黄芪甲苷通过促进小胶质细胞/巨噬细胞M2型极化抑制大鼠脑缺血后炎症反应

Abstract

目的:

研究黄芪甲苷对大鼠脑缺血后小胶质细胞/巨噬细胞M1/M2极化及炎症反应的影响。

方法:

将48只大鼠随机分为手术对照组、模型对照组和黄芪甲苷组。采用线栓法建立大鼠大脑中动脉阻塞模型。黄芪甲苷组造模后即刻腹腔注射黄芪甲苷（40 mg/kg），随后1次/d，连续给药3 d。各组术后第1、3天采用改良的神经损伤严重程度评分（mNSS）和角试验进行神经功能评价；术后第3天采用2，3，5-氯化三苯基四氮唑染料（TTC）染色检测脑梗死体积；实时逆转录PCR检测M1型小胶质细胞/巨噬细胞表面标志物CD86、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）和促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6的mRNA表达，以及M2型小胶质细胞/巨噬细胞表面标志物CD206、精氨酸酶1（Arg-1）、类几丁质酶3样分子1/2（YM1/2）及抗炎因子IL-10、TGF-β的mRNA表达；免疫荧光双标记法检测脑缺血周边区CD16/32/Iba1和CD206/Iba1的表达。

结果:

与模型对照组比较，黄芪甲苷组mNSS分值降低、右转次数减少（ P< 0.05或 P< 0.01），脑梗死体积减小（ P< 0.01），M1型小胶质细胞/巨噬细胞标志物CD86、iNOS、TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA表达下调（均 P< 0.01），M2型小胶质细胞/巨噬细胞标志物CD206、Arg-1、YM1/2、IL-10和TGF-β的mRNA表达上调（均 P< 0.01），脑缺血区CD16/32 ⁺/Iba1 ⁺细胞数量减少（ P< 0.05），CD206 ⁺/Iba1 ⁺细胞数量增加（ P< 0.01）。

结论:

黄芪甲苷对大鼠脑缺血损伤有保护作用，可能与促进小胶质细胞/巨噬细胞从M1型向M2型转化、抑制炎症反应有关。

脑卒中是成人致死、致残的主要原因。我国缺血性脑卒中的发病率呈逐年增加趋势，占脑卒中的69.6%~70.8% ^{[ 1]} 。除急性期溶栓治疗外，目前尚缺乏有效的脑缺血治疗药物。脑缺血的病理生理机制非常复杂，其中继发性炎症反应在脑缺血损伤中发挥重要作用 ^{[ 2]} 。小胶质细胞(microglia)是中枢神经细胞系统内固有的免疫细胞，在生理条件下处于静息状态，维持中枢神经系统稳态。当微环境发生改变后，小胶质细胞迅速被激活。激活的小胶质细胞与巨噬细胞一样，有经典激活的M1(促炎)和替代激活的M2(抗炎)两种表型。M1型小胶质细胞/巨噬细胞释放TNF-α、IL-1β、IL-6和一氧化氮(NO)等促炎因子，加剧脑损伤；而M2型小胶质细胞/巨噬细胞释放抗炎因子IL-10和TGF-β，以及胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor-1, IGF-1)和脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor, BDNF)等，促进炎症消退和神经修复 ^{[ 3- 4]} 。近年来研究发现，脑缺血后激活的小胶质细胞/巨噬细胞表型呈动态改变，早期以保护性的M2型为主，随后逐渐向损伤性的M1型转化 ^{[ 5- 6]} 。因此，抑制小胶质细胞/巨噬细胞M1型极化或促进小胶质细胞/巨噬细胞向M2型极化为脑缺血的治疗提供了一个新策略。

黄芪甲苷是黄芪的主要有效成分之一，对实验性脑缺血具有保护作用，其机制主要与抗氧化、抗炎和抗凋亡有关 ^{[ 7]} , 是否调控脑缺血后小胶质细胞/巨噬细胞极化以改善炎症反应尚不清楚。本研究旨在观察黄芪甲苷对大鼠脑缺血后小胶质细胞/巨噬细胞M1/M2极化和神经炎症的影响。

1. 材料与方法

1.1. 动物、试剂和仪器

SPF级健康雄性SD大鼠48只，3~4月龄，体质量为280~300 g，由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供[实验动物生产许可证号：SCXK(沪)2013-0016]。大鼠饲养于浙江中医药大学动物实验研究中心屏障实验室[实验动物使用许可证号：SYXK(浙)2013-0184]，环境温度(22±2)℃，相对湿度50% ~60%，光照12 h/12 h明暗交替，自由饮食。按照动物实验伦理规范进行实验。黄芪甲苷(纯度≥98%)为南京春秋生物工程有限公司产品；2, 3, 5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染料为北京西浓科技有限公司产品；水合氯醛为上海源叶生物有限公司产品；兔单抗Iba1为日本Wako公司产品；鼠单抗CD16/32为美国BD公司产品；山羊多抗CD206为美国R&D Systems公司产品；羊血清、一抗稀释液为上海碧云天生物技术有限公司产品；驴血清为上海翊圣生物科技有限公司产品；Cy3标记驴抗兔IgG、Cy3标记山羊抗小鼠IgG、异硫氰酸荧光素(FITC)标记驴抗山羊IgG、FITC标记山羊抗兔IgG均为美国Jackson ImmunoResearch公司产品；SYBR Premix Ex Taq ^TM、RNAiso Plus、无酶无菌水、PrimeScript ^TM RT Master Mix均为宝生物工程(大连)有限公司产品；DMIL倒置荧光显微镜为德国Leica公司产品；冰冻切片机、紫外分光光度计、荧光定量PCR仪均为美国Thermo Fisher Scientific公司产品；RNA逆转录仪为美国Bio-Rad公司产品；高速冷冻离心机为德国Eppendorf公司产品；纯水仪为美国Millipore公司产品。

1.2. 局灶性脑缺血模型的建立、分组及干预方式

将大鼠随机分为模型对照组、手术对照组、黄芪甲苷组。参照Longa等 ^{[ 8]} 的方法建立大鼠大脑中动脉阻塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型。大鼠术前禁食不禁水12 h后，采用10%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射麻醉，依次分离右侧颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉，结扎并游离颈外动脉主干，在颈外动脉剪一小口，经颈外动脉将栓线轻轻插入颈内动脉，当尼龙线插入距颈总动脉分叉18~20 mm处有轻微阻力时停止，缺血90 min后将栓线轻轻拔出，恢复血流灌注。结扎颈外动脉，缝合皮肤。大鼠术中用加热毯和白炽灯加热，维持肛温约37 ℃，术后置于恒温箱中直至苏醒。手术对照组术中栓线仅插入约5 mm，其余步骤同模型对照组。用含5%乙醇的等渗氯化钠溶液溶解黄芪甲苷(质量分数为1%)，大鼠造模后即刻腹腔注射给药，用药剂量为40 mg/kg，之后1次/d，连续3 d，即为黄芪甲苷组。模型对照组大鼠的存活率为64.00% (16/25)，手术对照组大鼠无死亡(16/16)，黄芪甲苷组大鼠的存活率为80.00% (16/20)。

1.3. 改良的神经损伤严重程度评分(mNSS)评价神经功能缺损程度

参照文献[ 9]中的方法，大鼠术后第1、3天进行mNSS，包括运动、感觉、反射和平衡实验。mNSS分值为0~18分，正常为0分，分值越高，大鼠神经功能缺损越严重。

1.4. 角试验检测感觉运动的整合功能

大鼠术后第1、3天将两块同样大小木板连成30°角，两木板交界处留一缝隙，将大鼠面向夹角放在两木板中间，当大鼠进入夹角深部时，两侧胡须接触到木板，大鼠会后肢站立、转身，面向后方。正常大鼠随机向左右两侧转身，但缺血大鼠偏好转向非损伤侧。每只大鼠重复10次，分别记录大鼠向右转身的次数。

1.5. TTC染色检测脑梗死体积

术后第3天，每组取6只大鼠用10%水合氯醛麻醉后处死，取脑，-20 ℃冷冻20 min，沿冠状面切成6片，厚度为2 mm，将脑组织切片置于2% TTC染液中，37 ℃下避光染色15~20 min。采用Image-Pro Plus 5.0软件测量脑梗死面积，计算脑梗死体积，并按下式进行校正：梗死体积百分比(%)=[左半脑体积-(右半脑体积-梗死体积]/左半脑体积×100%。

1.6. 实时逆转录PCR检测M1型和M2型小胶质细胞/巨噬细胞相关标志物mRNA表达

取大鼠脑缺血周边区组织，每组4只，用TRIzol法提取总RNA，按照PrimeScript ^TM RT Master Mix试剂盒说明书将RNA逆转录为cDNA。按照SYBR Premix Ex Taq ^TM试剂盒进行PCR。总反应体系10 μL：2×SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 5.0 μL、上下游引物各0.4 μL、50×ROX参比染料Ⅱ 0.2 μL、cDNA 1.0 μL、双蒸水3.0 μL。反应条件：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，40个循环。PCR结束后确认扩增曲线和熔解曲线，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为内参，采用2 ^-ΔΔCt法计算mRNA相对表达量。PCR引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列见 表 1。

表表 1 实时逆转录PCR引物序列

引物名称	引物序列(5′-3′)
CD86	正向：TAGGGATAACCAGGCTCTAC
	反向：CGTGGGTGTCTTTTGCTGTA
iNOS	正向：ATGGCTCCTTCAAAGAGGCA
	反向：CTATTTCCTTTGTTACGGCTTCCA
TNF-α	正向：GGTCCCAACAAGGAGGAGAAG
	反向：GTCTGGGCCATGGAACTGA
IL-1β	正向：TGATGTTCCCATTAGACAGC
	反向：GAGGTGCTGATGTACCAGTT
IL-6	正向：GAGGATACCACTCCCAACAGACC
	反向：AAGTGCATCATCGTTGTTCATACA
CD206	正向：GGTTCCGGTTTGTGGAGCAG
	反向：TCCGTTTGCATTGCCCAGTA
Arg-1	正向：TCCTTAGAGATTATCGGAGCG
	反向：GTCTTTGGCAGATATGCAGG
YM1/2	正向：CAGGGTAATGAGTGGGTTGG
	反向：CACGGCACCTCCTAAATTGT
IL-10	正向：CAAGGCAGTGGAGCAGGTGA
	反向：CCGGGTGGTTCAATTTTTCATT
TGF-β	正向：CTGAGTGGCTGTCTTTTGACGTC
	反向：AAGCCCTGTATTCCGTCTCCTTG
GAPDH	正向：GCCAAGGCTGTGGGCAAGGT
	反向：TCTCCAGGCGGCACGTCAGA

iNOS:诱导型一氧化氮合酶; Arg-1:精氨酸酶1；YM1/2:类几丁质酶3样分子1/2;GAPDH:甘油醛-3-磷酸脱氢酶.

1.7. 免疫荧光双标记法检测小胶质细胞/巨噬细胞Iba1/(CD16/32)和Iba1/CD206表达

术后第3天，每组取6只大鼠，麻醉后经左心室插管快速灌注等渗氯化钠溶液冲洗，随后4%多聚甲醛灌流固定，取脑，4%多聚甲醛后固定、脱水，采用冰冻切片机制备10 μm脑切片。免疫荧光双标记法的具体步骤如下：0.3%聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)室温破膜，3%过氧化氢灭活内源性过氧化物酶，血清封闭，分别加入CD16/32/ Iba1(200:1)、CD206/Iba1(100:1)，4 ℃过夜后加入Cy3标记山羊抗小鼠/驴抗兔和FITC标记山羊抗兔/驴抗山羊二抗(1:100)，室温避光孵育1 h，用含4′, 6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)的封片剂封片。每张切片选取脑缺血周边区组织不重复的3个视野，荧光显微镜下观察并拍照，计数双标记阳性细胞数，取平均值。

1.8. 统计学方法

应用SPSS 20.0进行统计学分析，数值以(${\bar x}$± s)表示，行为学评分采用非参数Kruskal-Wallis H检验，其余均采用单因素方差分析，组间两两比较采用Student-Newman-Keuls法， P < 0.05为差异有统计学意义。

2. 结果

2.1. 黄芪甲苷对脑缺血大鼠mNSS评分的影响

术后第1、3天的mNSS结果显示，手术对照组未出现神经功能缺损；与手术对照组比较，模型对照组术后第1、3天mNSS分值增加(分别为14.20±0.63、13.10±0.74, 均 P < 0.01)；与模型对照组比较，黄芪甲苷组术后第1、3天mNSS分值降低(分别为12.00±0.67、10.20±1.03, 均 P < 0.01)。结果提示，黄芪甲苷可以改善脑缺血大鼠的神经功能缺损。

2.2. 黄芪甲苷对脑缺血大鼠感觉运动整合功能的影响

术后第1、3天的角试验结果显示，手术对照组右转次数分别为5.00±0.67、5.20±0.79；与手术对照组比较，模型对照组右转次数增加(分别为9.90±0.32、9.70±0.48, 均 P < 0.01)；与模型对照组比较，黄芪甲苷组右转次数减少(分别为9.40±0.84、8.50±1.12, P < 0.05)。结果提示，黄芪甲苷可以改善脑缺血大鼠的感觉运动整合功能。

2.3. 黄芪甲苷对脑缺血大鼠脑梗死体积的影响

术后第3天，手术对照组脑组织无梗死，模型对照组和黄芪甲苷组脑梗死体积百分比分别为(32.00±4.47)%和(21.86±4.87)%。与模型对照组比较，黄芪甲苷组脑梗死体积减小( P < 0.01)。各组梗死灶分布见 图 1。结果提示，黄芪甲苷可以减小脑缺血大鼠的脑梗死体积。

图 1 .

各组脑组织梗死体积比较

2, 3, 5-氯化三苯基四氮唑染料(TTC)染色法检测大鼠脑组织梗死体积，正常组织为红色，梗死组织为白色.标尺=1 cm.

2.4. 黄芪甲苷对脑缺血大鼠M1和M2型小胶质细胞/巨噬细胞标志物mRNA表达的影响

与手术对照组比较，模型对照组在术后第3天CD86、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA表达均增加(均 P＜0.01)；与模型对照组比较，黄芪甲苷组CD86、iNOS、TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA表达均减少(均 P＜0.01)，见 图 2。

图 2 .

各组M1型小胶质细胞/巨噬细胞标志物mRNA表达比较( n=4)

与手术对照组比较，**P < 0.01；与模型对照组比较，##P < 0.01.iNOS：诱导型一氧化氮合酶.

与手术对照组比较，模型对照组大鼠在术后第3天精氨酸酶1(Arg-1)、类几丁质酶3样分子1/2(YM1/2)、TGF-β的mRNA表达增加(均 P＜0.05)，IL-10的mRNA表达减少( P＜0.01)，CD206的mRNA表达差异无统计学意义( P>0.05)；与模型对照组比较，黄芪甲苷组大鼠CD206、Arg-1、YM1/2、IL-10和TGF-β的mRNA表达均增加(均 P＜0.01)，见 图 3。

图 3 .

各组M2型小胶质细胞/巨噬细胞标志物mRNA表达比较( n=4)

与手术对照组比较，*P < 0.05，**P < 0.01；与模型对照组比较，##P < 0.01.Arg-1:精氨酸酶1；YM1/2:类几丁质酶3样分子1/2.

结果提示，黄芪甲苷可以减少脑缺血大鼠M1型小胶质细胞/巨噬细胞，增加M2型小胶质细胞/巨噬细胞。

2.5. 黄芪甲苷对脑缺血大鼠小胶质细胞/巨噬细胞M1型和M2型极化的影响

免疫荧光双标记染色结果显示，手术对照组无CD16/32 ⁺/Iba1 ⁺细胞；模型对照组CD16/32 ⁺/ Iba1 ⁺细胞数增加(134.93±45.63)；与模型对照组比较，黄芪甲苷组CD16/32 ⁺/Iba1 ⁺细胞数减少(81.41±16.18， P＜0.05)，见 图 4。

图 4 .

各组小胶质细胞/巨噬细胞CD16/32 ⁺/Iba1 ⁺检测结果

红色荧光为CD16/32阳性表达, 绿色荧光为Iba1阳性表达.手术对照组无CD16/32+/Iba1+细胞；模型对照组CD16/32+/Iba1+细胞数增加；与模型对照组比较，黄芪甲苷组CD16/32+/Iba1+细胞数减少.标尺=50 μm.

手术对照组无CD206 ⁺/Iba1 ⁺细胞；模型对照组和黄芪甲苷组CD206 ⁺/Iba1 ⁺细胞分别为162.07±23.83和371.63±48.83。与模型对照组比较，黄芪甲苷组CD206 ⁺/Iba1 ⁺细胞增加( P＜0.01)，见 图 5。

图 5 .

各组小胶质细胞/巨噬细胞CD206 ⁺/Iba1 ⁺检测结果

绿色荧光为CD206阳性表达，红色荧光为Iba1阳性表达.手术对照组无CD206+/Iba1+细胞；模型对照组CD206+/Iba1+细胞增加；与模型对照组比较，黄芪甲苷组CD206+/Iba1+细胞增加.标尺=50 μm.

结果提示，黄芪甲苷可以抑制脑缺血大鼠小胶质细胞/巨噬细胞M1型极化，促进其M2型极化。

3. 讨论

文献报道，黄芪甲苷对实验性脑缺血具有保护作用，其机制主要与抗氧化、抗炎和抗凋亡有关 ^{[ 7]} 。本文资料进一步证实黄芪甲苷能改善脑缺血大鼠的神经功能缺损，减少脑梗死体积，而且发现黄芪甲苷可促进脑缺血后小胶质细胞从M1型向M2型转化，从而抑制神经炎症反应。

小胶质细胞在生理情况下呈分枝状，突起不断伸缩以监视脑内微环境，维持中枢神经系统稳态。内源性损伤或外源性刺激后小胶质细胞迅速被激活，胞体变大，突起收缩呈阿米巴样，并向损伤区迁移 ^{[ 10- 11]} 。激活的小胶质细胞表型和功能具有高度可塑性，与巨噬细胞一样，有M1和M2两种表型，并可在这两种表型间不断转变。M1型高度表达CD16/32、CD86、主要组织相容性复合体(MHCⅡ)、iNOS，分泌TNF-α、IL-1β、IL-6等促炎因子，加剧神经损伤；而M2型高度表达CD206、Arg1、YM1、抵抗素样分子α(FIZZ1)，分泌IL-10、IL-4、TGF-β等抗炎因子和IGF-1、BDNF等生长因子，促进神经修复 ^{[ 3- 4]} 。本研究选择CD16/32、CD86、iNOS、TNF-α、IL-1β和IL-6作为M1型小胶质细胞/巨噬细胞标志物，CD206、Arg-1、YM1/2、IL-10和TGF-β作为M2型小胶质细胞/巨噬细胞标志物。

小胶质细胞/巨噬细胞的表型在脑缺血后呈动态改变。在脑缺血早期，主要以保护性的M2型为主，而到后期主要以损伤性的M1型为主 ^{[ 5- 6]} 。在脊髓损伤和其他脑损伤中也发现类似现象 ^{[ 12- 13]} 。这些结果提示，脑缺血治疗应从单纯抑制小胶质细胞/巨噬细胞的激活转向调节M1和M2型小胶质细胞/巨噬细胞平衡。近年来大量研究发现，姜黄素、红景天苷、苦参碱和黄芩素等中药及其有效成分可通过促进脑缺血后小胶质细胞/巨噬细胞从M1型向M2型转化从而发挥神经保护作用 ^{[ 14- 17]} 。

黄芪是中药中最常用的补气药，广泛应用于心脑血管疾病的治疗。补阳还五汤是中医治疗脑缺血的代表方剂，其组方特点是大剂量黄芪与少量活血通络药配伍。笔者团队前期研究发现，补阳还五汤能促进脑缺血后小胶质细胞/巨噬细胞从M1型向M2型转化 ^{[ 18]} 。黄芪甲苷是中药黄芪的主要有效成分，对脑缺血损伤具有保护作用。近期体外研究发现，黄芪甲苷保护神经元免受小胶质细胞介导的细胞死亡，其机制与促进小胶质细胞从M1型向M2型转化有关 ^{[ 19]} 。此外，黄芪甲苷可促进脊髓损伤后小胶质细胞向M2型转化，缓解小胶质细胞炎症反应和神经细胞凋亡，从而促进神经功能恢复 ^{[ 20]} 。但黄芪甲苷是否通过促进脑缺血后小胶质细胞从M1向M2型转化从而发挥神经保护作用尚未明确。本文资料显示，黄芪甲苷可抑制M1型小胶质细胞/巨噬细胞标志物CD86、iNOS和促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA表达，促进M2型小胶质细胞/巨噬细胞标志物CD206、Arg1、YM1/2和抗炎因子IL-10、TGF-β mRNA表达。此外，免疫荧光双标记结果进一步验证，黄芪甲苷可减少M1型小胶质细胞/巨噬细胞中CD16/32 ⁺/Iba1 ⁺细胞数量，增加M2型小胶质细胞/巨噬细胞中CD206 ⁺/Iba1 ⁺细胞数量，与PCR结果一致，提示黄芪甲苷可促进脑缺血后小胶质细胞/巨噬细胞从M1向M2型转化，从而抑制缺血脑组织的炎症反应。

综上所述，黄芪甲苷对脑缺血大鼠具有神经保护作用，机制可能与其促进小胶质细胞/巨噬细胞从M1向M2型转化、减轻神经炎症反应有关，但其调控小胶质细胞/巨噬细胞极化的分子机制尚待进一步研究。