Abstract
目的
探索口腔扁平苔藓（oral lichen planus, OLP）患者口腔细菌组、真菌组与健康对照（healthy, H）之间的差异，细菌组-真菌组的共现模式以及OLP患者口腔细菌组与宿主免疫之间的联系。
方法
收取临床OLP患者（n=35）和健康志愿者（n=18）的唾液，提取微生物组DNA进行细菌16S rRNA测序和真菌内转录间隔区2（internal transcribed spacer 2, ITS2）测序，生物信息学分析数据。检测唾液中炎症因子白细胞介素（interleukin, IL）-17和IL-23的质量浓度，并分析其与细菌的相关性。
结果
OLP患者唾液细菌组和真菌组与H组整体群落结构差异不明显。唾液细菌组中普雷沃菌属（Prevotella）和Solobacterium在OLP组有显著增高的丰度（P<0.05），唾液真菌组中念珠菌属（Candida）和曲霉菌属（Aspergillus）的相对丰度显著增加（P<0.05）。唾液细菌-真菌组的共现模式表明，虽然上述差异菌属之间无相关，但曲霉菌属与细菌属的相互关系在H组和OLP组中发生了转变，即OLP组的共现关系减少。唾液IL-17水平在OLP组中明显升高，IL-17及临床评分均与卟啉单胞菌属（Porphyromonas）丰度显著相关。
结论
口腔普雷沃菌属、Solobacterium、念珠菌属和曲霉菌属丰度增加与OLP发病相关，群落共现关系的改变和宿主免疫的变化可能参与OLP致病机制。
Keywords: OLP, 微生物测序, 细菌-真菌共现模式, 炎症因子
Abstract
Objective
To explore the differences of oral mycobiome and bacteriome between the healthy controls (H) and oral lichen planus (OLP) patients, and the co-occurrence patterns of the salivary mycobiome and bacteriome and the association with host immunity.
Methods
Saliva samples were collected from clinical OLP patients (n=35) and healthy volunteers (n=18). Microbiome DNA was extracted for bacterial 16S rRNA genes sequencing and fungal internal transcribed spacer 2 (ITS2) sequencing. Bioinformatics analysis was performed on the data.The levels of IL-17 and IL-23, two pro-inflammatory cytokines, in the saliva were examined, and their correlation with the bacteria was analyzed.
Results
There was no significant difference in the overall community structure of the mycobiome and the bacteriome between OLP patients and healthy controls. The abundance of Prevotellaand Solobacterium in the saliva bacteriome was significantly increased in the OLP group (P<0.05), and the relative abundance ofCandidaand Aspergillusin the saliva mycobiome was also significantly increased (P<0.05). The co-occurrence pattern of the salivary mycobiome and bacteriome showed that the aforementioned difference was not related. However, the correlation betweenAspergillusand bacteria was altered in the H group and the OLP group, and co-occurrence was reduced in the latter group. The level of IL-17 in the saliva was significantly increased in the OLP group. IL-17 and clinical scores were significantly correlated with the abundance of Porphyromonas.
Conclusion
The increased abundance of Prevotella, Solobacterium, Candida, and Aspergillus was associated with the pathogenesis of OLP, and the changes of the microbiome co-occurrence relationship and host immunity may be involved in the pathogenesis of OLP.
Keywords: OLP, Microbiotasequencing, Mycobiome-bacteriome co-occurrence patterns, Inflammatory cytokines
口腔扁平苔藓（oral lichen planus, OLP）是一种常见的累及口腔黏膜或皮肤的慢性炎症性疾病，发病率为0.1%～4%，其中0.5%～2%的OLP病变可能发展为口腔鳞状细胞癌[1]。研究发现口腔微生物群落可能参与了口腔黏膜病的发病机制[2]，如某些特定细菌种属的富集或减少[3]，此外，口腔念珠菌已被报道与OLP发病相关，并可在37%～50%的患者口腔中检测到[4]。但是有关OLP患者全面的唾液真菌组结构及组成尚未见详细报道，真菌组-细菌组的相互关系也不清楚。最近，研究人员在OLP病变中发现了大量的Th17细胞，而Th17细胞分泌的细胞因子白细胞介素（interleukin, IL）-17和IL-23是参与防御病原微生物的重要成分[5]。而共现微生物组成与炎症因子差异在OLP中是否发挥了重要作用还有待进一步探讨。因此，我们将研究[6-7]中的网纹组和糜烂组OLP（数据编号：SRP067603）数据合并，深入分析了其唾液微生物组的多样性和结构差异，以及细菌组-真菌组共现模式（co-occurrence patterns），并探讨了OLP患者口腔细菌组与宿主免疫之间的联系。
1. 材料和方法
1.1. 研究对象
本研究经四川大学华西口腔医院伦理委员会批准（批准号WCHSIRB-ST-2015-070）。根据世界卫生组织的临床分类和OLP的定义，经过仔细的临床检查和诊断，有35例OLP患者（OLP组）入选。并招募18名年龄和性别匹配的健康志愿者作为健康对照（H组）。H组年龄（41.92±0.83）岁，OLP组年龄（45.55±0.27）岁，差异无统计学意义。采用与OLP病变部位、面积和存在程度相一致的半定量评分系统来评估OLP的临床评分和严重程度。本次招募人员的纳入标准为：由有经验的牙科医生仔细检查，无明显的牙周炎症或可见的龋病；排除标准为：①采样前两个月接受了口服OLP治疗药物或服用处方药物；②有症状或系统感染的迹象。
1.2. 样本收集
受试者在样本采集前1 h均未进食。在8:00–11:00从每位受试者口腔收集约5 mL未受刺激的唾液。所有样品置于冰上，4 h内保存于−80 ℃备用。
1.3. DNA提取
取1 mL唾液，按Qiagen QIAamp® DNA Mini Kit操作步骤提取基因组DNA。唾液冰上解冻后，5 000×g离心10 min，弃上清。在沉淀中各加入600 µL山梨醇缓冲液（1 mol/L山梨醇，100 mmol/L EDTA和14 mmol/L ß-巯基乙醇）重悬，再加入200 μL裂解酶混匀后于30 ℃裂解30 min。加入蛋白酶K，56 ℃孵育1.5 h。DNA与过滤柱结合，用PW1和PW2清洗。最后用200 µL的洗脱缓冲液从过滤柱中洗脱结合的DNA。采用NanoDrop1000测定各样本DNA浓度以及A260/A280和A260/A230的吸光度比，取A260/A280>1.7和A260/A230>1.8的样本用于后续实验。DNA终浓度用Pico-Green kit测定。DNA样本于−20 ℃储存。
1.4. Illumina测序
使用引物（由俄克拉何马大学环境基因组学研究所提供）F515（5´-GTGCCAGCMGCCGCGG-3´）和R806（3′-TAATCTWTGGGVHCATCAG-5′）对16S rRNA genes V4区进行扩增，扩增产物胶回收纯化。按照Miseq500 cycles 250×2 V2试剂盒准备样本库，进行混合文库建立、混合文库内小片段去除、文库质量控制及文库摩尔浓度计算。
使用引物gITS7F （GTGARTCATCGARTCTTTG）和ITS4R（TCCTCCGCTTATTGATATGC）从真菌DNA中扩增出转录间隔区2（internal transcribed spacer 2, ITS2）。真菌测序采用两步分阶段扩增子测序法（phasing amplicon sequencing approach, PAS），以避免长标签PCR引物带来的扩增偏差。500-cycle v2 MiSeq试剂盒（Illumina, San Diego, CA, USA）用作样本库准备。测序在Illumina MiSeq平台完成。
1.5. 数据预处理、操作分类单元（operational taxonomic units, OTU）聚类和系统分类
细菌组特异性标签追溯至来源样本后，对测得序列进行如下处理：①去除低质量序列：为了降低随机测序对研究结果的影响，本研究去除了与引物不匹配、无特异性标签、序列长度短于200 bp及含有模糊碱基的序列。②聚类及分类分析：在相似性≥97%的条件下进行OTU聚类，使用核糖体数据库项目（ribosomal database project, RDP）Infernal Aligner将序列与数据比对确定遗传分类学信息，并根据序列数量计算分类学水平上物种的相对丰度。真菌组只提取标签完全匹配的读长（reads）用于进一步的数据分析。使用Btrim52程序提取原始读长，保留平均质量分数大于30的读长。利用“PEAR”程序对序列进行拼接，UPARSE流程用于进一步的质量控制和OTU聚类。拼接后的读长采用最大预期误差阈值为0.5、长度截止阈值为200的条件进行质量控制，随机抽样最低值为2 227个读长进行丰度分析。
1.6. 酶联免疫吸附实验
根据试剂盒（Cloud-Clone, Houston, TX, USA）操作步骤测定唾液样本中IL-17和IL-23的质量浓度。
1.7. 统计学方法
使用IBM SPAA Statistics 25软件进行统计分析，使用GraphPad Prism 9.0作图。数据预处理后的测序数据采用以下统计方法进一步分析。首先，进行群落结构不相似性分析，采用多响应置换过程（multi-response permutation procedure, MRPP）、相似性分析程序（analysis of similarity, ANOSIM）和非参数多元方差分析（nonparametric multivariate analysis of variance, adonis）进行分析。其次，细菌和真菌群落α多样性采用Chao1物种丰富度、Shannon和Simpson多样性指数进行评价，用Wilcoxon检验进行比较。再用t检验分析H组和OLP组之间分类群相对丰度、IL-17和IL-23质量浓度的差异。然后，筛选H组（大于8个样本）和OLP组（大于17个样本）出现的细菌和真菌菌属做Pearson相关分析。细菌、临床评分和IL-17/IL-23质量浓度之间的相关性用Pearson相关检验进行评估。P<0.05为差异有统计学意义。进行微生物物种差异性分析时，P<0.1可以认为有80%的可信度，两个物种是有差异的[8]。
2. 结果
2.1. 唾液测序序列信息
利用Illumina MiSeq测序平台，唾液细菌组共获得2 608 077条平均长度为253 bp的高质量序列，平均每个样本有49 209条序列。在相似性≥97%的条件下进行OTU聚类后共检测到8 717个OTU，其中4 006个为单序列（singletons，仅在一个样本中检测到）予以去除。真菌组共获得平均长度324 bp的序列712 295条，平均每个样本13 439条。在相似性≥97%条件下聚类为4 564 OTU，其中有1 990个为单序列。RDP分类结果显示，4 563个OTU是真菌，其中只有1个OTU有2条序列在20%的可信度下被鉴定为原虫。
2.2. OLP唾液微生物结构和α多样性分析
用三种非参数统计方法MRPP、adonis和ANOSIM对整个微生物群落结构进行比较，显示在细菌组和真菌组中，H组和OLP组之间菌群结构无显著差异（P>0.05）。对唾液微生物群落进行α多样性分析，发现OLP组的细菌群落丰富度与H组相当（图1A），多样性和均匀度略高于H组（图1B、1C），真菌群落丰富度、多样性和均匀度略低于H组（图1D～1F），但差异均无统计学意义。
图 1.
The α diversity of salivary microbiome in OLP patients
口腔扁平苔藓患者唾液微生物α多样性分析
A-C: Salivary bacteriome; D-F: Salivary mycobiome. H group (n=18), OLP group (n=35).
2.3. OLP唾液微生物组组成
细菌组共鉴定出13个门和418个属。对唾液样本细菌组分析发现，丰度最高的前5种菌属分别是：H组，链球菌属（Streptococcus）、奈瑟菌属（Neisseria）、嗜血杆菌属（Haemophilus）、罗斯菌属（Rothia）和普雷沃菌属（Prevotella）；OLP组，链球菌属、奈瑟菌属、嗜血杆菌属、普雷沃菌属和罗斯菌属。进一步对相对丰度排名前20的菌属进行分析发现，OLP组中的普雷沃菌属（P<0.1）和Solobacterium（P<0.05）相较于H组有增高的丰度。见图2A。
图 2.
Difference in the relative abundance of salivary microbiome at the genus level in OLP patients（Top 20）
OLP患者唾液微生物属的相对丰度差异（Top 20）
A: Salivary bacteriome; B: Salivary mycobiome. *P<0.1, **P<0.05.
真菌组共鉴定出5个门和280个属。其中，丰度最高的前5种真菌属分别是：H组为念珠菌属（Candida）、酵母菌属（Saccharomyces）、未鉴定的子囊菌门中的属（Ascomycota_unidentified_1_1）、未鉴定的酵母菌目中的属（Saccharomycetales_unidentified_1）和被孢霉属（Mortierella），OLP组为念珠菌属、酵母菌属、Ascomycota_unidentified_1_1、曲霉菌属（Aspergillus）和Davidiella。在真菌群落丰度排名前20的属水平差异统计中，OLP组念珠菌属和曲霉菌属的相对丰度较H组显著增加（P<0.05）。见图2B。
2.4. 细菌-真菌的相互作用
在细菌-真菌的共现模式分析中，我们选取了真菌丰度前12和细菌丰度前15的属进行分析，结果如图3所示。分析发现：①H组和OLP组之间有差异的2种细菌属（普雷沃菌属和Solobacterium）和2种真菌属（念珠菌属和曲霉菌属）之间没有相关性；②念珠菌属与Top15细菌属之间无相关，而曲霉菌属在H组与链球菌属（Streptococcus）、孪生球菌属（Gemella）呈正相关，但在OLP组中转变为与消化链球菌属（Peptostreptocuccus）呈正相关；③OLP组中细菌-真菌显著相关关系共有9组（1组负相关），但在H组中有11组。
图 3.
The co-occurrence patterns of the salivary mycobiome–bacteriome. Mycobiome was shown at the top, and bacteriome on the left; red squares showed positive relationship, while blue squares showed negative relation
唾液样本中真菌组和细菌组的共现关系
*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001.
2.5. 唾液微生物组组成与IL-17及IL-23质量浓度的相关分析
通过ELISA检测唾液中IL-17与IL-23的质量浓度（表1），结果显示，OLP组中IL-17的质量浓度高于H组（P=0.048）；而OLP组与H组唾液中IL-23的质量浓度差异无统计学意义。
表 1. Analysis of clinical parameters of OLP patients.
口腔扁平苔藓患者临床参数分析
| Group | n | IL-17/(pg/mL) | IL-23/(pg/mL) | Clinical score |
| H | 18 | 39.85±4.86 | 119.53±146.01 | 0 |
| OLP | 35 | 43.56±5.69 | 152.61±132.44 | 2.66±0.05 |
| P | 0.048 | 0.421 | 0.000 1 |
OLP组的临床诊断评分高于H组（P=0.000 1），见表1。如表2所示，OLP临床诊断评分与唾液IL-17水平、唾液密螺旋体属（Treponema）、卟啉单胞菌属（Porphyromonas）和乏养菌属（Abiotrophia）具有弱正相关（P<0.05），IL-17与密螺旋体属和卟啉单胞菌属呈正相关（P<0.05）。同时，IL-23与卟啉单胞菌属和乏养菌属呈弱正相关（P<0.05）。
表 2. Correlation analysis between clinical parameters and salivary bacteriome in OLP patients.
口腔扁平苔藓患者临床参数与唾液菌属的相关性分析
| Clinical factor | Genus or IL | r | P |
| Clinical score | IL-17 | 0.45 | 0.003 0 |
| Treponema | 0.38 | 0.011 9 | |
| Porphyromonas | 0.37 | 0.014 7 | |
| Abiotrophia | 0.31 | 0.042 8 | |
| IL-17 | Treponema | 0.52 | 0.000 3 |
| Porphyromonas | 0.38 | 0.011 7 | |
| IL-23 | Porphyromonas | 0.44 | 0.003 1 |
| Abiotrophia | 0.35 | 0.023 4 |
3. 讨论
微生物感染在OLP发病机制中可能发挥了重要作用，但是针对全面微生物结构解析的研究较少。本研究发现OLP患者唾液细菌组和真菌组多样性及总体结构与健康对照之间无明显差异。但OLP组患者唾液普雷沃菌属和Solobacterium有增高的丰度。普雷沃菌属是口腔等部位的共现菌，在牙周炎、根尖周感染和一些局部及系统性疾病如类风湿性关节炎中，也可发现其相对丰度增加[9-12]。在OLP患者唾液和颊黏膜微生物中，有研究发现Prevotella denticola和Prevotella melaninogenica丰度显著增加，前者与Th17介导的黏膜炎症相关，后者能够黏附并入侵巨噬细胞，刺激巨噬细胞增强对IL-1β和TNF-α的转录[13-14]。此外，研究发现Solobacterium moorei可通过代谢蛋白产生挥发性硫化合物，后者可诱导IL-8的分泌，参与口臭和牙槽骨吸收[15]。本研究报道了Solobacterium在OLP患者唾液中丰度增加，需进一步探索其参与OLP发展的可能途径。WANG等[16]分析了OLP与健康对照的唾液微生物，发现OLP患者唾液微生物群落更具多样性，且放线菌属（Actinomyces）、螺旋体属（Spirochete）及卟啉单胞菌属等可导致口腔微环境的生态失衡。该研究与本次发现的差异菌属不同，分析可能是样本类型、样本量、测序区域及纳入排除标准之间的差异所导致。
本研究评估了与OLP相关的真菌属，发现念珠菌属和曲霉菌属的相对丰度较健康对照有明显的增加。其他研究也发现了类似的结果，即念珠菌属在OLP患者唾液中丰度增加[17]。并且，有研究表明Candida albicans可以激活OLP角质形成细胞TLR2/MyD88/NF-κB信号通路，导致细胞因子表达增加并减少角质细胞凋亡，由此介导OLP的发生发展[18]。曲霉菌属是另一机会性真菌病原体，目前尚未见其他研究明确指出其与OLP之间的联系，但其与宿主根管感染、囊性纤维化和免疫功能低下相关，并可能导致一系列呼吸道疾病和伤口感染[19]。这些结果提示OLP发生发展不是微生物群落总体失衡的结果，而是与少数菌属丰度异常升高有密切联系。
分析OLP患者唾液真菌-细菌组的共现和共斥模式发现，差异细菌属（普雷沃菌属、Solobacterium）与差异真菌属（念珠菌属和曲霉菌属）相互之间并无显著关联，推测可能更多是菌种间呈现相互关系。本研究发现曲霉菌属在H组与链球菌属和孪生球菌属（Gemella）呈正相关，但在OLP组中转变为与消化链球菌属正相关，提示疾病状态下相互关系发生了转变，链球菌属和孪生球菌属是人和动物口腔的正常菌群的成员，在宿主抵抗能力降低的情况下才会导致多种机会感染[20]。而且，H组中差异相关关系共11组，较OLP组多，细菌-真菌的相互关系更复杂。研究发现与无龋者比较，唾液致龋微生物之间的相互作用在龋病患者中有显著的减弱或消失，类似的还有在老年结肠黏膜微生物中的共生关系较年轻者明显减少[21-22]。微生物之间相互作用的增多或增强时，表明物种之间的相关性越紧密、越复杂，菌群结构越稳定，其功能也越健全，整个菌群系统的自身调节能力也越高[23]。
OLP被认为是T细胞介导的炎症性疾病，在OLP局部病变的黏膜固有层中有显著增加的Th17细胞，高水平的Th17细胞和其分泌的IL-17可以促进炎症反应，与OLP发生发展相关[24-25]。本研究发现唾液IL-17水平在OLP组中显著升高。WU等[26]在OLP患者血清中发现IL-17的浓度明显高于对照组，糜烂OLP患者血清中IL-17的浓度高于网纹OLP，表明血清中IL-17浓度与OLP严重程度相关。本研究在唾液而不是血清中观察到同样的趋势，表明使用OLP患者唾液来监测细胞因子水平可能是一种较好的方法。此外，本研究还发现唾液中卟啉单胞菌属的丰度同时与临床评分、IL-17和IL-23质量浓度呈正相关。已有研究表示IL-13水平与Porphyromonas pasteri呈正相关，巨噬细胞炎性蛋白-1α及IL-17与牙龈卟啉单胞菌呈正相关[27-28]，且牙龈卟啉单胞菌可增强Th17细胞对动脉粥样硬化的反应[29]。此外，本研究还发现密螺旋体属和乏养菌属与OLP的临床评分及唾液炎症细胞因子质量浓度呈显著正相关，提示这些细菌可能参与了OLP疾病进展，其比例可能反映了该病的严重程度。还有研究认为疾病状态下菌群致病性发生了变化，或是机体对于菌群的反应不同[30]。
口腔定植了几千种细菌和真菌，本研究初步确定了与OLP相关的微生物类群，为OLP口腔微生物群落结构与疾病状态相关性提供了一个较为全面的横断面调查。进一步分析了OLP微生物群落的失调以及细菌-真菌的相互作用，提示了微生物在该疾病进展中的潜在作用。最后，本研究检测了炎症因子与疾病状态的显著关系及对特定菌群的影响。总之，深入的差异菌属或菌种对OLP的作用及致病机制的阐明将有望提供OLP治疗的新思路。但本研究仍存在一定的局限性，如采用唾液样本虽然易于收取、均质化，但还应该尝试黏膜拭子或含漱液样本，因为真菌的菌丝常常侵入黏膜生长，不易脱落；随着技术的进步，也可以采用三代测序方法，分析种水平上的微生物组差异。下一步，我们将在临床样本中验证这些差异菌属的代表菌种丰度，并采用体外实验研究差异细菌-真菌的相互关系，及对临床参数如免疫的作用机制。
* * *
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
Funding Statement
国家自然科学基金项目（No. 81771085）、四川省科技厅重点研发项目（No. 2020YFSY0008）和广东省科技厅重点实验室开放课题基金（No. KF2019120101）资助
Contributor Information
彩霞 晏 (Cai-xia YAN), Email: 986860244@qq.com.
燕 李 (Yan LI), Email: feifeiliyan@163.com.
References
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