基于巯基-烯点击化学制备丝素蛋白/透明质酸复合水凝胶

Abstract

目的

以丝素蛋白和透明质酸为原料设计并制备医用天然聚合物水凝胶。

方法

对丝素蛋白和透明质酸进行巯基化及双键化改性，在紫外光条件下，利用巯基-烯点击聚合快速固化成胶。通过氢-1核磁共振波谱法表征改性丝素蛋白及透明质酸的接枝率；流变学测试表征水凝胶的凝胶点；扫描电镜观察水凝胶的内部微观结构；压缩测试表征力学性能；质量法测定溶胀率及降解率；将水凝胶与细胞共培养，通过乳酸脱氢酶法测定细胞毒性，漂浮计数法测定细胞黏附性并用扫描电镜及荧光显微镜观察凝胶表面的细胞生长与分化状况。

结果

改性后的丝素蛋白和透明质酸的官能团取代度分别为17.99%和48.03%。制备所得的丝素蛋白/透明质酸复合水凝胶的凝胶点为40~60 s，凝胶内部具有孔状结构，压缩强度达450 kPa且循环十次不破裂。复合水凝胶可吸收自身质量4倍甚至10倍的水。水凝胶可生物降解，35 d后的降解率达28%~42%。复合水凝胶的细胞毒性较弱，细胞黏附性较好，细胞在凝胶表面生长和分化状况良好。

结论

光固化丝素蛋白/透明质酸复合水凝胶能快速成胶、力学性能优异、生物相容性好，具有可调的溶胀率及降解度，在生物医学上具有一定的应用潜力。

水凝胶是由天然或合成聚合物组成的具有三维水膨胀网络的软材料^［1］。天然聚合物的水凝胶来源丰富、绿色环保、可生物降解，在伤口愈合、整形外科、再生医学、骨科疾病、诊断、植入式设备、组织工程和药物输送系统等较多生物医学应用中受到广泛关注^［2-6］。这种传统的高分子水凝胶存在成胶慢、力学性能弱等问题，而基于丝素蛋白与透明质酸的复合水凝胶在力学性能、保水性能以及生物活性等方面优于单一的水凝胶^［7］。

丝素蛋白是一种由家蚕生产的天然纤维蛋白，具有优异的力学性能和优良的生物学特性，已用于多种生物医学和生物技术中，包括伤口敷料、酶固定基质、血管假体、结构植入物、多孔海绵以及组织工程等^［8-16］。透明质酸是一种天然的、线性的内源性多糖，具有天然生物功能性、生物降解性、非免疫原性和多功能性^［17］。目前制备这类复合水凝胶的各种交联方法如超声诱导交联、酶促交联、添加小分子交联等存在成胶速度慢、力学性能难调、小分子交联剂有细胞毒性等问题。本研究以丝素蛋白和透明质酸为原料，通过紫外光引发点击反应，快速固化成型，设计出一种固化速率快、生物相容性好、机械性能优异的全生物质水凝胶，有望在生物医用方面发挥独特的作用与优势。

1. 材料与方法

1.1. 主要试剂与仪器

精品级蚕茧为杭州玖元丝绸文化有限公司产品；透明质酸钠（数均分子量为100 000）为山东丽阳生物科技有限公司产品；无水氯化钙、无水乙醇、氯化钠、氢氧化钠、DMF为国药集团化学试剂有限公司产品；MES、EDC、NHS、甲基丙烯酸酐、三（2-羰基乙基）磷盐酸盐、Irgacure 2959引发剂为阿拉丁试剂（上海）公司产品；GSH、无水碳酸钠为麦克林试剂（上海）公司产品；蛋白酶K为上海源叶生物科技有限公司产品；乳酸脱氢酶检测试剂盒为美国Thermo Fisher Scientific公司产品；小鼠胚胎成纤维细胞（NIH 3T3）和HUVEC来自中国科学院生物化学与细胞生物学研究所。

低温冷凝循环仪为德祥科技有限公司产品；冷冻干燥机为北京博医康实验仪器有限公司产品；LED台式紫外灯（365 nm，18 W）为中山紫固照明电器厂产品；核磁共振波谱仪为瑞士Bruker公司产品；台式扫描电镜为捷克Tescan有限公司产品；高级拓展流变仪为奥地利Anton Paar公司产品；透射电子显微镜为日本电子株式会社产品；高低温双立柱试验机为美国Instron仪器公司产品；倒置共聚焦显微镜为德国Leica公司产品。

1.2. 材料及水凝胶的制备

1.2.1. 合成SF-GSH

参照文献［18］报道的方法，称取10 g蚕茧于4 L 0.05 mol/L碳酸钠水溶液中煮沸30 min，捞出后重复上述步骤两次，将煮完的蚕茧用去离子水清洗后烘干得到脱胶蚕丝。将5.2 g脱胶蚕丝浸入体积约75 mL的氯化钙-乙醇-水（物质的量摩尔比为1∶2∶8）溶液中，70 ℃搅拌4 h得到丝素蛋白溶液。冷却后室温下7156×g离心6 min，除去不溶性杂质，将溶解的丝素蛋白盐溶液置于截留分子量3500透析袋中，于4 ℃去离子水中透析3 d。透析后的丝素蛋白水溶液用酸碱度值为6的0.1 mol/L MES水溶液（含0.05 mol/L氯化钠）调节酸碱度值。待酸碱度值稳定至6后，加入0.3 mol/L EDC和0.5 mol/L NHS，在室温下活化反应30 min，再加入0.18 mol/L GSH反应18 h，将反应液置于截留分子量3500的透析袋中，于4 ℃去离子水中透析2 d，冷冻干燥得SF-GSH。见图1。

图1. 巯基化丝素蛋白的制备.

EDC：1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；NHS：N-羟基琥珀酰亚胺.

1.2.2. 合成双键化透明质酸

参照文献［19］报道的方法，将1.8 g透明质酸溶于90 mL去离子水中，搅拌溶解，再加入57.6 mL DMF混合均匀，将其置于4 ℃的冷凝循环系统中，缓慢滴加2.88 mL的甲基丙烯酸酐，反应30 min。用1 mol/L氢氧化钠溶液缓慢调节酸碱度值至8~9并稳定无变化，待反应24 h后，加入0.9 g氯化钠进行破乳反应1 h。以400 mL的无水乙醇为沉淀剂，得到白色絮状沉淀，离心提取出白色沉淀，水复溶后用截留分子量7000的透析袋在室温下于去离子水中透析3 d，冷冻干燥得双键化透明质酸。见图2。

图2. 双键化透明质酸的制备.

1.2.3. 快速光固化制备SH-gel

在玻璃瓶中加入1 mL去离子水、50 mg双键化透明质酸、5 mg Irgacure 2959、1.5 mg三（2-羰基乙基）磷盐酸盐以及50 mg SF-GSH，搅拌溶解获得水凝胶前驱体液，在365 nm紫外灯照射下固化得到SH-gel-5。将SF-GSH的用量分别改为100、150、200 mg，其余配方不变，光固化得SH-gel-10、SH-gel-15、SH-gel-20。反应方程式见图3。

图3. 丝素蛋白/透明质酸复合水凝胶制备的反应示意图.

TCEP·HCl：三（2-羰基乙基）磷盐酸盐.

1.3. 材料及水凝胶的理化特性表征

1.3.1. ¹H-NMR表征SF-GSH和双键化透明质酸原料的合成与官能团取代度

称取10 mg样品溶于1 mL氘代水中，分别对合成的SF-GSH和双键化透明质酸进行¹H-NMR表征，根据峰面积计算SF-GSH和双键化透明质酸上的官能团取代度。

1.3.2. 旋转流变仪测定水凝胶的凝胶点

固化光源采用紫外光灯，液态固化过程设置应变固定为1%，频率固定为1 Hz。将水凝胶前驱体液置于样品台，开启测试并同时打开紫外灯，使用旋转流变仪扫描储存模量与损耗模量随时间的变化情况，测定凝胶点。

1.3.3. 扫描电镜观察水凝胶的内部微观形貌

将冷冻干燥之后的凝胶样品用液氮脆断，黏附在贴有导电胶的标准断面台上，表面进行喷金处理。设置扫描电压15 kV，调节放大倍率为50倍和100倍，用扫描电镜对样品断面的微观形貌进行表征。用Nano Measurer软件对扫描电子显微镜图进行处理，统计孔径分布。

1.3.4. 压缩测试表征水凝胶的力学性能

设置压缩形变量为85%，压缩速度为2 mm/min，取直径17 mm，高度4 mm的圆柱形水凝胶样品，用高低温双立柱试验机进行压缩测试。根据压缩的应力-应变曲线图，获得水凝胶的力学数据。测定水凝胶压缩循环性能时，设置压缩形变量为40%，压缩速度为2 mm/min，循环次数为10次。

1.3.5. 质量法表征水凝胶的溶胀性能和降解性能

将水凝胶样品冷冻干燥后准确称重，记为m _d。将其分别浸入10 mL 1×PBS溶液中，恒温37 ℃，测定干燥水凝胶的溶胀行为，每隔5、10、20、40、60、90、120、150 min取出，擦去多余的表面液体并称重，记为m _t（m ₁、m ₂、m ₃、m ₄、m ₅、m ₆、m ₇、m ₈）。37 ℃下继续浸泡24 h，取出擦干后称重，记为m _eq。根据溶胀实验结果，计算溶胀比、平衡溶胀比和平衡含水量^［20］。

$$\mathrm{溶胀}\mathrm{比}=\frac{m_{\mathrm{t}}-m_{\mathrm{d}}}{m_{\mathrm{d}}}\times \mathrm{100}\mathrm{\%}$$

$$\mathrm{平衡}\mathrm{溶胀}\mathrm{比}=\frac{m_{\mathrm{e}\mathrm{q}}-m_{\mathrm{d}}}{m_{\mathrm{d}}}\times \mathrm{100}\mathrm{\%}$$

$$\mathrm{平衡}\mathrm{含水}\mathrm{量}=\frac{m_{\mathrm{e}\mathrm{q}}-m_{\mathrm{d}}}{m_{\mathrm{e}\mathrm{q}}}\times \mathrm{100}\mathrm{\%}$$

取直径为17 mm，高度为4 mm的圆柱体水凝胶，用3 U/mL蛋白酶K的1×PBS溶液在37 ℃恒温摇床中降解。吸去表面多余水分，记录初始质量m ₀，将其置于12孔板中，每孔加入5 mL等量的蛋白酶K溶液，将孔板置于转速为100转/min的恒温摇床中，在第1、2、4、7、14、21、28、35天取出样品，吸去凝胶表面多余液体，记录各孔板中的样品质量m _t1，m _t2，m _t3，……，根据质量变化绘制降解曲线，每个样品设置重复实验三组，取平均值，并计算降解率^［21］。

$$\mathrm{降解}\mathrm{率}=\frac{m_{\mathrm{t}\mathrm{x}}-m_{\mathrm{0}}}{m_{\mathrm{0}}}\times \mathrm{100}\mathrm{\%}$$

1.4. 水凝胶的生物学特性表征

1.4.1. 乳酸脱氢酶细胞毒性检测表征水凝胶的细胞毒性

选用DMEM培养基作为阴性对照，10%十二烷基硫酸钠作为阳性对照组。取处于生长对数期的小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3，按5000个/孔置于96孔板中，采用100 μL含5%胎牛血清的DMEM培养基培养24 h，再将培养液换成24、48或72 h材料浸提液（将5%胎牛血清加DMEM培养基和水凝胶材料分别共培养24、48、72 h得到）进行培养。不同时间点的材料浸提液每组样品重复三孔，共计36孔。收集100 μL的培养基，离心除去细胞碎片，转移至96孔板上。接着将100 μL的反应混合物加入每个孔板中，加入乳酸脱氢酶检测试剂盒试剂，在37 ℃下孵育30 min，酶标仪490 nm下测定样品的吸光度值。

1.4.2. 漂浮计数法表征水凝胶的细胞黏附性

阴性对照选用空白培养基，材料每份重复三孔并取平均值。将NIH3T3细胞以5×10⁴个/mL接种于12孔板，并在每孔中加入含1.5 g/L碳酸氢钠、100 U/mL青霉素、10%胎牛血清和100 μg/mL链霉素的DMEM细胞培养基。置于37 ℃、5%二氧化碳下培养至细胞融合度为70%，24 h后对培养液中的细胞漂浮数进行计数。

1.4.3. 显微镜观察细胞在水凝胶表面的生长状况

细胞培养：将样品用75%乙醇浸泡12 h，再用PBS清洗两次，每次30 min，经紫外照射后于培养基中浸泡6 h，随后将其置于96孔板，HUVEC以1×10⁴个/孔铺于材料上，在37 ℃，5%二氧化碳条件下培养24 h。细胞固定：去掉培养基，每孔加入100 μL 4%的多聚甲醛室温固定30 min，用PBS清洗两次。然后在0.1% Triton X100中通透15 min，用PBS清洗两次。细胞固定后的样品用于扫描电镜观察。免疫荧光染色：细胞在4 ℃下于鬼笔环肽中过夜孵育染细胞骨架（红色），用PBS清洗两次；再在37 ℃下于重组抗磷酸化FAK（Y397）抗体中孵育1 h标记信号分子黏着斑激酶（绿色），用PBS清洗两次；最后用DAPI染细胞核（蓝色）。细胞经固定及免疫荧光染色后于倒置共聚焦显微镜下观察。

2. 结 果

2.1. 材料合成及水凝胶制备

2.1.1. SF-GSH和双键化透明质酸合成和官能团取代度

¹H-NMR图显示，SF-GSH出现四处特征信号，分别归属于亚甲基（a：δ=2.17；b：δ=2.56；c：δ=2.93~2.95）和次甲基（d：δ=3.84），表明丝素蛋白上成功接枝了GSH，见图4A。以丝素蛋白中络氨酸结构中苯环上的氢为基准峰，根据核磁积分面积，计算GSH在丝素上的取代度为17.99%。

图4. 巯基化丝素蛋白和双键化透明质酸的氢-1核磁共振波谱图.

A：巯基化丝素蛋白；B：双键化透明质酸.

¹H-NMR图中，双键化透明质酸相比透明质酸在δ=1.8、5.6和6.1处出现新峰，表明透明质酸主链成功接枝甲基丙烯酸酐，δ=5.6、6.1两峰对应甲基丙烯酸酐双键碳上的两个氢，δ=1.8处对应甲基丙烯酸酐上的甲基氢，见图4B。以透明质酸主链-NHCOCH₃上甲基氢为基准峰，根据核磁积分面积计算得出甲基丙烯酸酐在透明质酸上的取代度为48.03%。

2.1.2. SH-gel制备

通过紫外光引发的巯基-烯烃点击反应成功制备了SH-gel。SH-gel为半透明的胶体，SH-gel-5、SH-gel-10、SH-gel-15、SH-gel-20的透明度逐渐降低，见图5。结果提示，随着SF-GSH的增加，引入巯基增多，双键化透明质酸与SF-GSH的交联更为致密。

图5. SH-gel的外观.

SH-gel：丝素蛋白/透明质酸复合水凝胶.

2.2. SH-gel的理化性能

2.2.1. 凝胶点

SH-gel的流变学数据图见图6。随着紫外光照时间延长，双键与巯基迅速反应产生化学交联；当体系凝胶形成时，储能模量和损耗模量数据曲线发生交叉，相对应的反应时间即为凝胶点。SH-gel-5、SH-gel-10、SH-gel-15、SH-gel-20的凝胶点分别为65、62、52、43 s，提示SF-GSH加入越多，交联越快。

图6. SH-gel的流变学性能曲线.

SH-gel：丝素蛋白/透明质酸复合水凝胶.

2.2.2. 内部微观形貌

冷冻干燥后的水凝胶内部孔结构保留完整，均匀致密，见图7。SH-gel-5的孔径最大，随着SF-GSH含量的增加，孔径逐渐变小，SH-gel-5、SH-gel-10、SH-gel-15、SH-gel-20的孔径中位数分别为258、152、139、108 μm，提示随着SF-GSH含量的增加，SH-gel的交联程度在不断增加，得到的交联网络更加均匀致密。

图7. SH-gel的断面微孔形貌.

SH-gel：丝素蛋白/透明质酸复合水凝胶.

2.2.3. 压缩性能

SH-gel的压缩强度测试结果见图8A。不加SF-GSH的双键化透明质酸水凝胶、SH-gel-5、SH-gel-10、SH-gel-15、SH-gel-20的压缩强度分别为0.18、0.31、0.46、0.49、0.47 mPa，表明随着SF-GSH加入量的增加，压缩强度不断提高。五组水凝胶分别在44%、43%、47%、46%、48%形变处破裂，表明随着SF-GSH加入量的增加，水凝胶的韧性也有所增强。压缩循环测试结果见图8B~E，每个循环的曲线均可恢复到压缩原点，且十条曲线高度重合。结果表明，水凝胶具有良好的弹性及耐用性。

2.2.4. 溶胀性能

SH-gel四组样品均能快速溶胀，在20 min左右达到溶胀比的最高点，而后两个多小时内溶胀比基本保持不变，见图9。其中，SH-gel-5的溶胀比最高，为1050%，SH-gel-20的溶胀比最低，为400%。经过24 h恒温溶胀后，SH-gel-5、SH-gel-10、SH-gel-15、SH-gel-20的平衡溶胀比及平衡含水量均依次降低。提示随着SF-GSH加入量的增加，水凝胶交联密度提高，内部结构更加致密，从而限制环境溶液进入水凝胶内部，保水效果越差。

图9. SH-gel的溶胀性能.

A：SH-gel在磷酸盐缓冲液中不同时间的溶胀比；B：SH-gel在磷酸盐缓冲液中的平衡溶胀比和平衡含水量比较. SH-gel：丝素蛋白/透明质酸复合水凝胶.

2.2.5. 降解性能

SH-gel水凝胶在蛋白酶K催化下的降解曲线见图10，SH-gel-5、SH-gel-10、SH-gel-15、SH-gel-20的降解度依次下降。四组样品在第一周均呈现快速降解趋势，第二周和第三周稳定降解，最后两周降解速率明显变慢。SH-gel-5相比其他三组具有较快的降解速度，五周后降解率为42%，剩余质量百分比为58%；SH-gel-20五周后降解率为28%，剩余质量百分比为72%。

图10. SH-gel的降解曲线.

SH-gel：丝素蛋白/透明质酸复合水凝胶.

2.3. SH-gel的生物学性能

2.3.1. 细胞毒性及细胞黏附性能

培养24 h后，SH-gel四组样品均表现出较低的吸光度值；继续培养至48 h，吸光度值略有增加，但四组差别不明显；培养至72 h后，阴性对照组及阳性对照组的吸光度值分别为0.50和1.97，SH-gel四组吸光度值（分别为1.03、1.45、1.46和1.48）均小于阳性对照组，见图11。说明SH-gel细胞毒性较低。

图11. SH-gel的吸光度值比较（乳酸脱氢酶法）.

SH-gel：丝素蛋白/透明质酸复合水凝胶.

细胞黏附试验结果显示，SH-gel-5、SH-gel-10、SH-gel-15、SH-gel-20四组样品细胞漂浮数均为10³个/mL数量级，远远小于原孔板内总计投入的5×10⁴个/mL数量级，黏附细胞数约占投入细胞总数的97%、96%、91%、89%，说明四组SH-gel水凝胶均能黏附较多的细胞。

2.3.2. 生物相容性

SH-gel与HUVEC共培养72 h后，各组材料表面细胞生长情况良好，均有细胞黏附生长。其中，SH-gel-10表面细胞黏附生长情况最佳，均匀分布，贴壁生长；SH-gel-5表面细胞黏附分布略不均匀，但仍有明显的细胞黏附，见图12。免疫荧光染色结果显示，各组材料表面都有较多的细胞，分布均匀。其中，SH-gel-5、SH-gel-10两组样品的细胞生长和分化情况较好，与材料表面HUVEC黏附情况相符，见图13。结果提示SH-gel生物相容性较好。

图12. SH-gel与HUVEC共培养72 h后材料表面扫描电子显微镜图.

SH-gel与HUVEC共培养72 h后，各组材料表面细胞生长情况良好，均有细胞黏附生长，其中SH-gel-10表面细胞黏附生长情况最佳，均匀分布，贴壁生长；SH-gel-5表面细胞黏附分布略不均匀，但仍有明显的细胞黏附. SH-gel：丝素蛋白/透明质酸复合水凝胶；HUVEC：人脐静脉内皮细胞.

图13. SH-gel表面培养人脐静脉内皮细胞的免疫荧光染色图.

红色荧光代表材料促进细胞骨架构建和再生的能力，绿色荧光代表材料表面细胞生长黏附情况，蓝色荧光代表活细胞数及分布. 各组材料表面都有较多的细胞，分布均匀. 其中SH-gel-5、SH-gel-10组的细胞生长和分化情况较好. SH-gel：丝素蛋白/透明质酸复合水凝胶；DAPI：4$\mathrm{´}$，6-二脒基-2-苯基吲哚. 标尺=50 μm.

3. 讨论

丝素蛋白和透明质酸都是天然高分子材料，具有良好的生物学特性。丝素蛋白水凝胶虽力学性能优异但保水差、凝胶化过程难控，而透明质酸水凝胶保水性好但存在力学强度弱、降解过快等问题，复合水凝胶往往能够在一定程度上兼具两者的优点并克服各自不足^［22］。目前国内外已有很多两者单独制备成胶的研究，而将两者复合成胶相对较少。

目前，两种材料的水凝胶主要有三种交联策略，即物理交联（自组装、超声、剪切、电场、温度、酸碱度、有机溶剂）、化学交联（光聚合、化学交联剂）和酶促交联（酶有辣根过氧化物酶）^［23］。水凝胶很容易由水溶液通过物理交联形成，然而物理交联形成的水凝胶机械性能较差、再现性较低。水凝胶的形成也可用小分子交联剂通过化学交联来实现，其虽能以高再现性精确控制网络密度，但其交联过程非常受限，因为在溶液中很难保持均匀的反应条件，并且小分子交联剂的毒性会影响其后续的生物应用。使用辣根过氧化物酶以及过氧化氢通过酶促交联制备的水凝胶虽条件温和，但凝胶时间长达30 min且交联强度远不如化学交联的水凝胶^［24］。因此，使用交联剂的化学交联虽交联度高，但小分子交联剂易引起细胞毒性和异物反应；物理交联虽无细胞毒性，但力学性能差、再现性低；酶促交联反应温和，但其交联时间长、力学性能远不及化学交联且酶价格高、成本高。对于丝素蛋白和透明质酸的复合水凝胶，Hu等^［25］采用超声波方法诱导丝素蛋白和透明质酸混合溶液形成凝胶，该复合凝胶因透明质酸的加入改善了丝素蛋白水凝胶的溶胀性能。但凝胶化过程不稳定，只有当透明质酸含量低于40%时，才能形成具有稳定溶胀的均匀材料。Raia等^［26］利用辣根过氧化物酶促进丝素蛋白和透明质酸混合液交联形成凝胶发现，复合水凝胶的降解速率比纯透明质酸水凝胶的降解速率慢，凝胶时间为5~10 min。

本研究通过对丝素蛋白和透明质酸进行改性，在微量引发剂条件下，通过两个大分子间的点击反应快速光固化，成胶速度快且避免了小分子交联剂的毒性问题。虽然在丝素蛋白改性过程中利用EDC和NHS活化丝素蛋白分子上的羧基再与带氨基的GSH进行酰胺缩合，但通过后续透析已经除去该小分子，因此细胞毒性较低。与上述成胶方式比较，光交联水凝胶显现出成胶速度快、性能控制范围宽和弹性更高等特性。制备的SH-gel压缩强度达450 kPa，循环十次不破裂。SH-gel凝胶化过程稳定、凝胶时间短并可吸收自身质量4倍甚至10倍的水。SH-gel可生物降解，35 d后的降解率达28%~42%，可调的溶胀及降解性能能满足生物医用上不同的需求。如溶胀比较高的SH-gel-5水凝胶可作为高保水性的医用敷料吸收更多的伤口渗出液，可避免敷料频繁更换；根据治疗周期的长短，可以选择对应降解速度的凝胶植入体内作为药物缓释的载体进行药物治疗；生物相容性最好的SH-gel-10可与生长因子和干细胞混合进行三维生物打印作为组织修复支架；压缩强度最高的SH-gel-15因强度与松质骨接近，有望作为可注射骨填料。

综上，本研究分别通过酰胺缩合及酯化反应对丝素蛋白和透明质酸进行巯基化和双键化改性，在紫外光条件下，通过点击反应能制备出快速光固化的全生物质SH-gel；SH-gel凝胶点在40~65 s，成胶速度快且具有可调的交联度及降解度；SH-gel的力学性能优异，其压缩强度可达450 kPa且循环十次不破裂；而且SH-gel毒性低，具有良好的细胞黏附性和生物相容性。因此，SH-gel作为生物医疗材料应用于临床具有巨大的潜力，有望应用于创口敷料、骨缺损修复材料、组织工程支架以及三维打印类器官等。

［缩略语］

N，N-二甲基甲酰胺（N， N-dimethylformamide，DMF）；2-吗啉乙磺酸（2-morpholinoethanesulfonic acid，MES）；1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐［1-ethyl-3-（3-dimethylaminopropyl）carbodiimide，EDC］；N-羟基琥珀酰亚胺（N-hydroxy succinimide，NHS）；还原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）；人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cell，HUVEC）；巯基化丝素蛋白（thiolated silk fibroin，SF-GSH）；丝素蛋白/透明质酸复合水凝胶（silk fibroin/hyaluronic acid composite hydrogel，SH-gel）；氢-1核磁共振波谱法（nuclear magnetic resonance spectroscopy，¹H-NMR）；磷酸盐缓冲液（phosphate buffered solution，PBS）；4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（4′， 6-diamidino-2-pheny-lindole，DAPI）

利益冲突声明

所有作者均声明不存在利益冲突

Conflict of Interests

The authors declare that there is no conflict of interests