黄酮类化合物纳米晶体的制备及应用研究进展

Abstract

黄酮类化合物具有抗氧化、抗炎、抗癌等多种药理作用，但由于其溶解度低、生物利用度较低，临床应用受到了极大限制。纳米晶体技术可通过降低难溶性黄酮类化合物的粒径，显著增加其溶出度，改善其生物利用度，从而解决黄酮类化合物的递送困难。本文概括了黄酮类化合物纳米晶体稳定剂的筛选与制备方法，并对黄酮类化合物纳米晶体应用于口服、注射、经皮等多种给药途径进行综述，以期为黄酮类化合物纳米晶体递送系统的进一步研究提供参考。

1. 黄酮类化合物纳米晶体的制备

1.1. 筛选黄酮类化合物纳米晶体稳定剂

纳米药物微粒表面较高的自由能会导致药物不稳定，由于这种表面张力，活化能较低，导致制剂热力学不稳定。因此，在制剂中加入稳定剂不仅能减少药物颗粒的团聚和聚集，还可以减少陈化^［21］，见图1。可以单独使用不同的表面活性剂，也可以与药物以不同比例组合使用，药物与稳定剂的比例一般在1∶20到20∶1之间，在许多处方中都要进行优化。药物纳米晶体制备中常用的稳定剂主要包括三类：常用的离子型表面活性剂有卵磷脂、十二烷基硫酸钠、十二烷基磺酸钠；非离子型表面活性剂有吐温-80、泊洛沙姆等；高分子聚合物有聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、TPGS、羟丙基甲基纤维素等。不同稳定剂与纳米晶体之间的稳定作用机制不同，如带电荷的表面活性剂或高分子聚合物可通过静电排斥防止颗粒团聚；还有一些高分子聚合物或非离子型表面活性剂则是覆于药物纳米粒表面，通过空间位阻产生的渗透压使纳米粒分离而产生稳定作用。联合电荷相斥和空间位阻两种机制可以提供足够大的粒子间排斥力，阻止粒子聚集，使制剂粒径更小，具有更好的稳定性^［22］。但目前未能对黄酮类化合物纳米晶体的稳定剂类别、用量处方形成系统性的筛选规律，所以稳定剂筛选以排除法为主^［23］。不同黄酮类化合物纳米晶体所用稳定剂如表1所示。

图1. 纳米晶体的团聚现象及稳定剂的作用.

黄色圆圈代表黄酮类化合物纳米晶体，绿色线条表示空间位阻效应，蓝色电荷表示电荷相斥原理. 稳定剂对纳米晶体的作用可通过空间位阻、电荷相斥或两种机制联合来阻止粒子聚集变大.

表1.

黄酮类化合物纳米晶体的制备方法和稳定剂

黄酮类 化合物	药 物	纳米晶体制备方法	稳定剂	参考文献
黄酮醇	槲皮素	高压均质、球磨、气穴沉淀	5%吐温-80	［24］
		NanoEdge技术	TPGS	［25］
	杨梅素	NanoEdge技术	TPGS、大豆卵磷脂、大豆卵磷脂+TPGS、羟丙基β环糊精+TPGS	［26］
	芦丁	高压均质	0.2% SDS	［27］
黄酮	芹菜素	SmartCrystal技术	1.0% Plantacare 2000® UP	［28］
		超声微量沉淀法	0.25% PVP+TPGS	［29］
	黄芩素	NanoEdge技术	0.3%吐温-80	［30］
	木犀草素	高压均质	1% SDS	［31］
	芦丁	高压均质	0.2% SDS	［32］
	叶黄素	高压均质	1.0% Plantacare 2000® UP	［33］
		反溶剂沉淀-超声法	0.08%卵磷脂（w/v）	［34］
黄烷酮	橙皮素	高压均质	1%泊洛沙姆188	［35］
	橙皮苷	SmartCrystal技术	1%泊洛沙姆188	［36］
	橙皮苷	高速剪切联合高压均质法	0.1%茶皂素	［37］
	柚皮素	沉淀-超声法	0.5%~1.5% TPGS	［38］
异黄酮	大豆苷元	介质研磨法	1%泊洛沙姆407+1% PVP K30；0.5% SDS+1%泊洛沙姆407+1% PVP K30	［39］
		沉淀法、高压均质、沉淀法联合高压均质	0.04%泊洛沙姆188+0.03%卵磷脂+0.015%聚乙烯醇+0.015% SDS	［14］
	葛根素	微量化介质研磨法	0.5%卵磷脂+0.25%羟丙基甲基纤维素E15	［40］
花青素	桑葚花青素	沉淀法	玉米醇溶蛋白	［41］

NanoEdge技术：反溶剂沉淀法联合高压均质；SmartCrystal技术：介质研磨联合高压均质. TPGS：D-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯；SDS：十二烷基硫酸钠；PVP：聚乙烯吡咯烷酮.

采用自下而上技术制备纳米晶体时，稳定剂的种类和用量可影响晶体的形成和粒径的大小^［42］。Singh等^［43］采用沉淀超声法制备柚皮素纳米混悬液，选用胆酸钠、十二烷基磺酸钠、聚乙二醇、吐温-80、泊洛沙姆188和TPGS不同类型的表面活性剂和聚合物筛选稳定剂，发现选用TPGS制备的纳米混悬液粒径最小，其次是泊洛沙姆188、吐温-80、聚乙二醇、十二烷基磺酸钠和胆酸钠。这可以归因于TPGS的化学结构，其包含亲水极性尾（聚乙二醇）和疏水烷基头（琥珀酸生育酚）具有较高的表面活性和固有的增溶特性。比较泊洛沙姆188和吐温-80的化学结构，发现泊洛沙姆188包含两个具有中心疏水部分的亲水性末端，而吐温-80只包含一个亲水性末端，所以泊洛沙姆188比吐温-80效果更好。另外，随着表面活性剂浓度的降低，纳米粒的粒径增大，这可能是由于在低浓度表面活性剂作用下，柚皮素纳米晶体疏水粒子分散性差，容易形成团聚所致。

而采用自上而下技术制备纳米晶体时，稳定剂的种类对黄酮类化合物的影响相比自下而上技术小。如采用高压均质法制备纳米晶体时，稳定剂的种类和用量仅影响混悬液储存期间的物理化学稳定性，并不影响生产过程中制剂的粒径^{［42，44］}。制剂的粒径是由药物本身的性质、机器的压力以及循环次数等参数决定的。如Mishra 等^［45］采用高压均质法制备橙皮素纳米晶体，固定仪器的参数及循环次数，发现分别制备以泊洛沙姆188、菊粉月桂基氨基甲酸酯（Inutec SP1）、癸基葡糖苷（Plantacare 2000）和吐温-80为稳定剂的条件下获得纳米晶体的粒径均约300 nm，由此可见药物粒径的大小主要取决于高压均质过程中的压力、循环次数和药物晶体本身的硬度，稳定剂对于粒子大小的影响可以忽略不计^［46］。同样的，刘佳丽^［47］采用高压均质法制备木犀草素纳米晶体，分别考察了聚乙烯吡咯烷酮K12、聚乙烯吡咯烷酮K30、聚乙烯吡咯烷酮K60、聚乙烯吡咯烷酮K90、TPGS、十二烷基硫酸钠、羟丙基甲基纤维素E5和泊洛沙姆188等不同稳定剂对木犀草素晶体的影响，发现稳定剂对木犀草素纳米晶体的粒径和多分散性指数无显著影响；胡菲^［48］采用介质研磨法分别用泊洛沙姆407、羟丙基甲基纤维素E15和甘草酸作为稳定剂，均可以制备得到稳定且粒径为200 nm左右的槲皮素纳米晶体，但这三种纳米晶体的药动学参数存在显著差异，表明稳定剂种类可能会影响外排转运蛋白活性及细胞渗透性等，从而影响药物的口服吸收。因此，在筛选黄酮类化合物纳米晶体的稳定剂时，除粒径外，还需考虑其与体内吸收之间的关系^［49］。

由于纳米晶体通过减小粒径提高体内吸收的量是有限的，纳米晶体药物所带的电荷、形态、晶型也均能影响体内的吸收机制^［50］。使用不同的表面活性剂稳定制剂可改变其理化性质，影响药物在体内的吸收。胆酸钠、十二烷基硫酸钠或壳聚糖等静电稳定剂可以改变Zeta电位，增强药物的生物黏附性；羟丙基甲基纤维素具有较好的黏膜黏附能力^［51］，可以增加黄酮化合物纳米晶体在小肠壁的黏附，延长滞留时间，从而增加纳米晶体的小肠吸收；而TPGS、泊洛沙姆407及甘草次酸能够抑制P糖蛋白，影响纳米晶体在体内的吸收^［49］，甘草酸还可以增强细胞膜的渗透性^［52］，稳定剂对外排转运体活性及细胞渗透性作用的强弱可能是其药动学参数存在差异的主要原因。Hong等^［26］发现，相比杨梅素原料药，TPGS、大豆卵磷脂、大豆卵磷脂+TPGS和羟丙基β环糊精+TPGS为稳定剂所得纳米晶体的口服相对生物利用度分别为2.44、3.57、1.61和2.96，可见杨梅素纳米晶体在大鼠体内的口服生物利用度显著增加，且不同稳定剂对口服利用度产生的作用有所差异。

1.2. 黄酮类化合物纳米晶体的制备技术

在纳米晶体制备技术中，药物的结晶度或无定形的性质会因所采用的制备方法不同而发生改变^［53］。目前，纳米晶体的主要制备方法分为两大类，一类是自下而上技术（bottom-up），其通过过饱和溶液的沉淀原位生成纳米晶体，常用的方法有反溶剂、蒸发溶剂或降低温度，产生沉淀并形成具有小尺寸分布的纳米晶体^［54］；另一类是自上而下技术（top-down），通过机械力分散成小粒径药物^［55］，如湿法球磨法和高压均质法，但对于黄酮类化合物这类硬度较大的药物，如果不进行预处理直接使用高压均质法^［56-57］，可能有堵塞机器的风险。因此，一般可将两种方法进行组合联用^［58］，即对药物混悬液先进行预处理，然后再减小粒径，该方法可用于大规模上生产具有均匀粒径分布的黄酮类化合物纳米晶体。纳米晶体技术制备方法的优缺点见表2。

表2.

纳米晶体制备技术各方法的优缺点

技 术	方 法	优 点	缺 点
自下而上技术	反溶剂沉淀法	制备成本低；操作简单；平均粒径较低；适用热不稳定性药物	难以去除有机溶剂［55］；具有潜在毒性；药物在有机溶剂中的溶解度有限；难以规模化生产［59］
	超临界流体技术	技术简单，成本较低；使用的溶剂对环境无害；纳米晶体纯度高；无任何有机溶剂残留［60］	操作难度大，重复性不高；超临界流体消耗大；不适用于在超临界流体中不溶解的药物；难以投入应用和生产
自上而下技术	湿法球磨法	操作简单；不涉及有机溶剂；油水均不溶药物也适用；适用于小批量的实验室研究；若研磨腔体积大，可适用于放大生产	研磨介质损坏会造成的污染；受机器体积限制，不易大批量生产［61］
	高压均质法	可以实现均匀的粒度；不涉及有机溶剂；生产速度快；易于工业化生产	高能耗；设备成本高；高压均质机缝隙易堵塞；不适用于硬度太大的药物［62］
组合技术	NanoEdge技术	避免高压均质机容易堵塞的问题；增加了制剂的稳定性和保质期	工艺较复杂；不适合实验室摸索工艺［53］
	SmartCrystal技术	降低高压均质机缝隙堵塞的风险；粒径分布均匀；稳定性提高；易于工业化生产	工艺较复杂；设备要求高［63］

NanoEdge技术：反溶剂沉淀法联合高压均质；SmartCrystal技术：介质研磨联合高压均质.

1.2.1. 自下而上技术

在自下而上技术中，通过添加反溶剂或加入涉及高能过程的超临界流体等方式使药物沉淀。该方法是一种水溶胶技术，其基本原理是在超声波破碎或磁力搅拌作用下，导致药物浓度过饱和，使药物缓慢析出，通过调控各种因素使析出的药物形成纳米粒^［64］，如图2所示。在自下而上技术中，选择溶剂与反溶剂及其比例、加入速率、温度等是获得稳定均匀纳米晶体的关键参数。因为自下而上技术需要先使用大量有机溶剂，最后再去除有机溶剂，而去除这些有机溶剂在工业化生产时技术成本和物耗成本高，同时还会造成环境污染，所以自下而上技术多适用于在实验室阶段制备纳米晶体，在工业化生产中运用得很少。

图2. 自下而上技术制备纳米晶体流程.

自下而上技术可通过反溶剂沉淀法或超临界流体技术生成纳米晶体.

1.2.2. 自上而下技术

自上而下技术是使用介质研磨机或高压均质机对药物粗粉末进行机械研磨或均质形成混悬液，该混悬液以极高的速度或剪切力被迫通过小孔以减小晶体的粒径，如图3所示。与自下而上技术比较，该技术的主要优势在于不使用难以去除的有机溶剂。因此，制药工业中制备纳米晶体大多采用自上而下技术^［56］。其缺点是晶体生长不受控制、需要使用复杂和昂贵的仪器等。

图3. 自上而下技术制备纳米晶体流程.

黄色圆球代表黄酮类化合物原料药，经过介质研磨法或高压均质法处理后得到粒径较小的纳米晶体.

介质研磨法（也称珠磨法）是一类典型的湿法研磨技术（wet milling technology）^［61］，是迄今制药行业中最常用的药物纳米晶体生产方法。介质研磨法比较简单，可以在实验室中进行，是将原料药优选为微粉化形式，使其悬浮在含有稳定剂的分散介质中，在装有研磨介质（一般为氧化锆珠）的罐子里不断搅拌研磨，通过高速循环研磨，药物颗粒可以被研磨至纳米级别，最后得到纳米晶体。介质研磨法可以在制剂开发的早期阶段准备纳米混悬液，消耗最少的原料药进行稳定剂筛选，也可以扩展到工业化生产。Lestari等^［65］用介质研磨法制备了橙皮苷纳米晶体，从实验室小规模处理量仅为10 g的低能湿法球磨法，扩大生产使用高能湿法球磨法可达到2 kg的处理量，并且粒径均可达到160 nm左右，两种规模下所用稳定剂的种类及用量均相同，只需要控制研磨机的转速和研磨时间，就可以使实验室阶段的结果放大至产业化规模并保持产品质量的一致性。其缺点是由于研磨介质或研磨室的磨损，长期运行过程中容易造成难以去除的药物污染。

另一种常用方法是高压均质法。在高压均质机高压泵的作用下，药物混悬液在通过一个非常窄的缝隙中，流体的动态压力增加，而静压的降低在室温下达到水的沸点以下^［66］，通过与阀门组件的碰撞，产生剪切、冲击和空腔的三种效应，并获得纳米大小的药物颗粒^［67］。工作时均质压力从10 mPa到200 mPa不等，要送入腔体的起始物料必须通过气流粉碎进行微粉化，即小于25 μm，以避免均质间隙堵塞。此技术可得到分布较均匀的纳米粒，但黄酮类化合物这类硬度较大的药物需要先进行预处理，即对原料药粗粉末粉碎或研磨至小于50 μm，否则可能损坏或堵塞机器^［56-57］。

1.2.3. 组合技术

组合技术是联合使用自下而上技术和自上而下技术制备纳米晶体，首先进行预处理，即采用自下而上技术使药物溶液沉淀，随后再采用自上而下技术，这样有助于克服上述技术如高压均质机容易堵塞等缺点。

目前，组合技术主要有NanoEdge技术和SmartCrystal技术^［62-63］。NanoEdge技术是将反溶剂沉淀法与高压均质法相结合，沉淀过程中通过高剪切力进行均匀，可以自发地将亚稳态（非晶态或部分非晶态）的纳米沉淀物转化成更稳定的晶态，同时避免了高压均质机容易堵塞的问题，从而增加了制剂的稳定性和保质期^［68］，提高利用率。而SmartCrystal技术是将各种预处理步骤与最后的高功率微波步骤结合在一起，来获得均匀纳米晶体的一系列技术^［60］。可以使用的预处理步骤包括高压空化沉淀、喷雾干燥、冻干、介质研磨和转子-定子高速剪切等，使得粉末更容易纳米化^［62］。组合技术有利于更快地生产：易于扩展，稳定性提高，并成为生产纳米晶体的放大选择，并且实现工业化生产^［53］。Al Shaal等^［69］采用SmartCrystals技术将20 g实验室规模的芹菜素纳米晶体放大150倍，达到生产规模为3 kg的中试水平，这两种生产工艺制备的芹菜素纳米晶体粒径和多分数系数相似，并且稳定性良好。因此，组合技术可实现黄酮类纳米晶体的工业化生产。

2. 黄酮类化合物纳米晶体的应用

纳米晶体的制备工艺简单，可实现产业化，在改善黄酮类化合物的生物利用度和提高药效等方面发挥着重要作用。相比脂质体和聚合物纳米粒等纳米递送系统，纳米晶体具备更高的载药能力，所以能应用于如口服、注射、经皮等多种给药途径。

2.1. 应用于口服途径

口服为最为广泛的给药途径，但大多数黄酮类化合物通常口服生物利用度较低，这可能是由于其溶解性差、渗透性低和稳定性差所致，严重降低其疗效。如黄酮和黄酮醇的第2位和第3位之间的双键易于形成平面结构，导致分子排列紧密，因此溶剂分子很难穿透其分子结构^［70］，这导致了其水溶性差。如杨梅素，一种典型的具有平面结构的黄酮醇，在水中的溶解度仅为16.60 μg/mL，在大鼠体内的口服生物利用度只有9.62%^［71］。Hong等^［26］将杨梅素制成纳米晶体，发现杨梅素在TPGS、大豆卵磷脂、大豆卵磷脂+TPGS或羟丙基β环糊精+TPGS等四种不同稳定剂制成的杨梅素纳米晶体中的饱和溶解度从纯杨梅素的6.23 mg/mL分别增加到399.63、367.15、466.28和267.90 mg/mL，其最大血药浓度分别比杨梅素原料药高出约1.54、2.25、1.29和1.59倍，可见纳米晶体显著提高了杨梅素的口服相对生物利用度。

此外，由于过量的游离羟基很容易在肠细胞中被葡萄糖醛酸化和硫酸化，然后被一些外排转运蛋白排出，胃肠通透性随着类黄酮中羟基数的增加而减少，导致其口服吸收不良且不稳定^［72］。柚皮素制成粒径为118 nm的纳米晶体后在大鼠体内的口服生物利用度显著提高，相比原料药混悬液，其最大血药浓度和药时曲线下面积分别增加2.14和3.76倍^［38］。研究表明，葛根素纳米晶体、金丝桃苷纳米晶体均可显著增加黄酮类化合物的最大血药浓度和药时曲线下面积，改善其口服生物利用度^［73-74］。推测原因是纳米晶体对胃黏膜的黏附性延长了其在胃肠道内的滞留时间，增加其在胃肠道中的吸收，从而提高药物的口服生物利用度^［73-74］。

为方便给药，还可进一步通过加工为片剂、胶囊剂等，实现口服给药领域的商品化。Mauludin等^［32］用高压均质法制备了芦丁纳米晶体，用0.2%十二烷基硫酸钠作为稳定剂，制备了芦丁纳米晶体冻干粉，再将芦丁纳米晶体冻干粉采用直接压片法制成片剂，所得芦丁纳米晶体片的溶出速率优于市售芦丁微晶片。

2.2. 应用于注射途径

药物通过注射给药方式在体内作用迅速，对靶向治疗或急症疾病具有更好的疗效。与黄酮类化合物的传统注射剂比较，纳米晶体较小的粒径减少了阻塞毛细管的风险，提高注射给药的安全性^［75］；而且纳米晶体具有较高的载药量，可以满足需要高剂量使用的药物的注射需求。

纳米晶体可以改善黄酮类化合物注射给药的生物利用度，也可以影响其组织分布行为^［74］。于世龙^［76］将芹菜素纳米晶体按40 μg/g进行大鼠尾静脉注射，发现相比同剂量芹菜素原料药混悬液，大鼠血浆中的药时曲线下面积增加了7.14倍，最大血药浓度增加17.78倍。Ao等^［77］制备了粒径为261 nm的羟基芫花素纳米晶体，MCF-7荷瘤小鼠的体内抗乳腺癌肿瘤实验显示，静脉注射大剂量羟基芫花素纳米晶体（40 mg/kg）抑制肿瘤体积增长效果最佳，其抗肿瘤效果具有明显的剂量依赖性。此外，小鼠对更大剂量羟基芫花素纳米晶体（360 mg/kg）也表现出良好的耐受性，在急性毒性试验中小鼠存活率为100%，相比原料药更为安全有效。徐浩等^［25］基于4T1荷瘤小鼠模型发现，槲皮素纳米晶体按45 mg/kg静脉注射时抑瘤率高达56.78%，而按70 mg/kg灌胃给药时抑瘤率仅为29.94%，可见即便是纳米晶体，口服给药的生物利用度也很有限，其原因主要是槲皮素存在强烈的肠代谢，释放出来的药物很大比例在吸收之前就被肠道的酶系统代谢。所以纳米晶体的静脉给药可避开肠道代谢，提高生物利用度，在临床应用中具有可行性。

2.3. 应用于经皮途径

纳米晶体能有效提高黄酮类化合物的溶解度，改善黄酮类化合物的经皮渗透性能，从而提高局部给药的生物利用度^［78］，若制成合适的外用剂型（如凝胶剂），可利于透皮给药应用^［79］。

光甘草定是一种可有效抑制酪氨酸酶来达到美白效果的黄酮类化合物。采用反溶剂沉淀法结合高速剪切制备光甘草定纳米晶体，再加入卡波姆制得载药纳米结晶凝胶剂，其体外稳态透皮速率为25.92 μg·cm^－2·h^－1，较普通混悬液凝胶剂和物理共混液凝胶剂（分别为2.41和3.49 μg·cm^－2·h^－1）均有显著提高^［80］。芦丁、芹菜素和橙皮苷等具有抗氧化活性的黄酮类化合物纳米晶体在皮肤保护、抗衰老等化妆品中广泛运用^［35］。如芦丁是常用的抗氧化剂，由于其水溶性差，在化妆品中的使用受到限制。为了增加芦丁的饱和溶解度并改善渗透性，Pyo等^［81］通过SmartCrystal技术制备芦丁纳米晶体，再将其掺入5%亲水性羟丙基纤维素凝胶中；采用自由基清除实验测定纳米晶体的抗氧化活性，发现超过60%的自由基在5 min内被300 nm的芦丁纳米晶体凝胶中和，其中和活性超过芦丁原料药并达到了90%，可见其能渗透到皮肤的角质层，而33 µm的芦丁原料药粉末仅有30%被中和。Mitri等^［33］采用高压均质法制备了叶黄素纳米晶体，其饱和溶解度相比原料药提高了26.3倍，将叶黄素纳米晶体制成微丸，体外释药效果提高3~4倍；经过冷冻干燥后加入乳膏和凝胶中，以硝酸纤维素膜为体外模型，发现叶黄素纳米晶体的透过率是原料药的14倍。综上，药物的溶出速率和饱和溶解度是决定药物生物利用度和经皮渗透性能的主要因素。

3. 结 语

黄酮类化合物在各种疾病治疗方面展现出巨大的潜力，然而其低溶解度和低生物利用度是药物递送过程中的主要障碍，纳米晶体可增加黄酮类化合物的溶解度和溶出速率，可通过口服、注射、经皮给药途径实现治疗作用。各种给药途径均能显著改善黄酮类化合物的生物利用度，增强其药效。

但是，黄酮类化合物纳米晶体技术也存在一些问题，如纳米晶体的工业化生产是该技术的一大挑战，很多研究只停留在实验室阶段，未能实现工业化生产，使得目前黄酮类化合物纳米晶体开发上市的药物数量较少；纳米粒具有在肝脏聚集的特殊性，而肝脏又是人体代谢药物的主要器官，当大量药物聚集肝脏部位，有可能对肝组织产生毒性作用，所以纳米晶体是否有肝损伤或对其他组织的毒性作用需要在实验室阶段即开展研究。

未来黄酮类化合物纳米晶体可与一些新技术联合使用以扩大应用范围，如引入荧光杂化纳米晶体技术，运用荧光追踪技术可观察药物在体内的组织分布，探索其在体内的吸收机制^［82］；与仿生技术联合使用，可提高药物靶向性，减少副作用，进一步提升药效。相信随着纳米晶体技术研究的深入，黄酮类化合物纳米晶体将会得到更多的利用和发展。

利益冲突声明

所有作者均声明不存在利益冲突

Conflict of Interests

The authors declare that there is no conflict of interests