存活率均大于90%（图2B），表明加入囊泡未影响细胞增殖和存活，提示细胞膜来源NVs具有良好的生物相容性。

2.4. 细胞膜NVs的细胞内吞

结果如图2C所示，绿色荧光主要分布在4T1细胞的细胞核周围区域，提示NVs被乳腺癌成功摄取进入胞内并定位于核周区域。

2.5. NVs在荷瘤小鼠主要器官的生物分布

荧光定量分析结果显示（图3），正常细胞NVs组（HEK293T NVs）肿瘤、心脏以及肾脏组织的平均荧光强度低于肿瘤细胞NVs组（4T1 NVs）（P<0.05），其他主要组织器官无明显区别。结果表明乳腺癌细胞来源的NVs能够天然靶向体内肿瘤组织，显示出抗癌药递送载体的潜力，但在心脏与肾脏的分布较高，提示了体内药物递送要注意对心脏与肾脏的毒副作用。

图 3.

in vivo distribution of cell membrane NVs in mouse breast cancer xenograft (n=3)

细胞膜NVs在乳腺癌荷瘤小鼠的体内分布 (n=3)

^*P<0.05，^**P<0.01，^***P<0.001

3. 讨论

化学治疗作为临床上治疗乳腺癌的常用手段，其严重毒副作用和肿瘤耐药等问题限制了临床效果。药物递送载体能够增强化疗药的肿瘤组织蓄积，减少毒副作用，成为近年来抗肿瘤研究的热点课题。

肿瘤细胞膜因其同源粘连效应赋予的靶向作用成为药物递送载体的重要生物材料之一。基于肿瘤细胞膜材料的药物递送系统显示出较其他生物材料更优的靶向肿瘤递送效果，FANG等^[19]利用黑色素瘤B16F10细胞膜作为递送载体显示出较红细胞膜的递送载体更好的肿瘤靶向效果。ZHU等^[7]开发了肝癌细胞H22来源和小鼠鳞状细胞癌SCC7来源的细胞膜包覆纳米颗粒，结果H22细胞膜纳米载体和SCC7细胞膜纳米载体分别靶向运送至对应的肿瘤组织。细胞膜包覆同样增强了靶向肿瘤成像效果，RAO等^[22]将乳腺癌MDA-MB-435细胞膜包裹上转换纳米粒，显示出较游离纳米粒与红细胞膜包裹纳米粒更优的成像效果。上述结果都表明，细胞膜材料提高了靶向肿瘤的药物（荧光基团）递送能力。

本研究通过离心收获乳腺癌4T1细胞后加入裂解液，破碎细胞后通过匀浆器反复研磨，超速离心分离的4T1细胞膜，得到的细胞膜组分经含有1 μm、0.4 μm和0.2 μm聚碳酸酯滤膜脂质体挤出仪挤压后得到纳米尺寸的细胞膜NVs。并将细胞膜NVs重悬于PBS缓冲液（pH7.4），4 ℃连续7 d监测其粒径变化，通过检测细胞膜NVs在缓冲液中的尺寸变化来反应NVs的生物稳定性，同时利用CCK8法通过检测不同密度（5、10、20、50和100 mg·L⁻¹）NVs处理的树突细胞DC2.4的存活情况研究NVs的生物相容性。结果显示乳腺癌细胞膜NVs具有稳定性与良好的生物相容性。

接下来课题组研究了细胞膜NVs能否被肿瘤细胞内吞进入胞内。将DiO标记的NVs与乳腺癌细胞孵育4 h后，荧光显微镜下观察NVs的细胞内分布。结果显示NVs能够被肿瘤细胞快速内吞进入胞内，最后，课题组在小鼠乳腺癌肿瘤模型检测了肿瘤细胞来源的细胞膜NVs的体内分布情况。正常细胞HEK293T细胞的细胞膜NVs作为对照。为便于追踪囊泡的组织分布情况，制备了近红外荧光染料Cy5.5标记的乳腺癌细胞（4T1）来源NVs和正常细胞（HEK293T）来源的NVs。当肿瘤体积约为100 mm³时，小鼠经尾静脉分别注射300 μg Cy5.5标记的4T1来源和HEK293T来源的NVs，48 h后处死小鼠分离出主要器官和肿瘤组织，成像观察并分析。在荷瘤小鼠模型上显示出乳腺癌细胞NVs较正常细胞NVs更高的肿瘤组织蓄积，显示出肿瘤细胞膜NVs作为靶向肿瘤的递送系统的巨大潜力，为开发高效、安全的化疗药递送系统提供了实验依据。

本研究的局限性在于：我们制备的乳腺癌细胞膜纳米囊泡在心脏及肾脏组织具有较高的分布，如果用其担载药物进行肿瘤治疗可能会引发较高的心脏与肾脏毒性，这对纳米囊泡治疗肿瘤是非常不利的。因此，考虑到心脏与肾脏分布增多带来的潜在毒副作用，课题组计划从改变囊泡尺寸入手，设计制备不同尺寸的乳腺癌细胞膜囊泡（25、50、 75、 100 nm）对其体内分布进行对比研究，筛选在肿瘤蓄积增高且正常组织分布不升高的囊泡进行药物递送，在改善肿瘤治疗效果的同时兼顾安全性。

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利益冲突　所有作者均声明不存在利益冲突

Funding Statement

吉林省科技发展计划自然科学基金项目（No. 20180101213JC）、台州学院高层次人才科研启动项目（No. T20220101026）和北华大学研究生创新计划项目（北华研创合字【2021】026）资助