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. 2021 May 20;52(3):402–408. [Article in Chinese] doi: 10.12182/20210560204

m6A结合蛋白YTHDC2对人骨髓间充质干细胞分化的影响

Role of m6A Reader YTHDC2 in Differentiation of Human Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells

Jun-ru WEN 1, Zhen TAN 1, Wei-min LIN 1, Qi-wen LI 1, Quan YUAN 1,*
PMCID: PMC10409204  PMID: 34018357

Abstract

目的

研究N6-腺苷酸甲基化（N6-methyladenosine， m6A）结合蛋白YTH结构域蛋白2（YTH domain-containing protein 2，YTHDC2）对人骨髓间充质干细胞（human bone marrow mesenchymal stem cells，hBMSCs）成骨及成脂分化的调控。

方法

通过小干扰RNA（siRNA）体外对hBMSCs进行YTHDC2基因表达的敲降，并进行成骨及成脂诱导分化，以研究YTHDC2敲降后hBMSCs分化表型的改变。利用碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）染色和茜素红染色鉴定成骨活性和钙结节形成，尼罗红染色检测脂滴形成。利用荧光定量PCR（RT-qPCR）检测成骨和成脂相关基因的表达。通过RNA测序（RNA-seq）分析YTHDC2敲降后的转录组变化，探索YTHDC2调控hBMSCs分化的潜在机制。

结果

敲降YTHDC2促进hBMSCs成骨分化中的ALP活性及钙结节形成，并显著上调成骨相关基因表达；同时降低了hBMSCs在成脂分化中的脂滴形成能力，并显著下调成脂相关基因表达。RNA-seq的基因富集分析显示YTHDC2与核糖体功能及mRNA翻译有关信号通路显著相关。

结论

敲降YTHDC2可促进hBMSCs成骨分化，抑制成脂分化。敲降YTHDC2可能造成核糖体功能改变。

Keywords: YTH结构域蛋白2, 人骨髓间充质干细胞, N6-腺苷酸甲基化 , 成骨分化, 成脂分化

骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）是一种在骨髓中广泛存在的干细胞，它可以多向分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞或造血支持基质[1-2]。BMSCs在成骨和成脂分化方向的命运决定影响着骨骼健康[3]。N6-腺苷酸甲基化（N6-methyladenosine，m6A）修饰是真核生物体内mRNA上最广泛的一种表观遗传修饰。该修饰表现为腺嘌呤六号N原子上的甲基化[4-6]。近年来，研究揭示了m6A修饰在哺乳动物细胞中的一系列生理作用，包括调控mRNA剪切、出核、成熟、翻译、肿瘤代谢以及细胞增殖分化等[7]。m6A修饰需要多种蛋白复合体的参与，包括m6A“写码器”甲基转移酶、“消码器”去甲基化酶和“读码器”m6A结合蛋白。其中，甲基转移酶介导在mRNA上添加m6A修饰，去甲基化酶介导m6A修饰的清除，m6A结合蛋白可以特异性识别m6A修饰[8]。本课题组前期研究发现了m6A甲基转移酶3（methyltransferase-like 3，METTL3）介导的m6A修饰对BMSCs分化的调控[9]。而作为m6A代谢中的重要一环，目前缺乏m6A结合蛋白调控BMSCs分化的研究[10]。

m6A结合蛋白包括YTH N6甲基腺苷RNA结合蛋白1、2、3（YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3），YTH结构域蛋白（YTH domain-containing protein）1、2（YTHDC1、YTHDC2）。其中，YTHDC2是YTH家族中最新发现的蛋白。YTHDC2广泛分布于真核生物胞质内，可通过YTH序列特异性识别并结合m6A，从而促进mRNA的翻译并影响mRNA的稳定性[11]。研究表明，YTHDC2对维持减数分裂及生殖细胞的产生至关重要[12-14]，并参与多种疾病的发生发展，包括：自闭症、胰腺癌、结肠腺癌、肝癌、肺腺癌和头颈部鳞状细胞癌[15-20]。而YTHDC2如何调控BMSCs的命运决定尚不清楚。本研究的目的是探究YTHDC2对人骨髓间充质干细胞（hBMSCs）成骨和成脂分化的影响及其作用机制。

1. 材料和方法

1.1. 细胞培养

hBMSCs原代细胞系（ATCC® PCS-500-012）购自American Type Culture Collection。hBMSCs具有多向分化潜能。我们将hBMSCs细胞悬浮液转移至培养皿中，采用α-MEM（Gibco）培养基进行培养。培养基中添加10%胎牛血清（Gibco），100 U/mL青霉素（Gibco）及100 µg/mL链霉素（Gibco）。培养条件为37 ℃、体积分数5%CO2，每2 d更换1次培养基，每6 d进行1次传代。每次传代采用胰酶重悬细胞，按1×104/cm2的密度均匀铺在培养皿中。hBMSCs在传代至第3、4代时增殖活性较强，细胞形态为纺锤状，因此本研究采用第4代hBMSCs进行后续实验。

1.2. siRNA转染试验

使用si-YTHDC2（Santa Cruz Biotechnology，sc-91804）及标准对照si-CTRL（Sangon Biotech）对hBMSCs进行转染。转染试剂为50 nmol/L Lipofectamine™ RNAiMAX（Invitrogen）溶于无血清Opti-MEM®I Medium（Invitrogen）。hBMSCs在无抗生素培养基内培养24 h后，加入含si-YTHDC2或si-CTRL的转染试剂，在37 ℃、体积分数5%CO2下孵育12 h换液。转染后48 h，使用YTHDC2成品引物（Santa Cruz Biotechnology，sc-91804-PR）通过荧光定量PCR（RT-qPCR）检测YTHDC2表达（具体方法见1.5），并计算si-YTHDC2转染hBMSCs的敲降效率。

1.3. hBMSCs成骨分化诱导实验

经siRNA转染的hBMSCs在成骨诱导液中培养进行成骨诱导分化。成骨诱导液以α-MEM培养基为溶剂，含100 nmol/L地塞米松（Sigma）、50 µg/mL抗坏血酸（Sigma）、5 mmol/L β-甘油磷酸（Sigma）、10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 µg/mL链霉素。碱性磷酸酶（ALP）活性是早期成骨的重要标志[21]。细胞在24孔板中成骨诱导7 d后进行ALP染色：PBS洗涤孔板3次，多聚甲醛固定20 min，再用ALP染液（Beyotime Biotechnology）避光孵育20 min使其显色，去除染液后PBS洗涤孔板3次，采集图片。hBMSCs成骨诱导3 、7 d后进行ALP定量：细胞经胰酶消化后使用超声裂解，离心后吸取上清液，采用BCA蛋白检测试剂盒（Beyotime Biotechnology）通过562 nm处吸光度值测定样本蛋白浓度。按ALP检测试剂盒（Beyotime Biotechnology）说明书操作，测定样本520 nm处吸光度值。ALP=（样品吸光度值−空白孔吸光度值）/（标准孔吸光度值−空白孔吸光度值）×酶标准品浓度/样本蛋白浓度。上式中，ALP单位为U/g protein，酶标准品浓度为0.02 mg/mL，样本蛋白浓度单位为g protein/mL。

茜素红染色检测成骨中后期细胞沉积钙盐并形成钙结节的能力[22]。hBMSCs在24孔板中成骨诱导14 d后进行茜素红染色：PBS洗涤3次，多聚甲醛固定20 min，再使用茜素红染液（Solarbio Technology）避光孵育30 min使其显色。显色后用10%氯化十六烷基吡啶处理15 min，在562 nm处测定吸光度，通过对比钙浓度标准曲线进行定量测定。

hBMSCs在成骨诱导3、5、7 d后进行成骨相关基因的RT-qPCR检测，包括distal-less homeobox 5（DLX5）、RUNX family transcription factor 2（RUNX2）、Sp7 transcription factor（SP7）、collagen type Ⅰ alpha 1（COL1A1）、bone gamma-carboxyglutamate protein（BGLAP）和secreted phosphoprotein 1（SPP1）。具体方法见后文1.5。

1.4. hBMSCs成脂分化诱导实验

将hBMSCs转染后在成脂诱导液中进行成脂诱导分化。成脂诱导液以DMEM高糖培养基为溶剂，含1 mmol/L地塞米松、4 mg/mL胰岛素（Sigma）、50 mmol/L3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）、10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 µg/mL链霉素。尼罗红染色：细胞在96孔板中成脂诱导28 d后，PBS洗涤孔板3次，多聚甲醛固定20 min，再使用尼罗红荧光染料（Genmed）避光孵育10 min后显色，PBS洗涤3次，于荧光显微镜下观察脂滴，对成脂表型进行鉴定。

hBMSCs在成脂诱导3、5、7 d后进行成脂相关基因的RT-qPCR检测，包括CCAAT enhancer binding protein alpha（CEBPα）、perilipin 1（PLIN1）和lipoprotein lipase（LPL）。具体方法见1.5。

1.5. RT-qPCR检测成骨、成脂分化相关基因表达

使用TRIzol试剂（Invitrogen）提取总RNA，使用PrimeScript RT试剂盒（TaKaRa）和gDNA eraser试剂盒（TaKaRa）制备cDNA。RT-qPCR在SYBR Premix Ex TaqⅡ（TaKaRa）反应体系及Bio-Rad CFX96 real-time PCR仪中进行。扩增反应条件为：95 ℃下30 s，1次循环；95 ℃下变性5 s，60 ℃下退火31 s，40个循环。成骨相关基因引物序列见表1，使用GAPDH作为内参；成脂相关基因序列见表2，使用36B4作为内参。使用LightCycler 96软件（Roche）统计Ct值，以2−ΔΔCt表示基因表达量。

表 1. Primer sequences of hBMSCs osteogenic differentiation related genes.

hBMSCs成骨分化相关基因引物序列

Gene Primer sequence (5′-3′)
　 DLX5: Distal-less homeobox 5; RUNX2: RUNX family transcription factor 2; SP7: Sp7 transcription factor; COL1A1: Collagen type Ⅰ alpha 1; BGLAP: Bone gamma-carboxyglutamate protein; SPP1: Secreted phosphoprotein 1; GAPDH: Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase.
DLX5 F: TTCCAAGCTCCGTTCCAGAC
R: GAATCGGTAGCTGAAGACTCG
RUNX2 F: TGGTTACTGTCATGGCGGGTA
R: TCTCAGATCGTTGAACCTTGCTA
SP7 F: CCTCTGCGGGACTCAACAAC
R: AGCCCATTAGTGCTTGTAAAGG
COL1A1 F: GTGCGATGACGTGATCTGTGA
R: CGGTGGTTTCTTGGTCGGT
BGLAP F: CACTCCTCGCCCTATTGGC
R: CCCTCCTGCTTGGACACAAAG
SPP1 F: GCCGCTGTAACCTCTTCGG
R: GTCTTCGGCCAATCTGGCTTT
GAPDH F: ACTGAGGACCAGGTTGTC
R: TGCTGTAGCCGTATTCATTG
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表 2. Primer sequences of hBMSCs adipogenic differentiation related genes.

hBMSCs成脂分化相关基因引物序列

Gene Primer sequence (5′-3′)
　 CEBPα: CCAAT enhancer binding protein alpha; PLIN1: Perilipin 1; LPL: Lipoprotein lipase; 36B4: Ribosomal protein lateral stalk subunit P0.
CEBPα F: TTCACATTGCACAAGGCACT
R: GAGGGACCGGAGTTATGACA
PLIN1 F: TGTGCAATGCCTATGAGAAGG
R: AGGGCGGGGATCTTTTCCT
LPL F: CCCTCTCTTACAAGCCCATCA
R: GAGCCAGTCTGGTAGTACATCA
36B4 F: TGAGATTCGGGATATGCTGTTGG
R: CGGGTCCTAGACCAGTGTTCT
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1.6. RNA测序（RNA-seq）检验YTHDC2敲降在转录组水平的变化

为了进一步探究YTHDC2影响hBMSCs成骨分化的机制，我们采用YTHDC2敲降的细胞进行了RNA-seq，以检验YTHDC2敲降在转录组水平的变化。siRNA转染48 h后，使用TRIzol试剂提取总RNA，si-CTRL与si-YTHDC2各3个生物学重复。使用Illumina TrueSeq mRNA sample preparation kit制备样本，并在Illumina HiSeq 3000 machine上进行测序。使用STAR_2.6.0a将其映射到人类基因组（UCSChg19）并使用DESeq2软件（1.16.1）进行两个比较组合之间的差异性表达分析，adjusted P value（padj）小于0.05和log2fold change绝对值大于0.5的基因为差异基因。绘制基因差异性表达分析结果图（火山图）（Metascape网站在线工具）。GO分析通过clusterProfiler（3.4.4）软件进行，利用GO数据库实现差异表达基因的功能富集分析。KEGG分析使用clusterProfiler（3.4.4）软件进行，利用KEGG数据库实现差异表达基因的通路富集分析。

1.7. 统计学方法

所有数据均以 Inline graphic 表示。通过非配对双侧t检验进行统计效能检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2. 结果

2.1. YTHDC2敲降后成骨分化能力增强

经RT-qPCR验证，si-YTHDC2转染hBMSCs的敲降效率为62%，满足后续实验要求。ALP染色结果显示，成骨诱导第7天，YTHDC2敲降造成hBMSCs的ALP活性显著升高，早期成骨分化活性增强（图1A）。茜素红染色结果显示，成骨诱导14 d后，YTHDC2敲降导致hBMSCs形成钙结节的能力增强（图1B）。成骨诱导第3、5、7天，RT-qPCR结果显示：si-YTHDC2组的DLX5、RUNX2、SP7、COL1A1、BGLAP、SPP1表达均升高（图2）。证明YTHDC2敲降后hBMSCs成骨分化能力显著增强。

图 1.

图 1

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hBMSCs alkaline phosphatase staining and alizarin red staining results after siRNA transfection

siRNA转染后，hBMSCs的碱性磷酸酶染色及茜素红染色结果

A: Alkaline phosphatase staining; B: Alizarin red staining. n=3. ***P<0.001, vs. si-CTRL group at the same time point.

图 2.

图 2

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After siRNA transfection, the expression of osteogenic differentiation related genes at day 3, 5 and 7 of osteogenesis induction

siRNA转染后，hBMSCs成骨诱导3、5、7 d，成骨分化相关基因表达趋势

n=3. *P<0.05, **P<0.01,***P<0.001, vs. si-CTRL group at the same time piont.

2.2. YTHDC2敲降后成脂分化诱导能力减弱

成脂诱导28 d后，尼罗红染色显示，在同一细胞密度下，si-YTHDC2组形成的脂滴数量和体积都更小（图3）。RT-qPCR结果显示，成脂诱导第3、5、7天，YTHDC2敲降组成脂相关基因CEBPα、PLIN1、LPL的表达总体呈现下降趋势（图4），证明YTHDC2敲降后成脂分化能力显著减弱。

图 3.

图 3

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Nile red staining results of hBMSCs after siRNA transfection (scale bar 25 μm)

siRNA转染后hBMSCs尼罗红染色结果（标尺25 μm）

图 4.

图 4

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After siRNA transfection, the expression of hBMSCs adipogenic differentiation-related genes at day 3, 5 and 7 of adipogenesis induction

siRNA转染后hBMSCs第3、5、7 d，成脂分化相关基因表达趋势

n=3. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, vs. si-CTRL group at the same time piont.

2.3. YTHDC2敲降后基因转录组的改变

si-YTHDC2及si-CTRL转染后的RNA-seq的结果如下。基因差异性表达分析结果（图5A）显示，YTHDC2敲降后，162个基因表达上调，230个基因表达下调。GO功能富集分析发现，与YTHDC2相关的生物学功能中，相关性最强的为核糖体，其次为甲型流感、麻疹、单纯疱疹病毒感染，NOD样受体信号通路（图5B）。KEGG通路富集分析显示，7条通路与mRNA翻译相关，其中包括：核糖体组成结构、核糖体功能、核糖体亚基、翻译起始、病毒基因表达、病毒转录和核转录mRNA的分解（图5C）。

图 5.

图 5

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RNA-seq results after siRNA transfection

siRNA转染后RNA-seq结果

A: Valcano plot; B: GO analysis results; C: KEGG analysis results. padj: Adjusted P value.

3. 讨论

m6A修饰广泛参与机体内骨形成过程的调节，一系列研究证明了m6A调节蛋白在骨形成以及BMSCs分化中具有重要调控作用。研究表明，m6A甲基转移酶METTL3可通过m6A修饰调节NF-κB信号通路，从而抑制骨质疏松[23]。这一过程可被m6A去甲基化酶AlkB同源蛋白5（AlkB homolog 5，ALKBH5）逆转[24]。METTL3的表达水平还可以调控BMSCs的成骨分化[9]。同样，对m6A与BMSCs成脂分化的研究显示，m6A甲基转移酶METTL3可以通过m6A-YTHDF2途径抑制BMSCs成脂向分化[25]。ALKBH5则可以抑制成骨并促使BMSCs分化为脂肪细胞[26]。这些研究结果表明，m6A修饰可调节骨形成过程并广泛参与BMSCs成骨，成脂分化的调控。而本实验通过对m6A结合蛋白YTHDC2在转录水平的敲降，证明了YTHDC2也是调节骨髓间充质干细胞分化的重要蛋白。不仅发现了YTHDC2全新的生物学功能，还进一步扩展了m6A修饰影响BMSCs分化的作用机制。

YTHDC2是调节核糖体功能及mRNA翻译的重要蛋白。一方面，YTHDC2可以与核糖体结合促进翻译起始，提高翻译效率[21,27-28]。另一方面，它具有3'→5'RNA解旋酶活性，并可与核酸外切酶5'-3' exoribonuclease 1（XRN1）相互作用，介导mRNA的降解，降低胞内mRNA丰度[29-32]。GO分析及KEGG分析结果均显示，核糖体相关通路出现了显著改变。这与已阐明的YTHDC2生物学功能相一致。这些信息提示我们，YTHDC2敲降可能造成核糖体功能发生显著改变。核糖体是mRNA翻译过程中重要的组分，协调与介导mRNA翻译起始、延长与终止。核糖体功能的改变可能广泛地影响一系列细胞的生理功能。因而，在hBMSCs的分化中， YTHDC2 有可能通过改变核糖体功能进而影响mRNA的翻译，以此来调控成骨与成脂分化。

本研究首次明确了YTHDC2在hBMSCs分化中具有重要的调控作用，即YTHDC2缺失会促进hBMSCs成骨分化，抑制其成脂分化。通过RNA-seq，本研究进一步探索了YTHDC2敲降对hBMSCs转录组的影响，提示我们YTHDC2可能通过核糖体相关通路发挥作用。本研究局限性在于并未进行体内实验，因此课题组将在后续研究中进行动物模型的构建，并进一步验证具体的分子生物学机制。

* * *

利益冲突 　所有作者均声明不存在利益冲突

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