CD47分子相关信号通路及CD47在病原感染中的研究进展

Abstract

CD47是一种广泛表达于细胞表面的跨膜糖蛋白，是细胞逃逸固有免疫监视的重要检查点之一。其参与调控的信号通路以及表达水平的改变在免疫调节、病原感染以及抗肿瘤免疫中发挥的重要作用也逐步被人们所认识。本文从CD47的结构与生物学特性，CD47与配体整合素、凝血栓蛋白1以及信号调节蛋白结合所作用的信号转导过程，病原体感染促进宿主CD47表达及CD47在不同感染免疫应答的作用这三个方面进行了文献综述，并对未来CD47靶向免疫治疗在感染相关肿瘤中的应用前景进行了展望，为今后的研究提供一定参考。

CD47是一种广泛而适度表达在所有健康细胞表面的糖蛋白，在免疫调节及稳态维持中发挥着至关重要的功能^[1]。CD47的表达水平受到机体生理病理状态、细胞类型的影响。在生理状态下，迁徙干细胞及年轻红细胞通过高表达CD47抵抗巨噬细胞吞噬^[2]。病理状态下，被病原体侵袭的免疫细胞也会提高CD47分子在细胞表面的水平^[3]。这是病原体通过免疫逃逸提升毒力与致病性的方式之一。同时，多种肿瘤细胞通过上调CD47而逃逸巨噬细胞及树突状细胞识别吞噬，基于CD47的肿瘤免疫治疗方法已在多种肿瘤临床前及临床试验中开展^[4]。本文就CD47的结构与生物学特性、CD47相关的分子信号通路、CD47与病原感染的关系以及在病原感染相关肿瘤免疫治疗中的研究进展做一综述，总结相关发现指导后续研究。

1. CD47的结构及其生物学特性

CD47是一种相对分子质量为52 000的糖蛋白，分为两种不同的亚型。一种在N端具有糖基化修饰，另一种在第64位和第79位丝氨酸含有糖胺聚糖修饰^[5]。其分子结构由以下三部分组成：长N端胞外结构域、跨膜片段和1个多变的短链C末端胞内区。其中N端结构域又被称为IgV区，是一个由免疫蛋白构成的多变区。而跨膜片段是一个高度疏水的五次跨膜结构域。C末端胞内段常常具有四个功能未知的同工型表型，因此CD47的相对分子质量常常介于31 871至35 213之间，主要取决于C末端胞内尾端氨基酸的数量^[6]。

CD47在几乎所有细胞的表面都有表达，包括红细胞和血小板。年轻红细胞表面有着很高的CD47表达水平，但当红细胞衰老后，其逐渐丢失CD47，加速巨噬细胞对其的清除，实现红细胞的更新。LINDBERG等^[7]的研究发现在生理状态下，CD4⁺效应T细胞会常常高表达CD47，抑制巨噬细胞的“自清洁”功能，保护记忆性T细胞，使其继续发挥生物学功能，延长生存时间。此外，CD47还在人类造血干细胞的表面高表达，避免其遭受巨噬细胞吞噬^[8]。一旦CD34⁺造血干细胞表面的CD47表达量下降，就有可能导致嗜血细胞综合征。在病理状态下，痘病毒等病毒进化出可以编码CD47样蛋白的基因，在其感染细胞表面表达，躲避免疫系统的清理；同时，CD47在多种组织的肿瘤细胞表面也呈现高表达^[9-11]，而且这种高表达状态可以抑制机体巨噬细胞的吞噬作用。因此CD47介导的信号又被称为“别吃我”信号（Don’t eat me）。

2. CD47相关的分子信号通路

CD47识别胞外配体的功能主要是通过其胞外的IgV结构域实现的。它的主要配体除了以自身为代表的整合素^[12]以外，还有凝血栓蛋白1（thrombospondin 1, TSP1）^[13]和信号调节蛋白（signal regulatory protein, SIRP）^[14]。ELADL等^[15]的研究显示CD47蛋白之间可以通过相互作用诱导细胞间的黏附作用。CD47与TSP1相互作用可以促进各种恶性肿瘤的发展^[16]。CD47与SIRPα结合可以抑制巨噬细胞、树突状细胞的成熟以及吞噬、抗原加工和提呈^[17]。以下将对CD47与其配体通路的作用进行具体阐述。

2.1. CD47与整合素

由于CD47可以与α_vβ₃整合素或其他整合素相互作用，因此又被称为整合素相关蛋白。一旦其与α_vβ₃整合素结合后，即可激活α_vβ₃整合素信号转导靶标，例如黏附斑激酶和Paxillin^[18]。另外，还有几种异源三聚体G蛋白可以被CD47激活，其相关机制可能是通过细胞骨架1（cytoskeleton 1, PLIC-1）与CD47整合素复合物结合^[19]，从而诱导cAMP活化CD47^[20]。

2.2. CD47与TSP1

TSP1是一种多功能糖蛋白。目前已知共有五种同工型，分别由以下基因编码，即TSP-1、TSP-2、TSP-3、TSP-4和TSP-5^[21]。TSP1可以由多种细胞合成并分泌，具有抑制血管生成、激活转化生长因子-β参与组织修复等多种生物学功能^[22]，是第一个发现的CD47内源性配体^[23]。其中同工型1的每一条肽链都可以分为以下六个功能区^[24]：①氨基末端；②Ⅰ型序列；③Ⅱ型序列；④Ⅲ 型序列；⑤原胶原同源区；⑥羧基末端。蛋白质结构相关研究显示，这些肽链由三个相同的二硫键连接形成一个相对分子质量约180000的大分子。它主要通过三级结构的相关功能域介导细胞、细胞外基质间的相互作用。虽然CD47-TSP1复合物的X线衍射结构尚未确定，但是针对分子模型和X线晶体衍射的分析表明，TSP1在羧基端有VMM基序，对CD47具有高亲和力^[25]。

CD47-TSP1信号通路主要具有三方面的生物学功能。①调控G蛋白通路：CD47与整合素形成的复合体可以通过PLIC1与三聚体G蛋白相互作用形成二重三聚体复合物^[19]。CD47的5次跨膜结构域可以与整合素的2个跨膜片段形成一个七次跨膜的功能单元，该单元具有G蛋白激活能力^[20]。②调控NO-cGMP信号通路：在血管内皮细胞中，一氧化氮的活性释放受到机械刺激和循环因子例如乙酰胆碱和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）的调控。VEGF通过内皮细胞上的受体2激活磷脂酰肌醇3-激酶/激活蛋白激酶B信号轴，通过信号转导级联发达最终激活eNOs上的第1177位丝氨酸。同时活化的VEGF2型受体募集Src并诱导钙离子相关通路，从而激活一氧化碳合酶异构体（eNOs）。NO可以结合位于胞浆内的可溶性鸟苷酸环化酶上的血红素结合域，增强其催化活性，诱导细胞内cGMP积聚，引起cGMP依赖性激酶1（cGMP-dependent protein kinase, cGK1）活化，使血管平滑肌松弛。此外，还有相关研究表明，TSP1可以通过竞争性拮抗的方式阻断CD47与VEGFR2的结合，抑制其活性，进而影响后续信号通路的转导^[26]。③TSP1与CD47结合后能够诱导BCL2/腺病毒E1B 19 kDa 蛋白相互作用蛋白3（BCL2/adenovirus E1B 19 kDa protein-interacting protein 3, BNIP3）转移至线粒体。BNIP3可以增强线粒体通透性，释放细胞色素C诱导细胞死亡^[27]。此外，CD47的缺乏可以帮助细胞通过激活保护性的自噬通路促进生存^[28]。

2.3. CD47与SIRPα

SIRPα是CD47亲和力最高的配体，属于免疫球蛋白超家族，是一种跨膜糖蛋白^[14]。其胞外结构内含有三个Ig样结合域，包括一个V样结合域和两个C1样结合域。SIRPα在胞内的结构主要由六个功能区域构成，分别是4个酪氨酸残基和2个络氨酸抑制序列（immunoreceptor tyrosine based inhibitory motif, ITIM）^[29-30]。SIRPα的N端结构域可以与CD47的Ig结构域直接结合，并促进酪氨酸磷酸化，SIRPα的酪氨酸磷酸化位点与酪氨酸磷酸酶（src-homology domain 2-containing protein tyrosine phosphatase, SHP）-1和SHP-2结合并激活，从而影响胞内信号通路转导^[31-32]。SHP-1主要在血液细胞以及上皮细胞内表达，且参与了许多信号转导途径，包括对吞噬作用的负反馈调节^[33]。而SHP-2则主要通过调节大鼠肉瘤和Rho蛋白，促进细胞的增殖、生长和迁移，广泛表达在多种细胞。SIRPα在所有的髓系来源的细胞内都有表达（包括单核细胞、巨噬细胞、粒细胞、髓系树突状细胞）^{[30, 34- 35]}。与CD47不同的是，SIRPα在吞噬细胞表面的表达量相对稳定，不会受到病理状态影响^[36]。

CD47-SIRPα轴主要有两大病理生理学作用：①调控吞噬作用；②通过调节树突状细胞和T细胞维持体内稳态。CD47是体细胞重要的自身识别分子，与SIRPα相互作用形成“别吃我”信号轴。是机体细胞，特别是红细胞和肿瘤细胞免疫逃逸的重要机制^{[11, 17]}。CD47-SIPRα信号轴相关的防吞噬作用部分是通过SHP-1来抑制巨噬细胞吞噬作用实现的^[29]。此外，还有相关研究表明^[37]，SIRPα突变小鼠脾脏内的树突状细胞明显减少，其寿命也出现显著下降。RESPATIKA等^[38]在后续的研究中还发现这种突变小鼠还能降低脾脏内CD4⁺的T细胞数量以及T细胞聚集区。受损的树突状细胞和T细胞可影响Th1、Th2、Th17的免疫应答功能，从而造成全身免疫状态失调^[39]。这些研究结果均提示CD47-SIRPα轴对于维持树突状细胞和T细胞的内稳态具有重要的作用。

3. CD47与感染免疫

由于CD47分子的广泛存在以及其重要配体SIPRα在免疫细胞的高表达，CD47分子也参与了机体对于病原感染的免疫应答。本节将从病原体对CD47的表达调控和CD47与感染免疫应答2个方面进行归纳。

3.1. 病原体对CD47的表达调控

研究表明一些病毒，例如痘病毒、疱疹病毒以及腺病毒都具备编码CD47蛋白的能力，它们借此逃离宿主的免疫监视，发挥其毒性。CAMERON等^[40]在黏液瘤病毒M128毒株中发现其已进化出编码CD47样蛋白的基因序列，通过基因编辑技术他们成功将这段序列敲除。进一步体内实验显示，敲除后的病毒其致病力和毒性显著下降。然而，其他的病原微生物例如：细菌、真菌以及寄生虫是否也具有表达CD47蛋白的功能，目前尚不清楚。最近CHAM等^[3]在多种病原生物（淋巴细胞脉络膜脑膜炎病毒、乙型肝炎病毒、2019新型冠状病毒、结核杆菌等）感染的小鼠动物模型中发现，感染细胞的CD47蛋白表达量明显上升。与肿瘤细胞不同的是，感染过程中CD47的上调源于模式识别受体的胞质或内体刺激。在慢性感染患者的血清内存在某些炎症性细胞因子，例如干扰素α、肿瘤坏死因子α和CXCL-10等，它们可以在体外诱导免疫细胞的CD47表达上调。然而，鼠伤寒沙门氏菌却是一种例外，在其感染过程中免疫细胞的CD47表达出现明显下降。进一步研究^[41]发现，与上述各种病原微生物不同，鼠伤寒沙门氏菌不具有诱导刺激Toll样受体（Toll-like receptor, TLR）表达增加的能力。这提示TLR激活对于感染过程中体细胞的CD47表达上升具有重要的作用。以往，研究人员对于感染免疫过程中的体细胞的CD47表达上调感到困惑不已，因为CD47是一种免疫抑制因子，过度表达会加重机体的感染症状。近年来，研究人员发现，CD47在感染免疫中的过度表达实际是一种机体的自我保护机制，可以避免免疫细胞过度活化而导致严重的自体损伤^[42]。因此，CD47对于平衡促炎和抑炎信号极为重要。

3.2. CD47与感染免疫应答

利用CD47基因敲除小鼠，研究人员评价了CD47在不同病原感染模型中对宿主的影响^[43-44]。在恶性疟原虫感染模型中，CD47缺失小鼠巨噬细胞吞噬活性增强、寄生虫血症严重程度降低、内皮细胞活化水平降低、脾脏巨噬细胞百分比升高，小鼠存活率上升。在大肠杆菌肺炎模型和LPS诱导的急性肺损伤模型中，CD47缺失组均表现出巨噬细胞及中性粒细胞吞噬增强、中性粒细胞浸润水平增加、菌血症减少、肺水肿缓解，提示CD47可能是治疗急性感染性肺损伤的一个靶点^[45]。同时，流感病毒疫苗在CD47敲除小鼠中具有更强的保护作用，这表明CD47在病毒特异性中和抗体反应中具有重要的作用^[46]。然而，在白色念珠菌感染模型中，CD47缺失小鼠出现了白色念珠菌在大脑及肾脏的定植增加并伴有更强的炎症反应，病死率高于对照小鼠^[47]。这反映了CD47在念珠菌感染中的宿主保护作用。采用抗CD47单克隆抗体治疗则是另一种研究CD47在体内功效的常用方法。在小鼠慢性淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒感染模型中使用抗CD47抗体促进了CD8⁺T细胞的增殖、激活以及抗病毒细胞毒性。在HIV-1感染的人源化小鼠模型中使用抗CD47单克隆抗体，可以明显降低HIV相关的p24抗原表达，同时恢复CD4⁺和CD8⁺T细胞数量，HIV感染得到更好的控制^[48]。此外，抗CD47抗体的使用可以让水泡性口炎病毒感染模型小鼠产生更多抗病毒中和抗体，提高致死剂量病毒处理下小鼠的存活率^[41]。这些研究结果提示，基因敲除或药物治疗抑制CD47功能可解除感染带来的免疫抑制，增强机体免疫功能。虽然，CD47功能抑制在一些特定感染模型中未取得正向效果，但合理运用CD47抑制剂或可成为抗感染治疗的一种新方案。

4. 展望

CD47靶向抑制剂因为在抗肿瘤治疗中取得了良好的疗效，成为了免疫治疗相关研究的一大热点方向。同时，研究人员也逐渐发现CD47靶向抑制可以通过激活固有免疫及获得性免疫系统发挥抗感染特别是抗病毒感染的功效。抗CD47单克隆抗体或其他抑制剂可同时标记高表达CD47的病原感染细胞以及肿瘤细胞，发挥双重功效。据此，我们认为CD47可能是病毒感染相关肿瘤治疗的一个独特靶点。头颈部鳞状细胞癌可根据人乳头瘤病毒（human papillomavirus, HPV）感染情况分为HPV阳性和HPV阴性，HPV阳性的患者比率正逐年提升^[49]。癌症基因组图谱数据分析显示，CD47在头颈部鳞状细胞癌组织较正常组织差异性高表达。LUDWIG等^[50]对于HPV阳性及阴性头颈部鳞状细胞癌的研究更显示，HPV阳性细胞系有着更高的CD47表达且仅HPV阳性细胞系外泌体中含有CD47蛋白。与此同时，HPV感染也是宫颈癌的危险因素之一。在宫颈癌相关研究中，LIU等^[51]发现，HPV肿瘤蛋白E6与E7可通过剪接因子SRSF10促进肿瘤膜型白介素-1受体相关蛋白进一步上调宫颈癌CD47表达，从而协同宫颈癌的免疫逃逸。这些研究结果为在HPV感染相关肿瘤患者中进行靶向CD47免疫治疗提供了更加充分的依据。此外，肝癌相关丙型肝炎病毒患者肝组织有着相较于正常对照更高的CD47表达^[52]，提示抗CD47免疫治疗或可用于丙型肝炎治疗，从而减少丙型肝炎患者最终发展为肝硬化甚至肝癌。其他病毒感染相关肿瘤如鼻咽癌、卡波西肉瘤等也可能是靶向CD47免疫治疗的潜在对象，有待进一步开展深入研究。

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利益冲突 　所有作者均声明不存在利益冲突

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国家重点研发计划课题（No. 2017YFC0840107）资助