胞外囊泡通过三磷酸腺苷结合盒转运子G2调控肺腺癌耐药的作用研究

Abstract

目的

探讨携带三磷酸腺苷结合盒转运子G2（ATP binding cassette transporter G2, ABCG2）胞外囊泡（extracellular vesicle, EVs）调控肺腺癌耐药作用及其分子机制。

方法

取人肺腺癌细胞A549，建立顺铂（cis-Diaminedichloroplatinum, CDDP）耐药的肺腺癌细胞A549/CDDP；利用梯度离心法提取A549及A549/CDDP细胞释放的EVs，分别命名为EVs₁及EVs₂。EVs₁及EVs₂干预A549细胞48 h后，细胞分别命名为A549-EVs₁及A549-EVs₂。利用pCDNA3.1-ABCG2重组质粒转染A549细胞，建立A549/ABCG2细胞；转染空载体的A549细胞命名为A549/pCDNA3.1细胞。以MTT检测计算细胞24 h对CDDP的耐药指数；real-time PCR检测细胞、EVs中ABCG2基因表达；建立荷瘤裸鼠模型，分别接种A549及A549-EVs₂细胞至裸鼠皮下，记为对照组及实验组。成瘤后腹腔注射3 mg/kg CDDP，每周1次，共2次。取皮下移植瘤组织，real-time PCR检测ABCG2基因表达，流式细胞术检测皮下移植瘤细胞凋亡率。

结果

以亲代细胞A549为参照，A549/CDDP、A549/ABCG2、A549/pCDNA3.1、A549-EVs₁、A549-EVs₂细胞24 h对CDDP的耐药指数分别为7.17、10.06、1.02、1.19、5.40。各细胞中、EVs中ABCG2基因的表达水平相比较，A549/CDDP细胞高于A549细胞，A549/ABCG2细胞高于A549/pCDNA3.1和A549细胞，EVs₂高于EVs₁，A549-EVs₂细胞高于A549-EVs₁细胞（P<0.01）。实验组移植瘤体积、细胞中ABCG2基因表达大/高于对照组，而细胞凋亡率低于对照组（P<0.05）。

结论

携带ABCG2基因的EVs可以调控肺腺癌细胞耐药。

肺癌是发病及死亡率较高的恶性肿瘤，其中肺腺癌最为常见，其主要治疗方法为化疗，而耐药是影响疗效的主要因素^[1-3]。探究肺腺癌耐药机制，对于提高肺腺癌治疗效果具有重大意义。细胞跨膜转运蛋白与耐药密切相关，可通过降低细胞内化疗药物的有效浓度引起耐药^[4-5]，以三磷酸腺苷结合盒（ATP binding cassette, ABC）转运蛋白为代表^[6-11]。本小组发现ABC转运子G2（ABC transporter G2, ABCG2）与食管癌耐药相关^[12]，但耐药细胞通过何种机制传递耐药信息并未阐明。肿瘤微环境对细胞耐药起着重要的调控作用，其中胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs）的作用尤为突出。本小组发现携带linc-VLDLR的EVs可以调控食管癌耐药^[13]，GIULIA等^[14]研究显示，间变性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase, ALK）参与黑素瘤细胞耐药，携带ALK的EVs可以将耐药信息传递给敏感细胞。然而，EVs调控肺腺癌耐药作用的研究鲜有报道。本文利用A549肺腺癌细胞建立顺铂（cis-Diaminodichloroplatinum, CDDP）耐药的肺腺癌A549/CDDP细胞及过表达ABCG2的A549/ABCG2细胞，研究肺腺癌耐药细胞是否可以通过释放携带ABCG2基因的EVs调控耐药。

1. 材料和方法

1.1. 主要试剂

RPMI1640及胎牛血清（Gibco公司，美国）；荧光定量PCR试剂（南京诺唯赞生物科技有限公司，中国）；AnnexinⅤ-FITC/PI试剂盒（BD公司，美国）；噻唑蓝比色法（MTT）试剂及二甲基亚砜（Sigma公司，美国）；注射用顺铂（冻干型）（齐鲁制药有限公司，中国）；引物（上海生工生物公司，中国）；pCDNA3.1-ABCG2质粒（武汉晶赛公司，中国）。

1.2. 细胞株

1.2.1. 人肺腺癌细胞株A549

A549细胞由河北省肿瘤研究所提供，使用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基（青链霉素各100 U/L）进行培养，置37 ℃、体积分数5%CO₂的温箱中。

1.2.2. A549/CDDP细胞

逐渐增加A549细胞培养液中CDDP质量浓度结合CDDP大剂量冲击，CDDP质量浓度从0.1 μg/mL逐渐增至3 μg/mL，历时6个月的细胞培养，最终使用1 μg/mL CDDP为维持质量浓度，建立顺铂耐药的肺腺癌细胞，命名为A549/CDDP细胞。

1.2.3. A549-EVs₁及A549-EVs₂细胞

采用梯度离心法提取细胞释放的EVs。将处于对数生长期的A549及A549/CDDP细胞分别接种至细胞培养瓶中，培养48 h后利用梯度离心法收集细胞培养液中A549及A549/CDDP细胞释放的EVs，分别标记为EVs₁及EVs₂。梯度离心法的主要步骤包括^[15]：2000 r/min，10 min；3000 r/min，30 min；11000 r/min，1 h。收集离心后的上清，将上清以超高速110000×g离心16 h，弃上清，用适量PBS溶解EVs沉淀，Nanodrop法定量，调整质量浓度为500 μg/mL，−80 ℃分装保存。将1×10⁵mL⁻¹的A549细胞接种至6孔板中，细胞贴壁后，分别加入EVs₁及EVs₂，使终质量浓度达到50 μg/mL，每组设置3个复孔，培养48 h后收集细胞，分别标记为A549-EVs₁及A549-EVs₂细胞。

1.2.4. A549/ABCG2细胞和A549/pCDNA3.1细胞

利用基因转染方法建立过表达ABCG2的肺腺癌细胞。将处于对数生长期的肺腺癌A549细胞4×10⁵/孔接种于6孔板中，细胞贴壁后，进行细胞转染。用无牛清的RPMI1640培养液冲洗细胞2次后弃去上清液，每孔加入2 mL无牛清及抗生素的RPMI1640培养液，试剂1（5 μL Lipofectamine^TM2000脂质体与245 μL无牛清及抗生素的RPMI1640培养液混合，室温放置5 min）与试剂2（2 μL pCDNA3.1-ABCG2重组质粒与248 μL无牛清及抗生素的RPMI1640培养液混合，室温放置5 min）轻柔混合，室温放置20 min后加入6孔板每孔中，转染72 h后使用G418进行转染细胞筛选，细胞命名为A549/ABCG2细胞；转染空载体pCDNA3.1的A549细胞命名为A549/pCDNA3.1细胞。

1.3. 实验方法

1.3.1. MTT法检测细胞对CDDP的耐药

将1×10⁴mL⁻¹ A549、A549/CDDP、A549-EVs₁、A549-EVs₂、A549/ABCG2及A549/pCDNA3.1分别接种至96孔板，待细胞贴壁后小心倒去培养液，各设置9个质量浓度，分别加入不同质量浓度的CDDP（0、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10、50 μg/mL），并以0 μg/mL CDDP组为对照组（使用生理盐水代替CDDP）；每个质量浓度重复3个复孔，另设调零孔。CO₂温箱中孵育24 h，而后每孔加入MTT溶液（5 mg/mL） 20 μL，继续培养4 h，弃去培养基，每孔加入180 μL二甲基亚砜，振荡10 min。酶标仪测定各孔吸光度A₄₉₀值，计算细胞生长抑制率〔 （1−用药组A₄₉₀÷对照组A₄₉₀ ）×100 % 〕，以绘制细胞生长曲线，对应得出24 h的半数抑制浓度（half inhibition concentration, IC₅₀ ），计算细胞24 h对CDDP的耐药指数。耐药指数=耐药细胞IC₅₀÷亲代细胞IC₅₀，亲代细胞均为A549。

1.3.2. 荧光定量real-time PCR方法检测细胞、EVs中ABCG2基因表达

使用RNA isolater提取细胞（A549、A549/CDDP、A549/ABCG2、A549/pCDNA3.1、A549-EVs₁及A549-EVs₂细胞）、EVs（EVs₁及EVs₂）中的RNA，反转录为cDNA。常规real-time PCR方法进行实验，采用SYBR-Green Ⅰ作为荧光染料，实验重复3次。ABCG2上游引物3′-ACG ATG TCT TTG GTG TGA GAC TGG-5′，下游引物3′-ATT TCG TCC CGT AGC TAG AGA GTG-5′，扩增产物长度280 bp。内参GAPDH上游引物3′-CACTACCGTACCTGACACCA-5′，下游引物3′-ATGTCGTTGTCCCACCACCT-5′，扩增产物长度452 bp。扩增条件：预变性，95 ℃ 5 min（1循环）；扩增，95 ℃ 15 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 25 s（40循环）；熔解曲线，95 ℃ 15 s、58 ℃ 1 min、95 ℃ 30 s（1循环）。应用2^−ΔCt值法计算ABCG2 mRNA的相对表达量。

1.3.3. 建立肺腺癌细胞荷瘤裸鼠

为了探讨来源于肺腺癌耐药细胞释放的EVs₂调控耐药的作用，接种A549-EVs₂细胞至小鼠皮下，进行实验。4周龄BALB/c nu/nu裸小鼠，12只，雌雄各半，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物许可证号SCXK（京）2012-0001。动物实验分2组，每组小鼠6只，雌雄各半。实验组，皮下接种A549-EVs₂细胞；对照组，皮下接种A549细胞。裸鼠皮下接种肺腺癌细胞成瘤后（瘤直径约0.5 cm）开始腹腔注射药物（3 mg/kg CDDP），1次/周，共2次，实验周期为2周。每隔1 d，测量裸鼠体质量和观察裸鼠饮食水及活动情况，每周测皮下移植瘤长径（a，单位为mm）、短径（b，单位为mm）和体积（V，单位为mm³）1次。V=a×(b)²/2。皮下移植瘤成长至瘤直径约5 mm，判定裸鼠皮下移植瘤模型建立成功。

1.3.4. 荧光定量real-time PCR方法检测皮下移植瘤中ABCG2基因表达

使用RNA isolater提取皮下移植瘤组织（将组织进行研磨后提取RNA）中的RNA，反转录为cDNA，后续步骤与1.3.2相同。检测皮下移植瘤中ABCG2基因表达。

1.3.5. 流式细胞术方法检测裸鼠皮下移植瘤细胞凋亡

裸鼠皮下移植瘤离体后立即使用网搓法制备单细胞悬液，调整细胞浓度为1×10⁷mL⁻¹。取100 μL制备的细胞悬液，加入5 mL PBS混匀后，离心弃去上清，加入100 μL1×Binding buffer混匀细胞，加入5 μL AnnexinⅤ-FITC，避光放置15 min，而后加入10 μL PI染液避光放置10 min，加入385 μL 1×Binding buffer后流式细胞仪检测。采用Expo32 ADC v1.2软件分析荧光数据，计算细胞凋亡率。

1.4. 统计学方法

实验数据以 表示。采用单因素方差分析及独立样本t检验进行组间比较，P<0.05为差异有统计学意义。

2. 结果

2.1. 肺腺癌顺铂耐药细胞建立、耐药特征及ABCG2表达

细胞生长抑制率曲线见图1A。CDDP作用A549/CDDP细胞24 h的IC₅₀高于其亲代细胞A549〔（26.32±2.93） μg/mL vs. （3.67±0.20） μg/mL，P<0.01〕。A549/CDDP细胞对CDDP的耐药指数为7.17。ABCG2 mRNA在A549/CDDP细胞中的表达水平（0.46±0.05）高于A549细胞（0.20±0.01），差异有统计学意义（P<0.01）。

图 1.

Growth inhibition rate curves of different lung adenocarcinoma cells treated with CDDP for 24 h (n=3)

顺铂作用不同肺腺癌细胞24 h的生长抑制率曲线图（n=3）

A: A549 and A549/CDDP; B: A549, A549/PCDNA3.1, and A549/ABCG2; C: A549-EVs₁and A549-EVs₂.

2.2. A549/ABCG2细胞耐药性和ABCG2表达

细胞生长抑制率曲线见图1B。CDDP对A549/ABCG2细胞24 h的IC₅₀值〔（36.92±1.72） μg/mL〕高于对A549 〔（3.67±0.20） μg/mL〕及对A549/pCDNA3.1细胞〔（3.73±0.07） μg/mL〕（P<0.01），而CDDP对A549细胞与对A549/pCDNA3.1细胞24 h的IC₅₀值差异无统计学意义。A549/pCDNA3.1及A549/ABCG2细胞对CDDP耐药指数分别为1.02和10.06。A549/ABCG2细胞中ABCG2 mRNA表达水平（0.68±0.04）高于其亲代细胞A549 （0.20±0.01）及空载体细胞A549/pCDNA3.1 （0.21±0.02）（P<0.01），而后两者中ABCG2 mRNA的表达水平差异无统计学意义。

2.3. EVs干预肺腺癌A549细胞后耐药性和ABCG2表达

细胞生长抑制率曲线见图1C。CDDP干预A549-EVs₁ 24 h的IC₅₀值低于A549-EVs₂细胞〔（4.38±0.11） μg/mL vs. （19.82±0.64） μg/mL，P<0.01〕。A549-EVs₁及 A549-EVs₂24 h对CDDP的耐药指数分别为1.19和5.40。ABCG2 mRNA在EVs₂中的表达水平（0.57±0.04）高于EVs₁（0.25±0.01）（P<0.01），在A549-EVs₂细胞中的表达水平（0.41±0.03）高于A549-EVs₁（0.23±0.02）（P<0.01）。后续实验选择A549-EVs₂细胞进行。

2.4. 荷瘤裸鼠实验检测EVs调控肺腺癌细胞耐药

肺腺癌细胞（A549及A549-EVs₂）接种裸鼠皮下形成皮下移植瘤， 1周时肉眼已可见实验组的裸鼠皮下移植瘤体积大于对照组，见图2A。与对照组相比，第1周、第2周，实验组皮下移植瘤体积均增大（P<0.05），见图2B。实验组皮下移植瘤细胞中ABCG2 mRNA表达水平（0.43±0.04）高于对照组（0.22±0.03）（P<0.01）。实验组皮下移植瘤细胞凋亡率（9.50%±1.41%）低于对照组（19.03%±2.43%）（P<0.01），见图2C。

图 2.

EVs’ regulation of multidrug resistance of lung adenocarcinoma and its mechanism were investigated in tumor-bearing nude mice

荷瘤裸鼠实验研究EVs调控肺腺癌多药耐药作用及机制

A: Nude mouse model of lung adenocarcinoma subcutaneously transplanted tumor (1 week); B: The growth rate of subcutaneously transplanted tumor in the experimental group was significantly faster than that in the control group, *P<0.05,n=6; C: The apoptosis rate of subcutaneous transplanted tumor cells was detected by flow cytometry.

3. 讨论

ABC转运蛋白与肿瘤细胞耐药产生密切相关^[4-11]，其中以ABCB1及ABCG2研究较多^{[10-11, 16-20]}。本文首先研究ABCG2是否参与肺腺癌耐药，肺腺癌耐药细胞A549/CDDP及A549/ABCG2的耐药指数和ABCG2表达结果显示，耐药性增加的同时，ABCG2表达增加。本小组在以往的研究中发现ABCG2基因与食管癌耐药密切相关^[12]，ABCG2蛋白可以外排进入食管癌细胞中的化疗药物，引起细胞内有效药物浓度的降低，从而导致耐药；EMERY等^[16]研究显示，ABCG2及XIAP基因高表达的脑胶质瘤患者预后较差，参与了脑胶质瘤耐药的形成；JI等^[17]研究显示，Selonsertib（GS-4997）通过抑制ABCB1及ABCG2外排药物作用而逆转细胞耐药。本研究结果支持研究假设，且与以上文献报道结果一致，显示了ABCG2参与肿瘤细胞的耐药。接下来，本研究欲揭示肺腺癌耐药细胞通过何种机制传递耐药信息。

肿瘤微环境中EVs对于肿瘤侵袭、转移及耐药具有重要的调控作用^[21-24]。EVs是细胞遭受刺激时产生并释放的超微囊性结构，是细胞旁分泌的生物活性物质，包括外泌体、微泡和凋亡小体等。来源于肿瘤细胞的EVs，在其形成过程中会功能性选择与其亲代细胞相关的核酸、蛋白质等信号分子，这些信号分子在EVs与靶细胞相互作用后被释放到靶细胞中，从而改变靶细胞的特性。我们设想，肺腺癌耐药细胞是否通过EVs传递耐药信息？本研究利用差速离心法提取肺腺癌耐药细胞A549/CDDP释放的EVs₂，检测到A549/CDDP释放的EVs₂中ABCG2表达水平显著高于其亲代细胞（A549）释放的EVs₁中的表达。我们推测，EVs₂携带参与耐药的ABCG2基因信息，当EVs₂作用肺腺癌A549细胞后，A549细胞产生耐药，并同时表现出ABCG2基因信息的表达升高。较多的文献显示，EVs参与肿瘤耐药的产生：OZAWA等^[25]研究显示，来源于三阴性乳腺癌HCC1806细胞的EVs促进了正常乳腺细胞MCF10A的增殖和耐药产生；GOLER-BARON等^[26]研究发现，富集ABCG2的EVs可以引起乳腺癌细胞耐药；HE等^[27]亦发现，对索拉非尼耐药的肾癌细胞释放的EVs中高表达miR-31-5p，高表达miR-31-5p的EVs可以下调靶细胞中MutL homolog 1 （MLH1）基因表达，将索拉非尼耐药细胞的耐药信息传递给敏感细胞，从而将耐药信息放大到整个肿瘤；同时，本课题组研究显示，携带linc-VLDLR的EVs可以通过调控靶细胞中ABCG2的表达，从而引起食管癌细胞耐药^[13]。本研究结果支持我们的推测，且同上述文献报道的结果相一致，这提示，携带ABCG2的EVs可以将耐药信息传递给靶细胞，引起细胞耐药。

综上所述，本研究体内外实验显示，携带 ABCG2的EVs通过调控靶细胞中ABCG2表达从而引起肺腺癌细胞耐药，为肺腺癌耐药研究提供新思路，为研究EVs调控肿瘤耐药作用提供基础数据。但是，肿瘤耐药产生是由多基因、多途径调控，本文仅研究了携带ABCG2的EVs对肺腺癌细胞耐药的调控，在今后的实验中会进一步研究EVs调控肿瘤耐药的分子机制、EVs中非编码RNA对肿瘤耐药的调控机制，以及EVs作为纳米颗粒在肿瘤治疗及诊断中的作用。

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利益冲突 　所有作者均声明不存在利益冲突

Funding Statement

河北省政府资助专科能力建设和专科带头人培养专项基金[冀财预复（2018）674]和河北省医学科学研究重点课题（No. 20210765、No. 20210987）资助