Abstract
目的
探究全反式维甲酸（all-trans retinoic acid, ATRA）对巨噬细胞中白介素（interleukin, IL）-1β表达的调控及作用机制。
方法
巨噬细胞经1 μmol/L ATRA处理24 h后转录组测序，筛选差异表达基因，进行KEGG通路分析、GO功能分析和PPI网络分析。不同剂量ATRA处理巨噬细胞24 h后，qRT-PCR和Western blot验证炎症因子IL-1β的表达水平。Western blot和免疫荧光染色检测核因子（neuclear factor, NF）-κB信号和半胱天冬酶-1（caspase-1）的变化。
结果
测序结果显示，与空白对照组相比，巨噬细胞经ATRA处理后71个差异表达基因上调，KEGG分析显示上调基因参与IL-17信号通路、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor, TNF）信号通路等，GO分析显示上调基因参与IL-1β的产生、对脂多糖的反应等生物学过程，PPI分析揭示炎症因子，黏附分子和趋化因子为ATRA作用的核心基因。体外实验表明，ATRA呈浓度依赖性促进巨噬细胞中IL-1β的表达，ATRA组中磷酸化（p）-NF-κB、NF-κB和caspase-1的表达较对照组升高（P<0.05），且p-NF-κB发生了核转移。
结论
ATRA可能通过激活巨噬细胞中的NF-κB信号和caspase-1促进炎症因子IL-1β的表达。
Keywords: 全反式维甲酸, 生物信息学, 白介素-1β, NF-κB信号通路, 半胱天冬酶-1
Abstract
Objective
To investigate the regulatory effect of all-trans retinoic acid (ATRA) on the expression interleukin-1β (IL-1β) in macrophages and the mechanisms involved.
Methods
Macrophages were treated with 1 μmol/L ATRA for 24 h before RNA-Sequence. Differentially expressed genes (DEGs) were screened out and analyzed by Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) pathway enrichment analysis, gene ontology (GO) functional analysis, and protein-protein interaction networks (PPI) analysis. After treatment with different doses of ATRA for 24 h, the expression of IL-1β was examined with qRT-PCR and Western blot. The activation of NF-κB signaling and caspase-1 was observed by Western blot and immunofluorescence staining.
Results
Compared with the blank control group, a total of 71 DEGs of macrophages were upregulated in the ATRA treatment group. KEGG analysis showed that the up-regulated DEGs were involved in IL-17 signaling pathway, tumor necrosis factor (TNF) signaling pathway, etc. GO analysis indicated that the up-regulated DEGs were involved in the biological processes of the production of IL-1β, response to lipopolysaccharide, etc. PPI analysis revealed that inflammatory cytokines, adhesion molecules, and chemokines were the key genes that ATRA acted on. In vitro experiments showed that ATRA promoted IL-1β expression in macrophages in a concentration-dependent manner. The expression of p-NF-κB, NF-κB, and caspase-1 were significantly increased by ATRA compared with those of the control group (P<0.05), and p-NF-κB translocated to the cell nucleus in the ATRA group.
Conclusion
ATRA may promote the expression of IL-1β by activating NF-κB signaling and caspase-1 in macrophages, this study may provide evidence for the immune regulatory function of ATRA on macrophages.
Keywords: All-trans retinoic acid (ATRA), Bioinformatics, IL-1β, NF-κB signaling pathway, Caspase-1
全反式维甲酸（all-trans retinoic acid, ATRA）是维生素A在体内的主要活性衍生物[1]，在细胞增殖、分化、肿瘤发生和炎症反应等诸多生物学过程中发挥着重要作用[2]，近年来ATRA在免疫调节中的作用受到越来越多的关注[3]。ATRA促进白细胞的归巢和分化，因此临床上主要用于治疗急性早幼粒细胞白血病（acute promyelocytic leukemia, APL）[4]，但是治疗过程中会引起一系列严重的并发症统称分化综合征，其发生机制至今尚未明确，免疫调节失衡被普遍认为是主要的致病因素。
研究表明ATRA治疗APL时80%的患者会不同程度地出现并发症[5]，因此，临床上急需探究导致该并发症的机制。ATRA治疗APL会导致免疫调节失衡，主要表现为血清中的炎症因子、趋化因子和细胞间黏附分子表达上调[6]。ATRA治疗APL能明显诱导体内炎症因子白介素（interleukin, IL）-1β、IL-8、IL-6和肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor, TNF）-α的表达升高，引发全身炎症反应综合征[7]。炎症因子是先天免疫反应中的关键组成部分，在多种疾病的发病机制中发挥着核心作用。研究表明ATRA能促进免疫细胞中炎症因子的表达，如ATRA能促进肥大细胞分泌IL-8、IL-1β和TNF-α[8]；ATRA能促进小鼠巨噬细胞和人外周血单核细胞中IL-1β的表达[9]；以及ATRA能通过核因子（neuclear factor, NF）-κB、细胞外信号调节激酶（extracellular signal regulated kinase, ERK）等信号通路增强巨噬细胞中脂多糖诱导的IL-1β的表达，综上所述，ATRA可能是一种潜在的促炎物质。在所有分泌的炎症因子中，IL-1β是最强大的炎症因子，它广泛地分布在组织和各种免疫细胞中，尤其是巨噬细胞中[10]，因此本实验拟初步探究ATRA对巨噬细胞中IL-1β产生的影响及其机制。
另外，ATRA处理APL细胞会诱导多种趋化因子及其受体的表达升高，导致细胞趋化性增加，体外实验也证实ATRA会增强趋化因子的表达[11]。同时，ATRA能促进细胞间黏附分子的表达，MOHAMMADZADEH等[12]研究表明ATRA能诱导APL细胞表面β2整合素的表达，促使其与血管内皮细胞表面的黏附分子ICAM-1和ICAM-2结合，加速了APL细胞向周围组织的迁移。炎症因子、趋化因子和黏附分子是白细胞分泌的重要的免疫调节因子，影响白细胞的迁移、浸润、炎症反应等生物学过程。目前ATRA与免疫调节因子相关的生物信息学研究较少，鉴于此，本研究拟通过转录组测序来检测免疫调节相关基因的变化，全面地分析ATRA如何影响巨噬细胞的免疫调节功能，为ATRA对巨噬细胞的免疫调节研究提供一定的实验依据。
1. 材料和方法
1.1. 细胞的培养
THP-1细胞系购自武汉普诺赛有限公司，THP-1为悬浮生长的单核细胞，采用THP-1专用培养基（普诺赛，中国）进行培养，每3 d更换一次培养基，每6 d传代一次。使用1 μg/mL的佛波酯（PMA, Sigma）处理24 h可诱导分化为贴壁生长的巨噬细胞。培养箱条件为37 ℃，湿润，含体积分数5%的CO2。
1.2. 转录组测序
将使用1 μmol/L的ATRA处理巨噬细胞24 h作为实验组，同时设不做任何处理的空白对照组，每组3个样本。收集样本送至华大基因进行转录组测序。所有的原始数据在华大基因Dr.tom系统进行在线分析，包括筛选差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs）、京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）通路富集分析、基因本体（gene ontology, GO）功能分析、蛋白互作网络（protein-protein interaction networks, PPI）分析。基因的表达使用FPKM表示，差异表达基因的筛选条件为|log2FC|≥1（FC为差异倍数）、P<0.05、q<0.05（q值即校正后P值）。
1.3. qRT-PCR
实验分为空白对照组、10 nmol/L ATRA组、100 nmol/L ATRA组、1 μmol/L ATRA组、10 μmol/L ATRA组。每组3个复孔，处理24 h后用RNAiso plus（TaKaRa）提取总RNA，使用逆转录试剂盒（TaKaRa）将1000 ng RNA逆转录合成cDNA，逆转录反应体系为20 μL。qRT-PCR反应体系为12 μL：TB Green Premix Ex Taq Ⅱ 6 μL，上下游引物各1 μL，DEPC 2.5 μL ，cDNA 1.5 μL。反应条件：95 ℃预变性3 min，然后95 ℃ 5 s，60 ℃ 40 s，共40个循环，最后65 ℃ 5 s，95 ℃ 15 s。以GAPDH为内参，采用2−ΔΔCt法对目标基因表达水平进行半定量分析。IL-1β、caspase-1、GAPDH的正反向引物序列见表1。
表 1. Primer sequences for genes associated with inflammation.
炎症相关基因的引物序列
| Gene (human) | Primer sequence (5’-3’) |
| IL-1β | F: GAAATGATGGCTTATTACAGTGGC |
| R: TTGCTGTAGTGGTGGTCGGAG | |
| Caspase-1 | F: GAGAAACATCCAAAAGTGAGGG |
| R: GCCTTTCTTCTGGTCAGTGC | |
| GAPDH | F: CAGGAGGCATTGCTGATGAT |
| R: GAAGGCTGGGGCTCATTT |
1.4. Western blot
检测IL-1β时，实验分组为空白对照组、10 nmol/L ATRA组、100 nmol/L ATRA组、1 μmol/L ATRA组、5 μmol/L ATRA组、10 μmol/L ATRA组；检测NF-κB及caspase-1时，实验分组为空白对照组、100 nmol/L ATRA组、1 μmol/L ATRA组、10 μmol/L ATRA组。处理巨噬细胞24h后，将ATRA组和空白对照组样本用4 ℃预冷的PBS缓冲液清洗3次，加入含1 mmol/L PMSF的RIPA裂解液（碧云天）收集细胞蛋白。用BCA蛋白定量试剂盒（碧云天）检测蛋白浓度，加入5×蛋白上样缓冲液后100 ℃变性5 min，样品保存在−80 ℃备用。每孔加20 μL样品到SDS-PAGE凝胶上进行电泳（碧云天），待目的条带分离后将蛋白电转到聚偏二氟乙烯膜上，电转完成后将膜放到5%脱脂奶粉中室温封闭2 h，随后加入抗IL-1β、caspase-1、NF-κB/p65、磷酸化（p）-NF-κB/p-p65、GAPDH抗体（1∶1000，CST）4 ℃下孵育过夜。 1×TBST溶液清洗3次，加入辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育1 h，1×TBST溶液清洗3次，使用超敏化学发光试剂盒（碧云天）曝光蛋白条带，并采集图像。Image J软件进行目的蛋白条带灰度分析，GAPDH为内参蛋白，目的蛋白与内参蛋白的灰度值比值为目的蛋白的相对表达量。
1.5. 细胞免疫荧光染色
实验分为空白对照组、100 nmol/L ATRA组、1 μmol/L ATRA组、10 μmol/L ATRA组。将巨噬细胞接种于4分隔35 mm共聚焦皿中，处理6 h后，体积分数为4%多聚甲醛固定30 min，PBS清洗3次，0.2% TritonX-100透化10 min，PBS清洗3次，5%牛血清白蛋白封闭30 min，加入p-NF-κB/p-p65抗体(1∶1000，Abcam) 4 ℃避光孵育过夜。次日加入荧光二抗（1∶1000，博奥森）室温避光孵育1 h，PBS清洗3次，DAPI染色5 min，PBS清洗3次，共聚焦荧光显微镜拍摄图像。
1.6. 统计学方法
使用Graphpad Prism7.0进行统计分析，采用单因素方差分析比较多个组间统计学差异，采用t检验分析两组之间的统计学差异，P<0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1. 生物信息学分析结果
根据筛选标准，ATAR组中共筛选出140个DEGs，其中上调表达基因71个，下调表达基因69个（表2），所有DEGs聚类分布热图见图1A。KEGG通路分析表明71个上调表达基因参与炎症相关的信号通路，如白介素-17（IL-17）信号通路、肿瘤坏死因子（TNF）信号通路和细胞因子—受体相互作用通路（图1B）。GO功能分析证实上调基因参与IL-1β的产生、炎症反应、免疫反应、中性粒细胞的趋化等生物学过程（图1C）。71个上调表达基因中共有24个基因被筛选到PPI网络中，其中有6个核心基因，分别为白介素1α（IL-1α）、白介素1β（IL-1β）、细胞间粘附分子-1（ICAM-1）、趋化因子配体2（CCL2）、趋化因子配体20（CCL20）、白介素8（CXCL8）（图1D）。
表 2. The DEGs included 71 upregulated genes and 69 downregulated genes.
DEGs包括71个上调基因和69个下调基因
| DEGs | Gene name |
| The upregulated genes were arranged in log2FC order from large to small, and the down-regulated genes were arranged in log2FC order from small to large. | |
| Up-regulated genes | H2AC19, BPI, KLK6,PTGES, IL31RA, STC1, ITGA1, EFNB2, ANGPTL4, ST6GALNAC5, IL1A, HLA-DMB, SCG2, HIC1, CCL20, LRRC32, CYP26B1, CD300LB, IL1B, CCL2, ALOX5AP, THBD, SLA, ETV7, RAB3C, LTBP3, IFI44L, MLPH, ABCA1, TDO2, GBP4, LOC400499, CXCL8, SH3BGRL2, SEMA6B, BAALC, CHST15, FRMD3, RCAN2, ATP9A, STOX2, MAP2, CYFIP2, PLAAT4, HIVEP2, LOC107986113, DCSTAMP, ANKRD35, CNR1, SELENOP, PLS1, SMAD3, NR2F1, NDFIP1, SYT2, C10orf105, IL15RA, ALX4, PIK3CG, PLK3, GDF15, ICAM1, FAM20C, CHST7, DSE, CEBPB, BATF2, SLC5A3, LILRA1, CYTH3, MRPS6 |
| Down-regulated genes | OLFM3, STXBP6, GRXCR2, EMP3, COL11A1, S100A3, SLC13A3, CACNB4, ZBTB16, PBX1, ROBO4, UNC5A, VIPR1, HSPB7, SEPTIN4, HTR2A, FAM184B, GPR88, C2CD4C, CX3CR1, MMP12, CSPG4, LMO4, RAB6B, IL1R1, S100A6, FA2H, SLC12A8, NCR3LG1, HCK, SDC2, S100A4, CHST13, LGALS1, PLP2, C2orf92, AHNAK, EHD2, KCNIP3, ITGA7, PTPRK, TMPRSS9, CFAP251, MMP8, RET, PRELID2, SLC17A7, CAPN2, SYNE3, MYEOV, FKBP5, KCNC4, IFNGR1, AGRN, SCIN, C3orf80, MMP17, MUC1, DCBLD1, PTK2B, KIFC2, TNNT1, ITGA9, AHNAK2, TSC22D3, CERCAM, ANXA2, PFKP, NRBP2 |
图 1.
Bioinformatics analysis of differentially expressed genes (DEGs)
差异表达基因的生物信息学分析
A: Heat map of DEGs between the control and the ATRA groups, with red representing upregulated genes and green representing downregulated genes; B-C: KEGG and GO analysis of upregulated genes; D: Protein-protein interaction networks (PPI), with labels for the top six genes ranked according to the degree of nodes.
2.2. PPI中核心基因的FPKM表达
与空白对照组相比，ATRA促进了巨噬细胞中IL-1α、ICAM1、IL-1β、CCL2、CCL20及CXCL8的表达，变化倍数分别为3.9、1.2、2.7、2.6、2.9、1.9。其中IL-1α的FPKM表达量最低，FPKM<1；IL-1β的FPKM表达量最高，FPKM>170（图2）。综合GO功能分析中ATRA参与IL-1β的产生（图1C），提示IL-1β可能是ATRA的下游靶基因。
图 2.
FPKM of key genes represented in the PPI(n=3)
PPI中核心基因的FPKM表达（n=3）
*P<0.05, ***P<0.001.
2.3. ATRA对IL-1β的影响
使用不同浓度梯度的ATRA处理巨噬细胞24 h后，qRT-PCR结果表明相较于空白对照组，高浓度ATRA促进IL-1β mRNA的表达（P<0.05）（图3A），Pearson相关分析显示，ATRA浓度与IL-1β表达水平呈正相关（r=0.894, P<0.01），Western blot结果表明ATRA不仅促进IL-1β前体蛋白的表达，而且促进成熟的IL-1β（即cleaved IL-1β）蛋白表达（图3B～3D）。
图 3.
Expression of IL-1β in macrophages after ATRA treatment(n=3)
ATRA处理后巨噬细胞中IL-1β的表达（n=3）
A: mRNA expression of IL-1β in macrophages after ATRA treatment for 24 h; B-D: Western blot and protein quantification of IL-1β and cleaved IL-1β in macrophages after ATRA treatment for 24 h. *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001.
2.4. ATRA对NF-κB信号通路的影响
ATRA处理巨噬细胞6 h后，相对于空白对照组，Western blot表明ATRA促进了p-NF-κB和NF-κB的蛋白表达（图4A、4B、4C），细胞免疫荧光染色表明ATRA促进了巨噬细胞中p-NF-κB的核转移，表明NF-κB信号通路被激活（白箭头，图4D）。这些结果提示ATRA可能通过NF-κB信号通路促进炎症因子IL-1β的表达。
图 4.
The effect of ATRA on NF-κB signaling pathway in macrophages(n=3)
ATRA对巨噬细胞中NF-κB信号通路的影响（n=3）
A-C: Western blot and protein quantification of p-NF-κB and NF-κB in macrophages after ATRA treatment for 6 h; D: Immunofluorescence images of p-NF-κB translocation in macrophages after ATRA treatment for 6 h (blue: DAPI; red: p-NF-κB; white arrows pointing to nuclear translocation of p-NF-κB); *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001.
2.5. ATRA对caspase-1的影响
ATRA处理巨噬细胞24 h后，qRT-PCR显示相较于空白对照组， caspase-1 mRNA表达增加（P<0.05）（图5A），Western blot显示caspase-1蛋白表达也明显增加（图5B～5C），表明ATRA促进了巨噬细胞中caspase-1的表达。图3B中成熟的IL-1β表达明显升高，提示ATRA可能通过激活caspase-1促进成熟IL-1β的分泌。
图 5.
The effect of ATRA on the expression of caspase-1 in macrophages(n=3)
ATRA对巨噬细胞中caspase-1表达的影响（n=3）
A: mRNA expression of caspase-1 in macrophages after ATRA treatment for 24 h; B, C: Western blot and protein quantification of caspase-1 in macrophages after ATRA treatment for 24 h. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001.
3. 讨论
综合本研究中的生物信息学分析和实验结果，证明ATRA能促进巨噬细胞中IL-1β的表达。近年来研究表明炎症小体与IL-1β的产生密切相关，初步合成的IL-1β是没有生物活性的前体蛋白，经炎症小体中的caspase-1剪切成熟后才能分泌到胞外。炎症小体是一个多蛋白复合物，包括胞质传感器、衔接蛋白和caspase-1前体（procaspase-1）[13]。炎症小体的激活通常需要两种信号，即启动信号和激活信号。启动信号如NF-κB信号通路的激活会促进炎症小体的传感器、IL-1β和IL-18的表达上调；激活信号会触发炎症小体的组装，形成传感器、衔接蛋白和procaspase-1复合物，之后procaspase-1溶解为具有酶活性的caspase-1，活化的caspase-1剪切IL-1β和IL-18前体蛋白形成成熟的IL-1β和IL-18[14]。本实验ATRA组中成熟的IL-1β表达呈浓度依赖性升高，caspase-1的mRNA和蛋白表达也均明显升高，提示ATRA可能激活了炎症小体中的caspase-1从而促进了成熟IL-1β的表达，具体的机制尚需要后期研究。
NF-κB是介导基因转录调控的蛋白家族，在固有免疫和适应性免疫的宿主防御中发挥重要作用，其转录活性受到多种胞内胞外信号的调控。在胞质中，NF-κB通常与NF-κB抑制蛋白（IκB）结合处于非活性状态，受到胞外信号刺激后IκB被激活，与NF-κB解聚，NF-κB二聚体磷酸化并发生核转移，促进靶基因的转录[15]。NF-κB信号通路参与多个生物学过程，包括氧化应激、炎症因子的释放、凋亡、炎症小体的激活等，该通路是炎症反应的主要介导者，可调节炎症因子IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α的表达[16]。本实验中ATRA组中IL-1β表达升高，NF-κB磷酸化并发生了核转移，提示ATRA可能通过NF-κB信号通路促进了炎症因子IL-1β的表达。NLRP3炎症小体是目前研究最多的炎症小体，NLRP3来源的IL-1β是慢性无菌性炎症的主要驱动因素。NF-κB信号通路作为炎症小体的启动信号之一可调控NLRP3的转录，促进成熟IL-1β的表达，一些抗炎物质通过抑制NF-κB/NLRP3炎症小体信号轴抑制IL-1β的表达，抑制炎症反应[17-19]，那么，ATRA是否通过NF-κB/NLRP3炎症小体信号轴促进IL-1β的表达，本实验没有进行更深的研究，后期需要使用NF-κB信号通路的抑制剂BAY11-7082和NLRP3炎症小体的抑制剂MCC950进一步证实。
另外，本研究中生物信息学分析显示ATRA处理巨噬细胞后黏附分子ICAM-1表达升高，而其他与淋巴细胞迁移相关的黏附分子如ICAM-2、VCAM-1、Mad等未见明显变化，提示ATRA可能特异性促进ICAM-1的表达。此外，ATRA组中趋化因子CXCL8、CCL2、CCL20的log2FC值均大于2，CCL20的log2FC值最大，CXCL8的log2FC值最小。趋化因子的主要作用是参与白细胞的发育、分化和迁移，综上ATRA可能通过增加THP-1来源的巨噬细胞的趋化性促进其迁移。最后，ATRA组中炎症因子IL-1α的表达也明显升高，IL-1α和IL-1β结构相似，共享一个受体IL-1R1，IL-1α在体内的存在形式较多，包括IL-1α前体、分泌型、膜型和propiece，因此IL-1α的功能也较多，在本实验中没有进一步深入的探究。
维生素A近百年一直被认为是维持免疫系统正常功能的必要营养素，对抵抗感染至关重要，向孕妇和幼儿补充维生素A甚至能降低儿童死亡率[20]。但是，维生素A必须代谢为ATRA才能在感染部位发挥免疫效应，因此ATRA在免疫调节方面的作用也引起越来越多的关注。体外实验研究表明ATRA具有免疫增强作用，在微生物感染过程中，ATRA能显著增强单核细胞中NF-κB的活性，增加IL-1β和TNF-α的表达，促进单核细胞的促炎症反应[9, 21]。另外，ATRA已被证明对自身免疫性疾病包括系统性红斑狼疮[22]、溃疡性结肠炎[23]、免疫性血小板减少症等[24]有一定的疗效。肿瘤免疫治疗方面ATRA主要用于分化治疗APL，不可逆地改变瘤细胞的表型，抑制肿瘤的发展，但也有研究表明小鼠肉瘤模型中，免疫抑制性的肿瘤微环境能诱导肿瘤细胞产生ATRA，促进肿瘤内单核细胞分化为免疫抑制性巨噬细胞，从而促进肿瘤的发展[25]。综上所述，ATRA对于免疫系统的影响复杂，本实验仅探究了体外生理状态下ATRA对巨噬细胞的作用，在微生物等病原体存在的病理情况下以及体内实验中ATRA如何发挥免疫调节作用还需要进一步探索。
通过测序和体外实验，本研究首次明确了ATRA呈浓度依赖性促进巨噬细胞中炎症因子IL-1β的表达和分泌，通过Western blot和免疫荧光染色，本研究表明ATRA激活了巨噬细胞中NF-κB信号和caspase-1，提示ATRA可能通过NF-κB信号和caspase-1促进巨噬细胞中IL-1β的表达，为ATRA对巨噬细胞的免疫调节研究提供了实验依据。本研究局限性在于无体内实验，课题组后续将建立动物模型，进一步验证具体的分子学机制。
* * *
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
Funding Statement
国家自然科学基金面上项目（No. 319770783）、重庆市医学重点学科建设项目（2011年，No.55，《牙体牙髓病学》）、重庆市教育委员会重点项目（No.KJZD-K201900402）资助
Contributor Information
莉 郭 (Li GUO), Email: 1160356198@qq.com.
德琴 杨 (De-qin YANG), Email: yangdeqin@hospital.cqmu.edu.cn.
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