组织透明化技术的发展及其在神经退行性疾病中的应用

Abstract

现代组织透明化技术使细胞群的高分辨率成像和组织结构的三维重建成为可能，我们通过组织透明化技术可以获得更完整的脑部三维结构以及脑组织各个组分的空间联系。在过去的十年里，科学家们对组织透明化技术进行了大量的开发与改进，这些方法目前被广泛的运用在神经科学的研究中，使我们在复杂的神经网络中得到重要的信息。同时，组织透明化技术也会为神经退行性疾病的干细胞治疗和神经再生提供研究工具。在这篇综述中，我们主要回顾了一下目前主要的组织透明化技术的种类以及优缺点，并且总结了一下这些技术在神经退行性疾病研究中的应用以及独特的优势，此外我们还探讨了未来组织透明化技术的发展要求，配套设备的完善以及在干细胞治疗和再生医学中作为研究工具的潜力。

神经退行性疾病包括阿尔茨海默病（Alzheimer disease， AD）、帕金森病（Parkinson disease， PD）、亨廷顿病（Huntington disease， HD）、肌萎缩侧索硬化（amyotrophic lateral sclerosis， ALS）和额颞叶痴呆（frontotemporal dementia，FTD）等，这类疾病影响着全球数百万人，造成巨大的社会和经济负担。尽管全球科学家围绕神经退行性疾病进行了深入的研究，但是当前仍没有有效的疗法可以治愈或阻止其发展。因此，如何深入了解发病时脑部的结构，功能及其病理改变是发展有效的治疗策略所必需要解决的问题。

脑血管是一个解剖和组织学上非均匀三维交通网络，可以传输血细胞、营养物质、氧气、代谢废物、信号分子等^[1]。对于脑部神经网络及相关分子的分析可以提供对脑循环及脑血管结构的基本认识，也可以帮助理解多种神经退行性疾病的发生并对其进行诊断和治疗。因此，获得精细全面的脑部神经网络及相关分子的图谱具有重要的意义^[2]。

近年，科学家为了获得完整的全脑神经网络，开发了多种成像技术，其中包括双光子成像、转盘式共聚焦显微镜等^[3-4]。但是这些成像方法主要依赖于先进的成像仪器，而且脑部其他物质包括蛋白质，脂质等会产生一定的自发荧光，这使我们在成像中会看到比较高的背景噪声。因此，科学家利用组织工程的方法开发了多种脑部透明化的方法。通过化学试剂的处理，利用化学工程高分子支撑整个脑部的神经网络，同时利用试剂使脑部透明，实现大脑的透明化，获得全脑神经网络的高分辨成像和精确的脑部活动信息，使我们对大脑的二维局部区域的研究扩展到三维空间^[5]。透明化组织的主要目的是使生物标本透明，以便对感兴趣的标记细胞进行深度的三维可视化成像。特别是在研究AD的脑损伤和神经病理学的过程中，脑透明化方法可有效绘制正常的神经元连通图谱，有助于识别新生的细胞连接和β-淀粉样蛋白斑（Aβ）分布，这是AD中的主要病理学标志物^[6]。传统的方法中，透明化试剂会破坏细胞的形态特征^[7]，并且利用仅限于薄片^[8]。近年来，脑组织透明化方法主要关注于保持透明化后组织的结构完整性和荧光团（即荧光标记）的稳定性，大量新开发的透明化技术也可以通过减少化学处理步骤进行优化，从而大大加速了组织处理过程。此外，这些较新的技术正在增强对较厚（>500 μm）样本和人脑组织的分析能力，从而能够对神经元微结构进行空间分析^[9]。另外，透明化技术也有作为研究神经退行性疾病的干细胞治疗以及神经再生的工具的潜力。

1. 脑组织透明化方法

近年来，各种各样的组织透明化方法逐渐被开发使用，不仅可以进行多色成像还可以对复杂组织中的几个特定目标进行成像。除了对荧光蛋白进行成像，这些方法大多还允许对荧光团偶联的蛋白质、抗体、纳米颗粒和原位荧光RNA探针杂交（FISH）进行追踪成像^[10]。本文将详细比较几种组织透明化方法，最近发表的相关综述见文献^[11-12]。在讨论组织透明化对于神经病理学的研究的作用之前，我们将首先简要介绍目前主要的三类组织透明化方法包括疏水性组织透明化、亲水性组织透明化和水凝胶透明化的基本原理及主要优缺点（表1）。

表 1. Strengths and weaknesses of major tissue clearing techniques.

主要组织透明化技术优缺点

Method	Resolution	Permeabilization and delipidation	Preservation of fluorescence	Clearing time
BABB: Benzyl alcohol/benzyl benzoate; iDISCO: Immunolabeling-enabled three-dimensional imaging of solvent-cleared organs; vDISCO: Ultimatethree-dimensional imaging of solvent-cleared organs; Scale: Aqueous reagent that renders biological samples optically transparent; ScaleS: Sorbitol-based optical clearing; CUBIC: Clear, unobstructed brain/body imaging cocktails and computational analysis; SeeNet: 3D visualization and molecular characterization of the entire vascular network; CLARITY: Clear lipid-exchanged acrylamide-hybridized rigid imaging/immunostaining/in situhybridization-compatible tissue hydrogel; PARS: Perfusion-assisted agent release in situ；PACT: Passive clarity technique.
Hydrophobic-based tissue clearing
BABB	0.5-2 μm	EtOH (Ethanoal), DCM (Dichloromethane)	Hours	7 d
iDISCO	0.5-2 μm	Methanol, DCM (Dichloromethane)	Hours	7-14 d
vDISCO	1-2 μm	Tert-Butanol, THF (Tetrahydrofuran) 　DCM (Dichloromethane)/Triton-X100	Hours-days	5 d
Hydrophilic tissue clearing
Scale	0.5-2 μm	Urea C, Sorbitol C, DMSO (Dimethyl Sulfoxide)	Days-months	2-5 d
ScaleS	0.5-2 μm	Urea C, Sorbitol C, DMSO (Dimethyl Sulfoxide)	Days-months	2-5 d
CUBIC	0.5-2 μm	CUBIC-L (10% Triton-X100 C, 10% Aminoalcohol)	Days	7-14 d
SeeNet	(6.58±1.21) µm	SDC (Sodium deoxycholate)	>6 weeks	1 week
Hydrogel-based tissue clearing
CLARITY	0.5-2 μm	4% SDS (Sodium dodecylsulfate)	Temperature-dependent: 　preserved at 37 ℃	1-3 weeks
PARS	1-30 μm	8% SDS (Sodium dodecylsulfate)	3 months	1-4 d
PACT	0.5-12 μm	8% SDS (Sodium dodecylsulfate)	3 months	1-4 d

1.1. 疏水性组织透明化

1.1.1. 苯甲醇-苯甲酸苄酯（BABB）透明技术

脑组织透明化的初次问世可以追溯到2007年，研究者使用苯甲醇和苯甲酸芐酯（benzyl alcohol/benzyl benzoate, BABB）的混合物透明化小鼠大脑，开发了BABB透明技术，获得了老鼠脑神经网路^[13]，成功使小鼠脑部透明化，观察到了标记绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的神经元细胞，与之前的全脑成像采用的电子计算机断层扫描（computed tomography， CT）和核磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）的方法相比，首次实现了单细胞分辨率的全脑观察。通过脑部的透明化，研究者观察到了标记GFP的单个神经元和脑部的天然荧光体，同时重构了海马体中的树突细胞。但在技术方面还是存在很多的限制——需要成像媒介，透明化不完全，依然存在很高背景，而且此技术使用的透明媒介会使荧光标记迅速消失，因此不适合多次观察等。

1.1.2. iDISCO和vDISCO

全组织包埋免疫标记的三维成像技术（immunolabeling-enabled three-dimensional imaging of solvent-cleared organs，iDISCO）是一个简单，快速，可进行整体免疫标记的稳定、可扩展的廉价方法。iDISCO可以进行深层组织结构的体积成像^[14]。研究者认为GFP标记手段并不是非用不可的手段，通过整体的免疫标记替代表达的GFP在实现成像功能的同时可以进行更多的信息观察，而且通过整体的适应性调整改进了现有的免疫标记技术，实现了最佳信噪比和最大深度的脑部成像。研究者还调研了其他的透明化方法，筛选了更加稳定和快速的免疫标记抗体^[15]。这使得研究人员开发的iDISCO具有更好的免疫染色相容性。

虽然透明化方法可以对透明化后的整个啮齿动物尸体进行透明化分析，可以提供动物健康或疾病的整体生物信息，但对组织内部荧光蛋白信号的成像和量化仍然是一个挑战^[16]。在这里，研究者开发了基于纳米体的全身免疫标记技术（vDISCO），一种压力驱动的全身免疫标记技术，可以增强蛋白的荧光信号高达两个数量级。这使我们能够穿过完整的透明小鼠的高自发荧光组织包括骨骼、皮肤对细胞层面的细节进行成像和量化。通过这种方法研究者第一次看到了成年老鼠全身的神经元分布和连接，评估了全身中枢神经系统的损伤效应，还发现人体躯干的外周神经末梢变性。此外，vDISCO方法还可以显示出在中风时颅骨骨髓和脑膜之间的血管连接很短，同时脑膜会被免疫细胞填满^[17-21]。因此，vDISCO方法能够支持我们更全面的研究中枢神经系统和身体其他部分的神经联系。

1.2. 亲水性组织透明化

1.2.1. Scale 和 ScaleS

2011年提出的基于尿素的透明技术（Scale）可以在更短的时间完成组织的透明化，同时相比于其他试剂透明化的效果更好^[22]，可以有效的防止荧光的淬灭。这种试剂的使用综合考虑了多方面的因素，包括折射率、pH等，组织透明化效果更好，成像分辨率更高，更重要的是，这种试剂用于非脑组织的透明化效果亦佳。

2015年，在Scale的基础上，他们综合鸡尾酒透明（CUBIC）和PARS技术，考量了PH值和折射率的同时提高了透明化速度，减少了Scale技术处理过后产生的组织脆弱以及组织体积增大的问题，形成了优化版的Scale——ScaleS^[23]。在透明化的同时进行免疫组化染色，告别了染色后组织透明化不理想和透明化后染色时间太长的弊端。使用这种技术可以迅速透明化组织，最短数小时就可达到效果。ScaleS方法通过减少光在原位的散射来促进深层组织的生物成像。既保持了组织的完整性同时还满足多尺度高分辨率成像的要求，可以实现更精确的信号重建。相较于其他的透明化试剂含有可能破坏组织结构的化学成分，重复的解剖取材和荧光信号的不稳定，这种基于山梨醇的光学透明化方法，为免疫化学标记和三维信号呈现提供了稳定的组织结构和生物标志物活性。在AD模型中，ScaleS允许对老年和患病的大脑进行光学重建，包括绘制淀粉样斑块、神经元和小胶质细胞的三维网络图，并且可以通过连续荧光和电子显微镜对单个斑块进行多尺度跟踪。对从AD患者中提取的人类临床样本进行了z轴上淀粉样斑块的发病机制的分析。

1.2.2. CUBIC

2014年，日本科学家开发了一种简单、高效、可扩展的智能透明化系统和计算分析方法CUBIC，使单光子快速全脑成像成为可能^[24]。这种方法可以应用于不同荧光蛋白的全脑标记成像和成人脑组织免疫染色及其影像学研究。CUBIC从灵长类脑成像到亚细胞结构成像如轴突和树突棘都有很好的成像效果和分辨率^[25]。为了进行个体间的比较，研究者还开发全脑细胞核反义标记法和图像分析方法。CUBIC具有跟踪基因表达的能力，同时可以达到单细胞的分辨率，开发的智能分析系统，可以实现了对图像的优化分析以及信息提取。

1.2.3. SeeNet

2019年12月，研究者为了观察大脑中的血管连接，开发了脑血管网络3D成像技术（SeeNet），SeeNet采用灌注多功能交联剂，温控聚合混合水凝胶进行血管铸型的组织透明化，可以用于观察血管连接。SeeNet能够实现全脑可视化的单微血管水平的脑生物标记成像。此外，SeeNet揭示了迄今为止，尚未发现的连接大脑和海马血管的血管通路，因此可作为评价脑血管连通性的潜在工具。SeeNet速度快，成本低，而且很容易被野生型和转基因小鼠所接受。SeeNet将实现分子级别的大规模脑血管追踪成像，从而促进我们了解脑血管网络的物质运输和信息交流^[26]。

1.3. 水凝胶组织透明化

1.3.1. CLARITY

2013年，CHUNG课题组提出利用水凝胶作为骨架支撑整个脑部的神经网络，基于洗涤剂的脱脂作用（CLARITY）是一种能够将完整的生物组织转换成为纳米多孔水凝胶- 杂交形式（亲水聚合物的三维网络）的技术^[27]。CLARITY可以实现多次的免疫组化染色，不会互相影响，同时使用的凝胶剂不会影响荧光，具有更好的应用价值，甚至可应用于未切片的人体组织，为神经精神病学研究提供多种可能^[28-30]。但这种方法也存在一定的问题：首先这种方法需要近一个月的样本处理时间，步骤繁琐，耗时长；其次，方法复杂不简便，还需要昂贵的设备和试剂，极大的限制了其在生物医学及脑神经科学中的应用。

1.3.2. PARS和PACT

通过降低凝胶密度和交联程度可以提高探针的组织渗透率和穿透深度，但是凝胶结构的弱化会导致组织信息的丢失，为了均衡这两种需求，研究者开发了CLARITY的变体随机电转运（PACT）技术。PACT技术可以在不损害组织完整性的情况下加速分子标记，提高探针组织渗透率和穿透深度，避免了降低凝胶密度而导致的组织信息丢失。通过随机电传输转运的各种分子（例如抗体、染料和洗涤剂）可以随电泳驱动在组织结构中进行随机扩散，通过这种方式可以快速将它们传递到密集的组织凝胶中，在2～3 d内实现均匀透明化并实现小鼠器官的完整染色，相对于之前长达数周乃至数月的被动扩散方法极大的提高了透明化及染色速度^[31-32]。

为了使水凝胶透明化的方法进一步适用于全身透明化 。GRADINARU和他的同事开发了灌注辅助剂原位释放透明化技术（PARS），使啮齿动物身体透明，从而获得目标器官的中央神经和周围神经图^[33]。GRADINARU及其同事意识到，循环系统（血管）可以用来运送透明化试剂和探针，而不是依靠对于大型器官或整个生物体来说染色速度极慢的被动扩散。基于这种PARS方法可以用于骨骼的透明化，另外还可以在保留荧光标记的同时放大单细胞进行可视化研究。

2. 脑组织透明化技术在神经退行性疾病研究中的应用

每一种神经退行性疾病都会影响特定的大脑回路，但是不同的疾病也有几个共同的病理生理特征，包括因蛋白质聚集体的积累形成的神经病变等。AD的神经病理学有淀粉样蛋白聚集和高磷酸化的tau蛋白引起的细胞外淀粉样斑块沉积和神经内神经纤维缠结（NFT）；α-突触核蛋白内含物，称为路易小体，在PD患者中发现；突变型亨廷顿蛋白（mHTT）聚集体在HD患者中发现；TAR-DNA结合蛋白43（TDP-43）的聚集物在ALS和FTD大脑中发现^[34]。其中一些病变（如淀粉样斑块沉积、路易小体和TDP-43聚集体）存在于多种疾病中，表明不同的疾病可能有相同的分子机制。但是，不同的神经退行性疾病也有着其独特的神经回路特征^[35]，因此我们需要在包含多个脑区的全脑尺度上大尺度上对不同疾病的神经回路进行研究。

通过组织透明化方法，我们可以在大尺度上获得跨越多个脑区的完整神经网络，同时可以对透明化组织进行免疫染色以及生物标记，观察疾病相关的标志物的形成以及分布，实现了在大空间尺度上评估了多个大脑区域的神经病理学研究。最近的研究将组织透明化方法应用于评估这些神经病理学特征的人的大脑样本和转基因小鼠的大脑模型。HUANG和他的同事使用荧光硫磺素对Aβ斑块进行荧光染色。结合荧光标记的凝集素以及BABB组织透明化方法观察整个小鼠大脑^[35]，展示了敲除了孤儿受体的AD小鼠模型，淀粉样沉积斑块的数量和体积明显降低^[36]。HAMA等^[23]人利用他们的原始技术（即ScaleS），并创造AbScale-用于Aβ斑块的深层免疫标记。使用图像和定量分析，在AD小鼠模型中发现大部分Aβ斑块分布在大脑皮层中，而在其他脑区没有发现Aβ斑块分布。与其他组织透明化方法如：CUBIC, 3DISCO, 和PACT相比，ScaleS保存了大脑超微结构，可以使用电子显微镜检测后突触的密度和突触膜。最近的一项研究使用了改良的高尔基染色，结合硫黄素和CUBIC技术实现了对小鼠脑Aβ中的神经元形态的精细观察^[37]。

水凝胶组织透明化技术也被用于人类AD脑标本中Aβ和NFT的可视化研究^[38]，PD小鼠的黑质纹状体轴突碎片模型^[39]和PD疾病的人类路易小体的病理学大脑观察^[40]，可以进行依赖抗体标记检测的神经病理学观察和特定细胞类型的染色观察等多种场景，并且支持共焦显微镜对组织观察。可以展现Aβ的稀疏积累和多样的三维结构，包括聚集以及弥散的沉积物，而且发现tau蛋白的积累和神经炎的形成是息息相关的，这些都可以用共聚焦显微镜这种简便的成像方式来观察。iDISCO结合抗体标记以及刚果红染色在APPswe/PSEN1E9、3xTg-AD转基因小鼠和人脑中被用于揭示tau蛋白病理学以及Aβ沉积^[7]。研究人员还发展了基于细胞自动检测以及对图像中斑块统计量化的计算流水线，可以进一步反应脑部成分变化的特征，并可以快速量化大脑不同区域的斑块。iDISCO+^[41]，iDISCO的改进版，在内嗅皮质（EC）-tau转基因小鼠中成功的实现了全脑免疫标记和tau蛋白时空演变的三维成像的研究，不仅在内嗅皮质和海马区而且还有新皮质区，揭示了年龄依赖性tau蛋白病理特征，这在传统的组织学研究方法中是做不到的。

最近，通过保护者(SHIELD)组织透明化技术^[42]发现六月龄的5xFAD（AD）老鼠，通过听觉和视觉的刺激可以有效降低淀粉样沉积斑块的体积和数量（Aβ免疫标记方法），揭示了感官刺激可以作用于广泛的脑皮质区，这通过组织切片是无法做到的^[43]。

基于戊二醛^[44]的全脑免疫标记与组织透明化技术（SWITCH）也被用于5xFAD老鼠脑部淀粉样沉积的病理学过程的观察，而且可以发现Aβ在亚皮质区的聚集以及随着电生理情况改变带来的区域性聚集^[45]。最后，研究人员提出了一种新的渗透和透明化方法小胶束介导的人体器官透明化和标记技术（SHANEL），允许使用常规抗体，并用于检测淀粉样斑块在被刚果红衍生物甲氧基标记的厘米级别厚度的人脑^[46]。因此，目前我们可以通过组织透明化技术结合全脑免疫标提供了可以高分辨率的检测厚组织样本的能力，为研究人员提供了发现可能导致不同神经系统行为的分子机制的机会，为分子追踪提供可能。并且可以实现对多种神经退行性疾病的发生发展的机制进行研究，满足大空间多标记的观察与研究，实现了单个细胞可视化观察同时观察到细胞间的连接以及空间上的相互作用。总体而言，研究人员应该继续使用组织透明化技术来深入分析人类死后组织的病理变化，动物模型的老化，神经退行性行为和神经评估；这些研究可能产生对疾病发展以及病理特征的前所未有的新理解和治疗的潜在靶点。

3. 脑组织透明化技术在干细胞治疗以及再生医学中的潜力

干细胞治疗在AD的临床前模型中有着很好的应用前景，但仍需进一步的研究才能解决多方面的实际问题和理论问题。例如，我们仍然不确定将这些细胞输注到大脑的最佳方法。AD的复杂性，在疾病的发展过程中没有多个层次的病理变化，导致难以优化单一细胞类型的治疗，以扭转所有的认知和行为症状。这是潜在的细胞疗法面临的主要障碍之一。研究人员也认为，目前关于大脑神经再生的研究，包括他们进行的这项研究，都存在一个问题。这些研究全都是通过一些标志物来间接的检查神经发生，这可能无法可靠的证明有新的神经元生成^[47]。希望能有更为准确可靠的研究方法被开发出来。因此，通过组织透明化技术我们可以的到完整的大脑神经网络获得更全面的信息，帮助我们进行干细胞追踪、评价以及神经元变化的观察。

4. 总结与展望

对生物体脑部进行全细胞分析和神经网络观察是生物医学领域的主要挑战之一。组织透明技术结合光学成像和图像处理技术,能够将整个脑部快速透明并进行结构和细胞分析,为在生命科学中应用先进的光学技术提供了一个非常有前景的解决方案。组织透明化技术在过去几年的惊人发展但其仍然有很多改进的空间。最近的一些综述阐述了组织化学需要提供更优化的技术方案以及更加优良不会影响成像效果以及组织完整性的透明化试剂，需要开发更适合全脑成像以及透明化后观察的光学显微镜，得到更高分辨率和清晰度的图像，增强这种方法的适应性。同时在固定样品观测中应提高当前分辨率和可观测的生物分子的范围（即脂类、糖类等）、修饰（乙酰化、甲基化、苏木酰化等）和变化过程（核酸蛋白相互作用、物质合成、降解和聚合等）^[48]。另一方面，在生物微机械系统容积成像中的应用以及使用三维人脸重建模型(large scale facial model, LSFM)的生物微器件实现体外三维重构和亚细胞成像都需要高度可控的实验条件。获得图像之后需要发展强大的计算工具，实现对数据的分析，统计以及可视化处理，并且完善神经病理学分析软件与获得的数据图像分析有机结合，建立标准化的数据格式以及共享平台，提高数据处理速度以及大数据的分析，建立大脑功能以及细胞组学信息库^[49]。为了结合其他结构和功能成像技术〔如正电子发射断层摄影术（PET）、功能磁共振成像（fMRI）、多光子显微镜、光学超分辨率成像、冷冻电镜和冷冻电子断层摄影术等〕需要建立适应性的组织清理技术以及对其的扩展。如何实现完整的大空间尺度的成像用来评估大脑的相关功能，仍然是当代神经科学最具挑战性的任务之一^[50]。目前组织透明化技术及其扩展技术已经被广泛的应用于神经退行性疾病的研究，而且被神经科学领域广泛的认可。相信在不久的将来我们可以获得更多神经科学相关的信息，用于疾病的治疗以及神经活动的探索。

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利益冲突 　所有作者均声明不存在利益冲突

Funding Statement

国家自然科学基金专项项目（No. 82050005）、中国科学院重大科技基础设施开放研究项目（No. 21775157）和上海市科委仪器项目（No. 19142202400）资助