补阳还五汤上调miR-199a-5p表达促进脑缺血大鼠神经发生和血管生成

Abstract

目的:

探讨补阳还五汤促进脑缺血大鼠神经发生和血管生成的机制。

方法:

实验大鼠随机分为手术对照组、模型对照组、补阳还五汤组、拮抗剂组、拮抗剂对照组，各14只。除手术对照组外，其余组采用线栓法诱导大脑中动脉阻塞模型，缺血90 min后再灌注14 d；补阳还五汤组、拮抗剂组和拮抗剂对照组在缺血后24 h灌胃补阳还五汤（13 g/kg）；所有大鼠腹腔注射5-溴脱氧尿苷（BrdU，50 mg/kg），1次/d，连续14 d；缺血后第5天，拮抗剂组和拮抗剂对照组分别于侧脑室注射miR-199a-5p拮抗剂和miR-199a-5p拮抗剂对照10 nmol。采用改良神经损伤严重程度评分（mNSS）和角试验评价神经功能缺损，甲苯胺蓝染色检测脑梗死体积，免疫荧光双标记法检测脑缺血大鼠神经发生和血管生成，实时逆转录PCR检测miR-199a-5p表达，蛋白质印迹法检测血管内皮生长因子（VEGF）和脑源性神经营养因子（BDNF）蛋白表达。

结果:

补阳还五汤可促进脑缺血大鼠神经功能恢复（ P< 0.05或 P< 0.01），减小梗死体积（ P< 0.05），增加BrdU ⁺/DCX ⁺、BrdU ⁺/NeuN ⁺、BrdU ⁺/vWF ⁺细胞数（均 P< 0.01），上调miR-199a-5p表达（ P< 0.01），促进VEGF和BDNF蛋白表达（均 P< 0.05）；侧脑室注射miR-199a-5p拮抗剂后则逆转上述效应。

结论:

补阳还五汤可促进脑缺血大鼠神经发生和血管生成，其机制可能与上调miR-199a-5p增加VEGF和BDNF表达有关。

缺血性脑卒中是导致成年人死亡和残疾的主要原因之一。目前，组织型纤溶酶原激活物是临床治疗急性缺血性脑卒中唯一有效的药物，但因治疗时间窗有限且存在出血风险，其在临床的应用受到限制 ^{[ 1]} 。由于脑缺血导致的神经元死亡不可避免，因此促进神经血管修复是治疗脑缺血的一个有效策略。虽然脑缺血也能诱导内源性神经发生(neurogenesis)和血管生成(angiogenesis)，但尚不足以改善缺损的神经功能 ^{[ 2]} 。因此，促进脑缺血后神经发生和血管生成将有助于脑缺血后神经修复和功能恢复。

补阳还五汤是中医治疗脑缺血及其后遗症的代表方剂。前期研究发现补阳还五汤能促进脑缺血后内源性神经发生、血管生成和神经功能恢复 ^{[ 3- 5]} ，但具体机制尚不清楚。微RNA(miRNA，miR)是一类长度为19~22个核苷酸的内源性单链非编码小分子RNA，通过与靶基因mRNA 3′端非翻译区不完全或完全互补结合，抑制mRNA翻译或使mRNA降解，从而负性调控基因表达 ^{[ 6]} 。研究表明，miRNA可调控脑缺血后神经发生和血管生成 ^{[ 7- 8]} 。Liu等 ^{[ 9]} 研究脑缺血大鼠侧脑室下区内神经祖细胞miRNA表达谱时发现，脑缺血大鼠神经祖细胞miR-199a-5p表达上调，提示miR-199a-5p可能介导脑缺血后神经发生。本研究旨在观察补阳还五汤是否通过上调miR-199a-5p表达促进脑缺血大鼠神经发生和血管生成。

1. 材料与方法

1.1. 动物、试剂和仪器

SPF级雄性SD大鼠，3~4月龄，体质量为250~300 g，购自上海西普尔－必凯实验动物有限公司，动物质量合格证号：SCXK(沪)2013-0016。大鼠饲养在浙江中医药大学实验动物中心，使用许可证号：SYXK(浙)2013-0184。动物饲养的环境为温度(22±1)℃，相对湿度40 %~60 %，12 h/12 h明暗循环，自由进食和饮水。按照动物实验伦理规范进行实验。

Mir-X ^TM miRNA First-Strand Synthesis、SYBR Premix Ex Taq ^TM Ⅱ试剂盒为宝生物工程(大连)有限公司产品；5-溴脱氧尿苷(BrdU)粉末、鼠抗BrdU单抗为美国Sigma公司产品；山羊抗双肾上腺皮质激素(recombinant doublecortin，DCX)多抗、兔抗血管性假血友病因子(von Willebrand factor，vWF)多抗为英国Abcam公司产品；兔抗神经元核抗原(neuronal nuclei，NeuN)多抗为美国Millipore公司产品；鼠抗胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)单抗、兔抗血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)多抗、兔抗脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)多抗为美国Santa Cruz公司产品；鼠抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)单抗为杭州华安生物技术有限公司产品；Cy3标记驴抗鼠二抗IgG、Cy3标记羊抗鼠二抗IgG、异硫氰酸荧光素(FITC)标记驴抗山羊二抗IgG和FITC标记山羊抗鼠二抗IgG为美国Jackson ImmunoResearch公司产品；FITC标记山羊抗兔二抗IgG为北京中杉金桥生物技术有限公司产品；HRP标记羊抗兔二抗为美国Cell Signaling Technology公司产品；HRP标记羊抗鼠二抗为美国Thermo Fisher Scientific公司产品；聚偏二氟乙烯膜为美国Millipore公司产品；miR-199a-5p拮抗剂/miR-199a-5p拮抗剂对照为广州锐博生物科技有限公司产品。rno-miR-199a-5p引物序列为5′-GCCCAGTGTTCAGACTACCTGTTC- 3′；U6上游引物为5′-AGAGAAGATTAGCATGGCCC-3′，下游引物为5′- ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-3′，所用引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

冰冻切片机(CM 1950)、正置荧光显微镜(DM3000)为德国Leica公司产品；实时荧光定量PCR仪(LightCycler 96)为美国Roche Diagnostics公司产品；脑立体定位仪(CAX01-002)为深圳市瑞沃德生命科技有限公司产品；垂直电泳转膜系统(PowerPac ^TM Basic)、凝胶成像系统(FluorChem Q)为美国Bio-Rad公司产品。

1.2. 制备补阳还五汤提取液

补阳还五汤由黄芪120 g，当归6 g，川芎、赤芍各4.5 g，地龙、红花、桃仁各3 g组成。药材购自浙江中医药大学中医门诊部并经鉴定，上述药物加入10倍量蒸馏水，浸泡60 min，回流提取60 min，倒出药液，残渣再加入8倍量的蒸馏水，回流提取60 min，合并两次药液，用旋转蒸发仪浓缩，浓缩为含生药2 g/mL药液。

1.3. 制备大鼠局灶性脑缺血模型

参照Longa等 ^{[ 10]} 建立大鼠大脑中动脉阻塞(MCAO)模型。采用10 %水合氯醛腹腔麻醉(350 mg/kg)，游离右侧颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉，颈外动脉远心端结扎后剪断，在游离的颈外动脉上剪一小切口，将栓线(2838-A4，北京西浓科技有限公司)从切口轻轻插入至颈内动脉，当尼龙线插入距颈总动脉分叉18~20 mm处有轻微阻力时固定。缺血90 min后将尼龙线拔出再灌注。手术对照组大鼠尼龙线只插入5 mm左右。大鼠术中和术后始终保持在37 ℃环境至苏醒。

1.4. 动物模型分组及干预措施

除手术对照组外，脑缺血模型大鼠随机分为模型对照组、补阳还五汤组、补阳还五汤+miR-199a-5p拮抗剂组(拮抗剂组)、补阳还五汤+miR-199a-5p拮抗剂对照组(拮抗剂对照组)，每组14只。补阳还五汤组、拮抗剂组和拮抗剂对照组建模后24 h灌胃补阳还五汤(13 g/kg)，1次/d，连续14 d，其他组灌胃等容积等渗氯化钠溶液。建模后第5天，拮抗剂组和拮抗剂对照组侧脑室分别注射miR-199a-5p拮抗剂或miR-199a-5p拮抗剂对照10 nmol(5 μL)，其他各组侧脑室注射等容积无酶无菌水。侧脑室注射方法参照《大鼠脑立体定位图谱》 ^{[ 11]} ，大鼠麻醉后固定于脑立体定位仪，钻开颅骨，以前囟为基点，定位侧脑室(前囟后0.8 mm，中线右侧旁开1.4 mm)，用10 μL微量注射器自颅骨表面垂直向下进针4.8 mm，20 min内注射完毕，留针10 min后缓慢撤针，骨蜡封骨窗，消毒并缝合皮肤。大鼠建模24 h后均腹腔注射BrdU(50 mg/kg)，1次/d，连续14 d。手术对照组无死亡(14/14)，模型对照组、补阳还五汤组、拮抗剂组、拮抗剂对照组存活率分别为51.85 % (14/27)、58.33 % (14/24)、50.00 % (14/28)、53.85 % (14/26)。

1.5. 行为学检测神经功能

在大鼠缺血后第1、3、7和14天，分别采用改良的神经损伤严重程度评分(modified neurological severity score，mNSS) ^{[ 12]} 和角试验 ^{[ 13]} 检测大鼠神经功能。mNSS包括运动、感觉、平衡和反射试验，具体的评分标准见 表 1。正常为0分，评分越高，神经功能损伤越严重。角试验是将两块相同大小的木板连成30°夹角，交界处留一缝隙，将大鼠面向夹角放在两木板中间部，正常大鼠随机向左右两侧转身，但缺血大鼠偏好转向非损伤侧。每只大鼠重复10次，分别记录大鼠向左右转身的次数。

表表 1 改良的神经功能损伤严重程度评分表

评分项目	得分
运动实验
提尾实验
前肢屈曲	1
后肢屈曲	1
30 s内头转动偏离垂直轴的角度>10°	1
把大鼠放置地板上
正常运动	0
不能直线行走	1
向偏瘫侧方向转圈	2
向偏瘫侧方向倾倒	3
感觉实验
放置实验(视觉和触觉测试)	1
本体感觉实验(深感觉，向桌子边缘按压鼠爪刺激肢体肌肉)	1
平衡木实验
稳定平衡姿势	0
紧抓平衡木一侧	1
紧抱平衡木且一肢体从平衡木滑落	2
紧抱平衡木且两肢体从平衡木滑落，或在平衡木上旋转(>60 s)	3
试图在平衡木保持平衡但跌落(>40 s)	4
试图在平衡木保持平衡但跌落(>20 s)	5
跌落, 未尝试在平衡木上平衡或悬吊(＜20 s)	6
反射消失和异常运动
耳郭反射(触碰耳道时摇头)	1
角膜反射(用棉签轻触角膜时眨眼)	1
惊吓反射(对快弹硬纸板的噪音有运动反应)	1
癫痫发作、肌阵挛，肌张力障碍	1

1.6. 制备脑组织病理标本

大鼠脑缺血后第14天，用10 %水合氯醛腹腔注射麻醉，经主动脉用等渗氯化钠溶液快速灌流后，4 %多聚甲醛灌注固定，取脑，4 %多聚甲醛固定过夜，30 %蔗糖脱水沉底。冰冻切片机切片，制备20 μm和8 μm的脑组织切片，分别用于梗死体积和免疫荧光检测。

1.7. 甲苯胺蓝染色检测脑梗死体积

每组取8只大鼠的脑切片(20 μm)，4 %多聚甲醛固定30 min，1 %甲苯胺蓝溶液染色4 min，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。用ImageJ软件测量梗死面积，并计算梗死体积。梗死体积百分比(%)＝[左半脑体积-(右半脑体积-梗死体积)]/左半脑体积×100 %。

1.8. 免疫荧光双标记法检测BrdU/DCX、BrdU/NeuN、BrdU/GFAP、BrdU/vWF

每组取8只大鼠的脑切片，经50 %甲酰胺(2×SSC)65 ℃孵育2 h，2 mol/L氯化氢37 ℃变性30 min，0.1 mol/L硼酸于室温中和反应10 min，1 %聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)破膜30 min，3 %过氧化氢灭活内源性过氧化物酶20 min，5 %羊血清或驴血清封闭1 h，分别加入鼠抗BrdU抗体(1 :100)、山羊抗DCX抗体(1 :100)、兔抗NeuN抗体(1 :500)、鼠抗GFAP抗体(1 :100)、兔抗vWF抗体(1 :200)，于4 ℃孵育过夜，加Cy3标记羊抗鼠/驴抗鼠二抗IgG(1 :100)，FITC标记驴抗山羊/山羊抗兔/山羊抗鼠二抗IgG (1 :100)，37 ℃孵育1 h，封片，荧光显微镜下观察。

1.9. 实时逆转录PCR检测miR-199a-5p基因表达

每组取6只大鼠的缺血周边区脑组织检测miR-199a-5p表达量。按TRIzol试剂盒说明书提取总RNA，按照Mir-X ^TM miRNA First-Strand Synthesis试剂盒说明书进行逆转录，反应条件为：37 ℃ 60 min，85 ℃ 5 s。按照SYBR Premix Ex Taq ^TMⅡ试剂盒说明书进行PCR，反应条件为：95 ℃预变性3 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40个循环。每个样品设3个复孔，以U6为内参，采用2 ^-△△Ct法计算miRNA相对表达量。

1.10. 蛋白质印迹法检测VEGF、BDNF蛋白表达

每组取6只大鼠的缺血周边脑组织100 mg，按照试剂盒说明书提取总蛋白，BCA法测定总蛋白含量。取蛋白样品(20 μg)进行凝胶电泳，转膜，封闭，加入兔抗VEGF抗体(1 :800)、兔抗BDNF抗体(1 :1000)，鼠抗GAPDH抗体(1 :1000)孵育，4 ℃过夜，加HRP标记山羊抗兔二抗IgG(1 :10 000)，山羊抗鼠二抗IgG(1 :10 000)，室温孵育2 h，化学发光底物显色，Bio-Rad成像分析系统显影成像，采用BandScan 5.0软件分析条带的吸光度值。

1.11. 统计学方法

采用SPSS 23.0软件进行统计分析。数据用均数±标准差(${\bar x}$± s)表示，行为学评分采用非参数Kruskal-Wallis H检验，其余均采用单因素方差分析，组间两两比较采用Student-Newman-Keuls法，以 P＜0.05为差异有统计学意义。

2. 结果

2.1. 补阳还五汤改善脑缺血大鼠神经功能缺损

在大鼠术后第1、3、7、14天进行mNSS和角试验，手术对照组未出现神经功能缺损；与手术对照组比较，模型对照组在缺血后第1、3、7、14天mNSS分值和右转次数增加(均 P＜0.01)；与模型对照组比较，补阳还五汤组在缺血后第7和14天mNSS分值降低( P＜0.01或 P＜0.05)，缺血后第14天右转次数减少( P＜0.05)；与补阳还五汤组比较，拮抗剂组缺血后第7和14天mNSS分值升高( P＜0.05)，缺血后第14天右转次数增加( P＜0.01)，而拮抗剂对照组mNSS分值、右转次数与补阳还五汤组差异无统计学意义(均 P＞0.05)，详见 图 1。结果提示，补阳还五汤可以减轻脑缺血大鼠神经功能受损程度。

图 1 .

各组神经功能检测结果比较( n=14)

A.各组缺血后改良的神经损伤严重程度评分(mNSS)分值变化; B.各组缺血后角试验右转次数变化.与手术对照组比较，**P＜0.01；与模型对照组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与补阳还五汤组比较，ΔP＜0.05.

2.2. 补阳还五汤减少脑缺血大鼠脑组织梗死体积

手术对照组脑组织无梗死；模型对照组、补阳还五汤组、拮抗剂组、拮抗剂对照组梗死体积百分比分别为(60.39±2.92) %、(44.97±3.65) %、(60.94± 4.10) %、(44.88±3.73) %。与模型对照组比较，补阳还五汤组在缺血后第14天脑梗死体积减小( P＜0.05)；与补阳还五汤组比较，拮抗剂组脑梗死体积增大( P＜0.05)，而拮抗剂对照组脑梗死体积与补阳还五汤组差异无统计学意义( P＞0.05), 详见 图 2。结果提示，补阳还五汤可以减小脑缺血大鼠脑梗死体积。

图 2 .

各组缺血后甲苯胺蓝染色示脑梗死情况

手术对照组(A)脑组织无梗死；模型对照组(B)脑组织梗死明显；与模型对照组比较，补阳还五汤组(C)脑组织梗死体积减小；与补阳还五汤组比较，拮抗剂组(D)脑梗死体积增加，而拮抗剂对照组(E)脑组织梗死体积与补阳还五汤组相近.

2.3. 补阳还五汤上调脑缺血大鼠miR-199a-5p表达

缺血后第14天，模型对照组、补阳还五汤组、拮抗剂组、拮抗剂对照组miR-199a-5p的相对表达量分别为手术对照组的(2.39±0.24)、(11.80±1.15)、(2.33±0.66)、(11.41±1.20)倍；与手术对照组比较，模型对照组miR-199a-5p表达增加( P＜0.01)；与模型对照组比较，补阳还五汤组miR-199a-5p表达增加( P＜0.01)；与补阳还五汤组比较，拮抗剂组miR-199a-5p表达减少( P＜0.01)，拮抗剂对照组miR-199a-5p表达与补阳还五汤组差异无统计学意义( P＞0.05)。结果提示，脑缺血大鼠miR-199a-5p表达增加，补阳还五汤可以进一步增加miR-199a-5p表达，miR-199a-5p拮抗剂则会逆转这一表达增加的效应。

2.4. 补阳还五汤促进脑缺血大鼠神经发生

与手术对照组比较，模型对照组BrdU ⁺/DCX ⁺、BrdU ⁺/NeuN ⁺、BrdU ⁺/GFAP ⁺细胞数增加(均 P＜0.01)；与模型对照组比较，补阳还五汤组BrdU ⁺/DCX ⁺、BrdU ⁺/NeuN ⁺细胞数增加(均 P＜0.01)；与补阳还五汤组比较，拮抗剂组BrdU ⁺/DCX ⁺、BrdU ⁺/NeuN ⁺细胞数减少(均 P＜0.01);拮抗剂对照组BrdU ⁺/DCX ⁺、BrdU ⁺/NeuN ⁺细胞数与补阳还五汤组差异无统计学意义(均 P＞0.05)；各组间BrdU ⁺/GFAP ⁺细胞数差异无统计学意义( P＞0.05)，详见 图 3A~ C和 表 2。结果提示，补阳还五汤可以促进脑缺血大鼠神经发生。

图 3 .

各组BrdU ⁺/DCX ⁺、BrdU ⁺/NeuN ⁺、BrdU ⁺/GFAP ⁺、BrdU ⁺/vWF ⁺细胞免疫荧光双标染色图

A：BrdU+/DCX+细胞；B:BrdU+/NeuN+细胞；C:BrdU+/GFAP+细胞; D:BrdU+/vWF+细胞.标尺=50 μm.BrdU：5-溴脱氧尿嘧啶核苷；DCX：双肾上腺皮质激素；NeuN：抗神经元核抗原；GFAP：胶质纤维酸性蛋白；vWF：血管性假血友病因子.

表表 2 各组BrdU ⁺/DCX ⁺、BrdU ⁺/NeuN ⁺、BrdU ⁺/GFAP ⁺和BrdU ⁺/vWF ⁺细胞数比较

组别	n	BrdU +/DCX +细胞数	BrdU +/NeuN +细胞数	BrdU +/GFAP +细胞数	BrdU +/vWF +细胞数
手术对照组	8	0.75±0.50	0.50±0.58	1.00±0.82	0.50±0.58
模型对照组	8	24.00±2.71 **	17.75±1.71 **	13.00±0.82 **	23.00±3.16 **
补阳还五汤组	8	36.00±1.41 ##	27.50±1.29 ##	15.25±2.38	35.75±0.96 ##
拮抗剂组	8	19.75±2.22 ΔΔ	13.00±0.82 ΔΔ	16.50±1.73	14.00±1.41 ΔΔ
拮抗剂对照组	8	38.25±1.71	27.00±1.41	16.00±2.58	38.75±1.26

与手术对照组比较， ^** P＜0.01；与模型对照组比较， ^## P＜0.01；与补阳还五汤组比较， ^ΔΔ P＜0.01.BrdU：5-溴脱氧尿嘧啶核苷；DCX：双肾上腺皮质激素；NeuN：抗神经元核抗原；GFAP：胶质纤维酸性蛋白；vWF：血管性假血友病因子.

2.5. 补阳还五汤促进脑缺血大鼠血管再生

与手术对照组比较，模型对照组BrdU ⁺/vWF ⁺细胞数增加( P＜0.01)；与模型对照组比较，补阳还五汤组BrdU ⁺/vWF ⁺细胞数增加( P＜0.01)；与补阳还五汤组比较，拮抗剂组BrdU ⁺/vWF ⁺细胞数减少( P＜0.01)，拮抗剂对照组BrdU ⁺/vWF ⁺细胞数与补阳还五汤组差异无统计学意义( P＞0.05)，详见 图 3D和 表 2。结果提示，补阳还五汤可以促进脑缺血大鼠血管再生。

2.6. 补阳还五汤促进脑缺血大鼠VEGF、BDNF蛋白表达

与模型对照组比较，补阳还五汤组VEGF和BDNF蛋白表达增加(均 P＜0.05)；与补阳还五汤组比较，拮抗剂组VEGF和BDNF蛋白表达减少(均 P＜0.05)；拮抗剂对照组VEGF和BDNF蛋白表达与补阳还五汤组差异无统计学意义(均 P＞0.05)，详见 图 4。结果提示，补阳还五汤可以促进脑缺血大鼠VEGF、BDNF蛋白表达。

图 4 .

各组缺血周边脑组织中抗血管内皮生长因子(VEGF)和脑源性神经营养因子(BDNF)蛋白表达

A：VEGF、BDNF蛋白表达电泳图；B：VEGF、BDNF蛋白相对表达量比较(n=6).与模型对照组比较，*P＜0.05；与补阳还五汤组比较，#P＜0.05.

3. 讨论

补阳还五汤治疗缺血性脑中风临床疗效确切 ^{[ 14- 15]} 。前期研究发现，补阳还五汤能促进脑缺血后长期感觉运动功能恢复，改善学习记忆，减小梗死体积，促进神经发生和血管生成 ^{[ 3- 5]} 。本文资料显示，补阳还五汤是通过上调miR-199a-5p促进脑缺血后神经发生和血管生成，机制可能与上调VEGF和BDNF表达有关。

血管生成和神经发生在脑缺血损伤修复过程中发挥重要作用 ^{[ 7- 8]} 。miRNA参与细胞增殖、分化、凋亡、发育、血管生成和代谢等生理和病理过程 ^{[ 16]} 。大量研究报道miRNA参与调控脑缺血损伤与修复过程，如参与急性期细胞凋亡、炎症和氧化应激，恢复期的神经发生、血管生成和神经可塑性等 ^{[ 17]} 。前期研究发现，miR-199a在大鼠脑组织(如海马、嗅球、皮层和纹状体等)中广泛表达 ^{[ 18]} 。Liu等 ^{[ 9]} 报道脑缺血大鼠侧脑室下区内神经祖细胞miR-199a-5p表达较非缺血大鼠显著上调。最近研究发现miR-199a-5p保护脑和脊髓缺血再灌注损伤 ^{[ 19- 20]} 。此外，近年来研究发现，miR-199a-5p表达上调促进前脂肪细胞增殖和分化 ^{[ 21]} 、人间充质干细胞向成骨细胞分化 ^{[ 22]} ；miR-199a-5p下调破坏体外受精小鼠囊胚的发育 ^{[ 23]} ；miR-199a-5p促进人巨细胞病毒感染的内皮细胞迁移和管腔形成 ^{[ 24]} 。本文资料显示，脑缺血后第14天，补阳还五汤组脑缺血皮层BrdU ⁺/DCX ⁺、BrdU ⁺/NeuN ⁺、BrdU ⁺/vWF ⁺细胞数较模型对照组增加，表明补阳还五汤促进脑缺血后内源性神经母细胞迁移、分化以及血管生成，与前期报道一致 ^{[ 3- 5]} 。同时，PCR结果证实补阳还五汤上调脑缺血大鼠缺血侧皮层miR-199a-5p表达。为进一步确认补阳还五汤通过上调miR-199a-5p促进脑缺血后神经发生和血管生成，同时鉴于神经干细胞在脑缺血后的3~4 d开始增殖并于第7天达到峰值 ^{[ 25- 26]} ，本研究在大鼠缺血后第5天注射miR-199a-5p拮抗剂。结果显示，miR-199a-5p拮抗剂可以逆转补阳还五汤的保护效应。这些结果提示，补阳还五汤通过上调miR-199a-5p表达促进脑缺血大鼠神经发生、血管生成和功能恢复。

VEGF是血管生成的关键调节因子，通过与受体VEGFR2结合触发多个下游信号通路，从而促进血管生成。BDNF介导内源性神经干细胞增殖、迁移、分化和存活。大量研究报道VEGF和BDNF促进脑缺血后神经发生、血管生成和神经功能恢复 ^{[ 27- 28]} 。此外，脑缺血后血管生成与神经发生相互偶联，共同促进神经血管单元修复 ^{[ 29]} 。本文资料显示，补阳还五汤促进脑缺血周边区VEGF和BDNF蛋白表达，但侧脑室注射miR-199a-5p拮抗剂则抑制该效应，表明补阳还五汤通过上调miR-199a-5p促进VEGF和BDNF表达。中药复方具有多成分、多靶点和多途径的作用特点。补阳还五汤的组方特点是重用补气药黄芪，黄芪甲苷是黄芪的主要有效成分。前期研究发现，黄芪甲苷可通过上调BDNF/TrkB信号通路促进脑缺血大鼠海马神经发生和改善神经功能缺损 ^{[ 30]} 。黄芪甲苷还通过上调miR-210激活缺氧诱导因子(HIF)/VEGF/Notch信号通路促进脑缺血大鼠血管生成 ^{[ 31]} 。上述结果提示，黄芪甲苷可能是补阳还五汤的药效物质基础之一。

综上所述，本文资料证实补阳还五汤通过上调miR-199a-5p表达促进脑缺血大鼠神经发生和血管生成，机制可能与miR-199a-5p调控VEGF和BDNF表达有关。补阳还五汤上调miR-199a-5p促进VEGF和BDNF表达的药效物质基础和作用机制尚需进一步研究。