急性痛风性关节炎致炎蛋白的蛋白质组学研究

Abstract

Objective:

To detect the differentially expressed inflammatory proteins in acute gouty arthritis (AGA) with protein chip.

Methods:

The Raybiotech cytokine antibody chip was used to screen the proteomic expression in serum samples of 10 AGA patients and 10 healthy individuals. Gene Ontology (GO) and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) enrichment analysis were applied to determine the biological function annotation of differentially expressed proteins and the enrichment of signal pathways. ELISA method was used to verify the differential protein expression in 60 AGA patients and 60 healthy subjects. The ROC curve was employed to evaluate the diagnostic value of differential proteins in AGA patients.

Results:

According to|log ₂FC|>log ₂ 1.2 and corrected P< 0.01, 4 most differentially expressed proteins in AGA patients were identified, including tumor necrosis factor receptor super family members Ⅱ (TNF RⅡ), macrophage inflammatory protein 1β (MIP-1β), interleukin-8 (IL-8), and granulocyte-macrophage colony stimulating factor (GM-CSF). GO and KEGG enrichment analysis showed that the differentially expressed proteins were related to inflammation, metabolism and cytokine pathways. The ELISA results showed that serum levels of differentially expressed proteins were significantly different between AGA patients and healthy subjects(all P< 0.01). ROC curve analysis showed that the areas under the curve (AUCs) of GM-CSF, IL-8, MIP-1β and TNF RⅡ for predicting AGA were 0.657 (95% CI: 0.560-0.760, sensitivity: 68.33%, specificity: 50.00%), 0.994 (95% CI: 0.980-1.000, sensitivity: 100.00%, specificity: 61.67%), 0.980 (95% CI: 0.712-0.985, sensitivity: 95.00%, specificity: 98.33%) and 0.965 (95% CI: 0.928-1.000, sensitivity: 100.00%, specificity: 10.00%), respectively.

Conclusion:

Proteomics can be applied to identify the biomarkers of AGA, which may be used for risk prediction and diagnosis of AGA patients.

急性痛风性关节炎(acute gouty arthritis，AGA)是由嘌呤代谢障碍引起的一种代谢性疾病，其特征是尿酸单钠晶体在关节及其周围组织积聚，引起关节疼痛甚至损伤 ^{[ 1]} 。剧烈运动、感冒、酗酒和暴饮暴食都会引起体内三磷酸腺苷急剧变化，成为AGA的诱发因素。研究表明，尿酸单钠晶体主要通过激活Toll样受体、含NACHT-LRR-PYD的蛋白3炎性小体信号传导导致AGA发作 ^{[ 2]} 。目前，AGA的诊断主要依据患者的临床症状及血尿酸水平，但在临床实践中AGA发作时患者血尿酸不一定升高，而仅凭临床症状不足以诊断AGA ^{[ 3]} 。因此，寻找能够诊断AGA的生物标志物具有重要的临床价值。蛋白质组学可以通过筛选和鉴定疾病中差异表达的蛋白质，协助疾病发生、发展的预测和诊断 ^{[ 4]} 。本研究通过基于血清的蛋白质组学来识别有炎症功能的蛋白质信号，以期为临床诊断AGA寻找生物标志物。

1. 对象与方法

1.1. 对象

蛋白质组学筛选实验：选择2019年6至12月安徽中医药大学第一附属医院风湿免疫科的10例AGA患者，男性9例，女性1例，年龄17~78岁；选择同期在医院体检的健康志愿者10名作为对照，男性9名，女性1名，年龄18~72岁。差异表达蛋白质验证实验：选择2019年6至12月安徽中医药大学第一附属医院风湿免疫科的60例AGA患者，男性45例，女性15例，年龄17~78岁；选择同期在医院体检的健康志愿者60名作为对照，男性45名，女性15名，年龄18~72岁。所有AGA患者的诊断均符合2015年美国风湿病学会/欧洲抗风湿联盟(ACR/EULAR)联合制定的标准 ^{[ 5]} ，排除其他风湿病、重度器质性疾病患者和妊娠期、哺乳期妇女。所有受试者均为汉族，AGA组与健康对照组平均年龄和性别构成差异均无统计学意义(均 P＞0.05)。

本研究通过天津中医药大学第一附属医院医学伦理委员会审查(TYLL2018[K]字023)，所有受试者均提供书面知情同意书。

1.2. 血清样本采集

取患者和健康志愿者全血5 mL，室温下血液自然凝固10~20 min，100× g离心20 min，收集上清液并于-80 ℃保存。

1.3. 抗体阵列检测筛选差异表达蛋白质

对10例AGA患者和10名健康志愿者的血清样本进行抗体阵列检测。应用Human Immune Response Array Q1(QAH-ICM-1)试剂盒(美国RayBiotech公司)，首先将玻片芯片(含50种细胞因子蛋白质)完全干燥，同时配置标准品(细胞因子标准品梯度稀释7次)，然后进行芯片操作及Cy3-链霉亲和素孵育，最后采用InnoScan 300动态激光共聚焦扫描仪(法国Innopsys公司)进行检测并采用QAH-ICM-1软件进行数据分析。首先将所有样本原始数据取平均值，归一化后根据各因子的标准曲线计算样本中各因子的浓度值，最后对其进行分析。两组间比较采用校正 t检验，采用BH方法校正后 P值＜0.01和|log ₂FC(差异倍数)|>log ₂1.2为标准筛选差异表达蛋白质。

1.4. 生物信息学方法分析蛋白质功能

对差异表达蛋白质进行基因本体(Gene Ontology，GO)和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)分析，进行生物学功能注释和信号通路富集。

1.5. ELISA验证差异表达蛋白质在血清中的表达

严格按照ELISA试剂盒(武汉基因美生物科技有限公司)说明书操作。于450 nm波长依序测量各孔的吸光度值，以标准物的浓度为横坐标、吸光度值为纵坐标绘制标准曲线，根据标准曲线的直线回归方程式计算指标含量，样品线性回归与预期浓度相关系数 R值为0.9998。

1.6. 统计学方法

使用SPSS 21.0软件中的 t检验分析两组受试者的实验室参数及蛋白质表达量，使用GraphPad Prism 8.0软件构建ROC曲线，以评估差异表达蛋白质对AGA患者的诊断价值， P＜0.05为差异有统计学意义。

2. 结果

2.1. AGA患者与健康志愿者的差异表达蛋白质

抗体阵列检测结果显示，与健康对照组比较，AGA组患者50种蛋白质中，22种蛋白质上调，28种蛋白质下调。其中，8种蛋白质显著上调(均 P＜0.05)，包括人血小板衍生生长因子BB(platelet derived growth factor-BB，PDGF-BB)、分泌刺激因子(regulation on activation normal T-cell expressed and secreted，RANTES)、IL-6受体(interleukin-6 receptor，IL-6R)、巨噬细胞炎性蛋白1(macrophage inflammatory protein-1，MIP-1)β、组织金属蛋白酶组织抑制因子2(tissue inhibitor of metalloproteinases-2，TIMP-2)、肿瘤坏死因子受体(tumor necrosis factor receptor，TNF R)Ⅰ和Ⅱ、IL-8；4种蛋白质显著下调(均 P＜0.01)，包括粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)、程序性死亡配体(programmed death ligand，PD-L)2、IL-8和PD-L1，见 表 1。根据筛选标准，选择4种差异表达最显著的蛋白质GM-CSF、IL-8、MIP-1β和TNF RⅡ进行后续分析。

表表 1 急性痛风性关节炎(AGA)患者与健康志愿者血清中50种蛋白质的表达差异

编号	蛋白质名称	AGA组	健康对照组	Log 2差异倍数	P值
1	IL-8	2.65	0.97	1.68	0.00
2	TNF RⅡ	12.53	12.04	0.49	0.00
3	TIMP-2	13.27	13.07	0.19	0.00
4	MIP-1β	5.96	4.61	1.35	0.00
5	GM-CSF	0.16	1.34	-1.18	0.00
6	IL-6 R	10.74	10.58	0.15	0.01
7	TNF RI	12.98	12.59	0.39	0.01
8	B7-H1	1.75	4.52	-2.77	0.02
9	PD-L2	1.34	4.87	-3.53	0.03
10	IL-4	0.11	1.72	-1.62	0.02
11	PDGF-BB	13.23	13.05	0.17	0.03
12	RANTES	11.21	11.09	0.12	0.03
13	IL-7	1.52	2.36	-0.84	0.06
14	ICOS	6.59	8.99	-2.40	0.10
15	PD-L1	2.77	4.46	-1.69	0.12
16	Eotaxin-2	7.17	7.63	-0.46	0.14
17	IFNG	0.83	1.78	-0.95	0.15
18	IL-1ra	6.70	6.09	0.61	0.14
19	IL-5	0.91	2.15	-1.23	0.14
20	MIP-1α	8.30	7.69	0.61	0.15
21	TNFα	0.68	2.15	-1.47	0.12
22	IL-12 p70	0.02	0.29	-0.27	0.16
23	CTLA-4	4.75	6.20	-1.45	0.19
24	GCSF	4.31	5.45	-1.14	0.20
25	IL-16	5.84	5.08	0.76	0.20
26	MIG	6.64	5.63	1.01	0.18
27	TIMP-1	11.78	11.66	0.12	0.19
28	IL-13	0.15	0.71	-0.56	0.24
29	MIP-1δ	10.57	10.70	-0.13	0.24
30	TNFβ	0.56	1.99	-1.43	0.23
31	I-309	2.44	3.31	-0.87	0.26
32	BLC	4.68	4.28	0.40	0.29
33	B7-H2	10.83	10.41	0.43	0.34
34	IL-12 p40	6.27	5.86	0.40	0.35
35	MCP-1	6.34	6.63	-0.29	0.39
36	IL-2	2.26	3.25	-0.99	0.44
37	B7-H3	8.35	8.66	-0.31	0.53
38	IL-1α	8.00	8.08	-0.07	0.54
39	PD-1	8.26	8.63	-0.38	0.60
40	ICAM-1	13.55	13.50	0.05	0.59
41	IL-11	1.03	1.57	-0.54	0.59
42	Eotaxin	6.68	6.81	-0.13	0.67
43	IL-6	1.99	1.71	0.29	0.65
44	IL-15	1.72	2.03	-0.31	0.67
45	IL-10	1.37	1.26	0.10	0.69
46	IL-17	1.39	1.21	0.17	0.80
47	B7-2	7.81	7.98	-0.17	0.83
48	CD28	4.33	4.16	0.17	0.91
49	IL-1β	2.84	2.80	0.04	0.95
50	M-CSF	0.00	0.00	0.00	0.00

2.2. 差异表达蛋白质功能

GO富集分析结果显示，生物过程上调最明显的是代谢反应，下调主要集中在炎症反应调节( 图 1A)；分子功能类别涉及12个重要功能术语，差异表达蛋白质主要富集于细胞因子活性、细胞因子受体结合、TNF激活受体活性等( 图 1B)；细胞成分类别涉及1个重要功能术语静脉曲张( 图 1C)。KEGG富集分析显示差异表达的蛋白质在13条途径中显著富集，其中在细胞因子-细胞因子受体相互作用和病毒蛋白与细胞因子和细胞因子受体的相互作用显著富集( 图 1D)。

图 1 .

急性痛风性关节炎患者与健康志愿者差异表达蛋白质基因本体(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析结果

A：GO富集生物过程分析结果；B：GO富集分子功能分析结果；C：GO富集细胞成分分析结果；D：KEGG富集分析结果.

2.3. 差异表达蛋白质验证结果

与健康对照组比较，AGA组患者IL-8、MIP-1β和TNF RⅡ表达均增加，GM-CSF表达减少(均 P＜0.01， 图 2)，提示GM-CSF、IL-8、MIP-1β和TNF RⅡ在AGA患者血清中的表达与抗体芯片筛选结果一致。

图 2 .

急性痛风性关节炎(AGA)患者与健康志愿者血清中差异表达蛋白质表达比较

A:粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)表达比较；B:IL-8表达比较；C:巨噬细胞炎性蛋白1β(MIP-1β)表达比较；D:肿瘤坏死因子受体Ⅱ(TNF RⅡ)表达比较.与健康对照组比较，**P＜0.01.

2.4. 差异表达蛋白质诊断AGA的价值

ROC曲线分析结果显示，GM-CSF预测AGA的AUC为0.657(95 % CI：0.560~0.760)，敏感度为68.33 %，特异度为50.00 %；IL-8预测AGA的AUC为0.994(95 % CI：0.980~1.000)，敏感度为100.00 %，特异度为61.67 %；MIP-1β预测AGA的AUC为0.980(95 % CI：0.712~0.985)，敏感度为95.00 %，特异度为98.33 %；TNF RⅡ预测AGA的AUC为0.965(95 % CI：0.928~1.000)，敏感度为100.00 %，特异度为10.00 % ( 图 3)。结果提示，MIP-1β诊断AGA的价值最高，IL-8次之。

图 3 .

四种差异表达蛋白质诊断急性痛风性关节炎(AGA)的ROC曲线

A:粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)诊断AGA的ROC曲线；B:IL-8诊断AGA的ROC曲线；C:巨噬细胞炎性蛋白1β(MIP-1β)诊断AGA的ROC曲线；D:肿瘤坏死因子受体Ⅱ(TNF RⅡ)诊断AGA的ROC曲线.

3. 讨论

在临床诊断中，AGA的临床症状并不典型，而血尿酸水平又受很多因素影响，并非每次发作时均表现为升高 ^{[ 6]} ，因此寻找能够对AGA进行准确诊断的实验室指标是急需解决的问题。AGA的概念范围既包括传统代谢理论中的嘌呤代谢紊乱，又包括现代研究中遗传和蛋白质组学 ^{[ 7]} 。蛋白质组学研究可以确定疾病发展的机制，有利于筛选出可以早期诊断疾病的生物标志物，同时也可为个性化治疗提供新的治疗靶标。因此，本研究旨在通过基于血清的蛋白质组学方法识别有炎症功能的蛋白质信号，以期为临床诊断AGA寻找新的生物标志物。

本研究利用抗体阵列筛选出12个显著上调或下调的差异表达蛋白质，并对4个表达差异最显著的蛋白质GM-CSF、IL-8、MIP-1β和TNF RⅡ进行GO和KEGG富集分析和验证。GO分析结果显示，差异表达蛋白质主要富集在细胞因子活性、细胞因子受体结合、TNF激活受体活性等通路；KEGG分析结果显示，差异表达蛋白质主要富集在细胞因子-细胞因子受体相互作用和病毒蛋白与细胞因子和细胞因子受体的相互作用等通路。其中细胞因子-细胞因子受体相互作用途径与AGA的发生最为密切，IL、趋化因子、TNF、集落刺激因子、激活素和干扰素及其受体通过该途径在AGA中表现出明显的转录改变 ^{[ 8]} 。且有研究显示，病毒蛋白与细胞因子和细胞因子受体的相互作用的途径具有促进细胞生长和抗凋亡的生物学特性 ^{[ 9]} 。根据富集分析结果，我们推测AGA的发生发展与细胞因子的激活具有密切关系。

为了评估差异表达蛋白质诊断AGA的价值，本研究收集了120名受试者进行了验证。结果显示，GM-CSF、IL-8、MIP-1β和TNF RⅡ诊断AGA的曲线下面积均大于0.65，其中IL-8、MIP-1β和TNF RⅡ诊断AGA的曲线下面积大于0.96。考虑AGA与类风湿关节炎、银屑病关节炎等其他急性发作关节炎具有相似性，在诊断敏感度相近时，应追求较高的特异度，以减少误诊。鉴于MIP-1β诊断AGA的敏感度、特异度均大于0.95，我们认为MIP-1β诊断AGA的价值最高。AGA发作具有中性粒细胞网格化的特点，而炎症部位的中性粒细胞大量聚集可能由趋化性细胞因子MIP-1诱发。根据MIP-1分子结构的差异，可分为MIP-1α和MIP-1β。MIP-1β具有趋化单核细胞、NK细胞、T淋巴细胞等生理作用，近年来临床研究显示其在炎症疾病中存在异常表达 ^{[ 10]} ，甚至可以用于体外致敏测定中的新型生物标志物 ^{[ 11]} ，但在AGA中的价值还需进一步探索。除MIP-1β外，IL-8在AGA的诊断中也显示出较高的价值。尿酸单钠晶体的存在会刺激NPRL3炎性小体的产生和随后半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1的活化，从而产生IL-8，而IL-8能介导中性粒细胞流入关节，引起关节和关节周围组织的炎症 ^{[ 12- 13]} 。有专家提出IL-8不仅可以视为AGA患者局部炎症过程活动的参数，还可以作为代谢转移和心血管病理发展的独立预测指标 ^{[ 14]} 。此外，虽然本文资料显示GM-CSF诊断AGA的敏感度和特异度都不高，但研究显示其在自身免疫性疾病中有重要作用。滑膜巨噬细胞、自然杀伤细胞和中性粒细胞的细胞级联反应通过产生IL-18和GM-CSF而介导关节炎持续发作 ^{[ 15]} 。有研究表示，在炎症性关节炎期间，细胞因子诱导的含SH2区域的蛋白在限制GM-CSF信号传导中至关重要 ^{[ 16]} 。TNF是一种典型的促炎细胞因子，TNF RⅡ是TNF受体超家族的原型成员。TNF RⅡ在小胶质细胞和内皮细胞中表达，是炎症免疫反应多个方面的有效介体，主要通过跨膜TNF-α参与炎症发生 ^{[ 17]} 。研究表明，在尿酸单钠的存在下，TNF-α和GM-CSF可诱导IL-8产生，从而加剧了炎症的反应 ^{[ 18]} ，说明三者在AGA发作过程中具有协同作用，对其的抑制有助于遏制疾病的发生和发展。

综上所述，本研究通过特定蛋白质组分检测识别出4个生物标志物，可能可以用于AGA患者的风险预测和诊断。本研究在蛋白质组学水平上为AGA的发病机制提供了新的见解，为AGA患者的诊断和治疗进行了有益探索。