Abstract
目的:
研制可替宁单克隆抗体（单抗），并建立检测人体尿液样本中可替宁的免疫检测方法。
方法:
利用人工合成的可替宁-牛血清白蛋白（COT-BSA）免疫BALB/c小鼠，通过细胞融合技术筛选一种对可替宁具有高特异性和敏感性的单抗，并将该单抗用于建立间接竞争ELISA（ic-ELISA）和胶体金免疫层析试纸，检测人体尿液中可替宁的含量。
结果:
所研制的可替宁单抗经ic-ELISA鉴定，半数有效抑制浓度为21 ng/mL，经胶体金免疫层析试纸鉴定，截断值为100 ng/mL。所建立的ic-ELISA方法检测限为0.1 ng/mL，回收率为99.41%~117.98%，批间和批内变异系数分别小于等于15.31%和15.07%。所建立的胶体金免疫层析试纸稳定性和重复性检测准确率均为100%。
结论:
以制备的可替宁单抗为基础开发的ic-ELISA和胶体金免疫层析试纸可快速、可靠地检测人体尿液中可替宁含量，可作为环境烟草烟雾在人体内暴露程度的有效检测方法。
Abstract
Objective:
To prepare monoclonal antibody against cotinine (COT) and to establish immunoassay for detecting COT in human urinary samples.
Methods:
BALB/c mice were immunized with synthesized cotinine-bovine serum albumin (COT-BSA) to screen monoclonal antibody with technique of cell fusion. The monoclonal antibody was used for the indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay (ic-ELISA) and colloidal gold immunochromatographic strip assay for the detection of COT in human urine.
Results:
The monoclonal antibody against COT was identified by ic-ELISA with a 50%inhibitive concentration (IC 50) value of 21 ng/mL; and it was also identified by colloidal gold immunochromatographic strip assay with a cut-off value of 100 ng/mL. For ic-ELISA, the range of detection was 0-100 ng/mL with a minimal limit of 0.1 ng/mL; the recovery of assay was 99.41%-117.98%, and the intra-assay and inter-assay coefficient variations were not higher than 15.31%and 15.07%, respectively. For colloidal gold immunochromatographic strip assay, the accuracy of stability and repeatability both were 100%.
Conclusion:
The ic-ELISA and colloidal gold immunochromatographic strip assay using the prepared monoclonal antibody against COT have been proved to be reliable for the rapid detection of COT in human urines, which may be used for monitoring of environmental tobacco smoke.
Keywords: Cotinine, Monoclonal antibody, Indirect competitive enzyme linked immunosorbent assay, Immunochromatographic strip, Urine
据报道，全球约有13亿人受到吸烟的影响 [ 1] , 烟草使用在全世界导致近600万人死亡 [ 2] 。虽然许多国家已经通过法律来控制吸烟，但吸烟的普遍程度仍然很高 [ 3] 。非主动吸烟者在家里、汽车上、工作场所和公共场所也可能接触到二手烟 [ 4] 。
尼古丁是烟草中的主要化合物，可建立和维持人体对烟草的依赖。可替宁(cotinine)是尼古丁在人体内的主要代谢物 [ 5] ，是评估主动吸烟者和非主动吸烟者暴露于环境烟草烟雾的重要生物标志物 [ 6] 。虽然液相色谱、高效液相色谱、气相色谱和高效液相色谱联用质谱等方法已用于可替宁的检测 [ 7- 9] ，但这些方法需要样品预处理，且成本高、耗时长。免疫检测具有抗体与抗原特异性强、灵敏度高、操作简单、通量大、成本低等优点。本研究筛选了具有高特异度和敏感度的可替宁单克隆抗体(单抗)，并建立了间接竞争ELISA(indirect competitive ELISA，ic-ELISA)和胶体金免疫层析试纸检测方法用于检测人体尿液中的可替宁。
1. 材料与方法
1.1. 试剂与溶液
可替宁为美国Alfa Aesar公司产品；可替宁-牛血清白蛋白(COT-BSA)和可替宁-卵清白蛋白(COT-OVA)委托广州优抗多生物技术公司合成；吐温-20和DMSO为国药集团化学试剂有限公司产品；弗氏完全佐剂和不完全佐剂为美国Sigma公司产品；HRP标记的山羊抗小鼠IgG(HRP-GaM IgG)为武汉博士德生物工程有限公司产品；3, 3′，5, 5′-四甲基联苯胺(TMB)为生工生物工程(上海)股份有限公司产品；BALB/c小鼠购自浙江大学实验动物中心。所有动物实验均通过浙江大学实验动物中心伦理委员会审批。
所用缓冲溶液如下：①PBS(10 mmol/L磷酸钠，137 mmol/L氯化钠，2.7 mmol/L氯化钾，调酸碱度值至7.4)，用于配制标准溶液；②包被缓冲液为0.1 mol/L碳酸盐缓冲液(酸碱度值为9.6)；③洗涤缓冲液PBST为含吐温-20(体积分数为0.05 %)的PBS；④封闭缓冲液和检测缓冲液为含脱脂乳(质量浓度为0.05 kg/L)的PBST；⑤底物缓冲液为0.1 mol/L柠檬酸盐(酸碱度值为5.5)；⑥显色液为10 mL底物缓冲液中加入125 μL TMB溶液和2 μL 30 %过氧化氢溶液；⑦胶体金重悬缓冲液为添加1 % BSA和5 %蔗糖的0.01 mol/L Tris-HCl(酸碱度值为8.2)。
1.2. 可替宁单抗的制备
1.2.1. 免疫接种及抗血清效价评估
在5只6~8周龄的BALB/c雌性小鼠额背部多处皮下注射COT-BSA免疫原。针对小分子类的化合物，为了获得高质量的抗体，采用实验室以往的免疫程序 [ 10] ，具体如下：第一次免疫时采用弗氏完全佐剂与50 μg免疫原/老鼠(每只老鼠注射50 μg免疫原)进行乳化后接种；在随后免疫中，采用弗氏不完全佐剂与20 μg免疫原/老鼠(每只老鼠注射20 μg免疫原)进行乳化后接种，免疫间隔时间为3周；在最后一次免疫后1周内收集血液样本，采用间接ELISA法检测抗血清的效价，采用ic-ELISA检测可替宁的抑制率 [ 11] 。选择抗血清效价和可替宁抑制率较高的小鼠进行后续实验。
1.2.2. 细胞融合和克隆
融合前3 d，小鼠腹腔注射25 μg等渗氯化钠溶液稀释的免疫原进行冲击免疫。处死小鼠并取出脾脏细胞，将其与培养至指数生长期sp2/0骨髓瘤细胞混合，逐滴加入无菌聚乙二醇溶液进行细胞融合。融合细胞(杂交瘤)在含20 % FBS的HAT(黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶)培养基中培养。将培养板中的杂交瘤在37 ℃含5 %二氧化碳的培养箱中培养。融合后第5天，补加100 μL HAT培养基。融合后第10天，用ic-ELISA法检测培养上清液。利用有限稀释倍数法对阳性孔进行亚克隆，获得稳定的细胞系。扩大培养稳定分泌可替宁单抗的细胞株并在液氮中冷冻保存，以备使用。
1.2.3. 抗体制备及纯化
向BALB/c小鼠腹腔注射0.5 mL弗氏不完全佐剂, 一周后再次向小鼠腹腔注射5×10 5杂交瘤细胞以产生腹水。注射7~10 d后，观察到小鼠腹部增大，收集腹水，700× g离心10 min，用辛酸-硫酸铵沉淀纯化。纯化后的单抗加入50 %甘油并保存在-20 ℃中。
1.3. 基于可替宁单抗建立ELISA法
1.3.1. 棋盘滴定法确定抗原、抗体最佳工作条件 [ 12]
将COT-OVA用包被液稀释至0.5、0.25、0.125和0.0625 μg/mL，采用上述浓度进行包被及孵育，洗板后进行封闭，而后将抗体稀释至1 :10 000、1 :15 000、1 :20 000、1 :25 000和1 :30 000上样孵育，洗板后加入1 :5000稀释的二抗孵育，清洗后加入显色液，终止后进行读数。选择吸光度值在1.0左右，抗原、抗体用量最少且抑制率最高的浓度为最佳工作浓度。
1.3.2. 标准曲线的建立
在抗原抗体的最佳工作条件下，将可替宁标准品稀释至100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.5625和0 ng/mL。采用ic-ELISA检测并用酶标仪测定波长450 nm处的吸光度值，计算半数有效抑制浓度(IC 50)并绘制标准曲线。具体步骤：①向96孔酶标板每孔加入100 μL抗原(COT-OVA)，于37 ℃孵化2 h；②用PBST将包被好的酶标板清洗3次后，每孔加入200 μL封闭液，于37 ℃孵化1 h；③倒掉封闭液并洗板3次，每孔加入50 μL可替宁标准品和50 μL抗体，于37 ℃孵化0.5 h；④洗板3次，每孔加入50 μL HRP-GaM IgG，于37 ℃孵化0.5 h；⑤洗板4次，每孔加入100 μL显色液，于37 ℃闭光孵化20 min，随后加入50 μL终止液(1 mol/L硫酸)终止酶反应；⑥使用酶标仪测量波长450 nm处的吸光度值。
1.3.3. 回收率与精密度
在标准曲线范围内向空白尿液样本添加标准品，对ic-ELISA法进行方法学考察。向空白尿液样本中添加1、10和100 ng/mL可替宁标准品，测定批间和批内的变异系数(CV)和回收率。
1.4. 基于可替宁单抗制备胶体金免疫层析试纸
1.4.1. 胶体金标记单抗的制备
分别向5管2 mL的胶体金溶液逐滴加入0.1 mol/L碳酸钾调节酸碱度值至6、6.5、7、7.5和8，依次加入20 μg单抗，混合物在室温下不断上下旋转0.5 h。然后加入50 μL质量浓度为0.1 kg/L的BSA溶液，继续室温下不断上下旋转0.5 h，用于稳定胶体金标记单抗以及封闭未结合的反应位点。反应期间，观察胶体金溶液的颜色，选择胶体金溶液未变色的最低酸碱度值为最佳反应条件。然后，3000× g离心40 min，去除多余的单抗和阻断剂，弃上清液，向沉淀中加入200 μL重悬缓冲液混匀。
1.4.2. 胶体金免疫层析试纸的制备
胶体金免疫层析试纸由聚氯乙烯板、样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸收垫组成。将胶体金标记的单抗以波长523 nm处吸光度值为1.0、2.0、3.0的浓度喷涂在胶体金垫上。将COT-BSA和羊抗小鼠IgG分别以1.0 mg/mL和0.5 mg/mL的浓度喷涂在硝酸纤维素膜上形成检测线和对照线(T线和C线)。将胶体金垫与硝酸纤维素膜在37 ℃下干燥12 h，将样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜、吸水垫重叠粘贴在聚氯乙烯板上，切成4 mm宽的条状。用制备好的胶体金免疫层析试纸检测标准品浓度为0和100 ng/mL的可替宁溶液，选择标准品浓度为0时T线显色较深且标准品浓度为100 ng/mL时T线不显色的胶体金标记单抗浓度进行后续的性能评估。
1.4.3. 胶体金免疫层析试纸的性能评估
阴性尿液样本加入0、25、50、100和200 ng/mL的可替宁标准品，用胶体金免疫层析试纸分析，找出T线完全消失的阈值，将该阈值设定为阳性值。通过检测15个阴性和阳性标准品，评价胶体金免疫层析试纸的测量重复性。将试纸在37 ℃保存3个月，通过5个阴性和阳性标准品评价胶体金免疫层析试纸的稳定性。
1.5. ELISA法和胶体金免疫层析试纸检测人体尿液样本
在杭州仟源恩氏基因技术有限公司内部收集35份人体尿液样本，其中吸烟者样本7份，非吸烟者样本28份。采用本研究建立的ELISA法和胶体金免疫层析试纸对尿液样本进行检测，初步监测人体烟草接触水平。
1.6. 统计学方法
采用SPSS 17软件对样本数据进行统计分析，吸烟组与非吸烟组比较采用非配对 t检验， P＜0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1. 小鼠抗血清效价评估结果
图 1A显示，1号和2号小鼠的抗体效价较高，抗血清稀释至1/8000时，吸光度值仍为1.0左右； 图 1B显示，当可替宁的浓度为1000 ng/mL时，1号小鼠的抑制作用最明显，抑制率高达80 %。上述结果提示，1号小鼠与可替宁的亲和力最强，因此选择1号小鼠进行细胞融合。
图 1 .
小鼠抗血清效价测定结果
A：抗血清与可替宁-卵清白蛋白结合的效价；B：抗血清在1000 ng/mL可替宁中的抑制率.
2.2. 杂交瘤细胞筛选结果
采用有限稀释法对阳性孔中的杂交瘤进行3次亚克隆，最后扩增并保存了8个产生稳定抗体的细胞系，其中3号细胞系(9E8D)分泌的上清液在可替宁浓度为200 ng/mL时抑制率最高，达到了60.19 %，见 表 1。因此，本研究选择3号细胞系及其产生抗体用于建立ic-ELISA和制备胶体金免疫层析试纸。
表表 1 8个细胞系在可替宁浓度为200 ng/mL时的吸光度值和抑制率
|
细胞系 |
吸光度值 |
抑制率(%) |
|
|
空白对照 |
200 ng/mL可替宁 |
||
|
1 |
2.0004 |
1.0820 |
45.91 |
|
2 |
1.7586 |
0.7433 |
57.73 |
|
3 |
1.6826 |
0.6698 |
60.19 |
|
4 |
2.0456 |
1.2216 |
40.28 |
|
5 |
1.6284 |
0.6914 |
57.54 |
|
6 |
1.8616 |
0.8453 |
54.59 |
|
7 |
2.2196 |
1.3150 |
40.76 |
|
8 |
2.2202 |
1.4785 |
33.41 |
2.3. ELISA检测结果
采用棋盘滴定法对抗体9E8D进行了考察，结果见 表 2。包被抗原的最佳浓度为0.125 μg/mL，抗体9E8D的最佳稀释比例为1 :25 000。
表表 2 可替宁抗原抗体最佳工作浓度棋盘滴定检测结果
|
可替宁(ng/mL) |
抗体稀释度 |
吸光度值 |
抑制率(%) |
|||||||
|
1 μg/mL抗原浓度 |
0.5 μg/mL抗原浓度 |
0.25 μg/mL抗原浓度 |
0.125 μg/mL抗原浓度 |
1 μg/mL抗原浓度 |
0.5 μg/mL抗原浓度 |
0.25 μg/mL抗原浓度 |
0.125 μg/mL抗原浓度 |
|||
|
0 |
1/5000 |
2.4299 |
2.2164 |
1.9120 |
1.7091 |
— |
— |
— |
— |
|
|
1/25 000 |
2.0535 |
1.7288 |
1.0103 |
1.0260 |
— |
— |
— |
— |
||
|
1/125 000 |
1.4541 |
1.1787 |
0.7782 |
0.6413 |
— |
— |
— |
— |
||
|
1/625 000 |
0.8476 |
0.7364 |
0.4663 |
0.3653 |
— |
— |
— |
— |
||
|
20 |
1/5000 |
2.2372 |
0.7227 |
1.1807 |
1.0589 |
7.93 |
67.39 |
38.25 |
38.04 |
|
|
1/25 000 |
1.7636 |
1.0984 |
0.7414 |
0.5596 |
14.12 |
36.46 |
26.62 |
45.46 |
||
|
1/125 000 |
1.0936 |
0.7138 |
0.4603 |
0.3150 |
24.79 |
39.44 |
40.85 |
50.88 |
||
|
1/625 000 |
0.6310 |
0.6025 |
0.3932 |
0.1862 |
25.55 |
18.18 |
15.68 |
49.03 |
可替宁的ic-ELISA标准曲线如 图 2所示。可替宁的浓度为100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.5625和0 ng/mL。以lg(1+可替宁浓度)为 X轴，以450 nm处的吸光度值为 Y轴，得到的线性回归方程具有良好相关性，线性方程为 Y=-0.4427 X +1.1661， R 2=0.9911。ic-ELISA的IC 50值和检测限分别为21 ng/mL和0.1 ng/mL。
图 2 .
间接竞争ELISA法检测可替宁的标准曲线
A：抗血清与可替宁-卵清白蛋白结合的效价；B：抗血清在1000 ng/mL可替宁中的抑制率.
ic-ELISA法进行尿液样本添加试验结果显示，回收率为99.41 % ~117.98 %，批间和批内变异系数分别小于15.31 %和15.07 %，见 表 3。
表表 3 间接竞争ELISA法检测尿液中可替宁的变异系数及回收率
|
可替宁(ng/mL) |
批间检测 |
批内检测 |
|||||||||
|
n |
平均值 |
标准差 |
变异系数(%) |
回收率(%) |
n |
平均值 |
标准差 |
变异系数(%) |
回收率(%) |
||
|
100 |
4 |
102.95 |
6.40 |
6.22 |
102.95 |
6 |
103.32 |
6.99 |
6.77 |
103.32 |
|
|
10 |
4 |
11.80 |
1.69 |
14.31 |
117.98 |
6 |
10.13 |
1.53 |
15.07 |
101.29 |
|
|
1 |
4 |
1.06 |
0.16 |
15.31 |
106.17 |
6 |
0.99 |
0.11 |
10.95 |
99.41 |
2.4. 胶体金免疫层析试纸检测结果
当胶体金标记抗体的标记量为20 μg/mL时，抗体与胶体金结合的最佳酸碱度值为7.5。胶体金标记单抗在波长523 nm时吸光度值为2.0，检测线上的COT-OVA工作浓度为1.0 mg/mL，对照线上的羊抗小鼠IgG的工作浓度为0.4 mg/mL。在最佳条件下，用胶体金免疫层析试纸对添加0、25、50、100和200 ng/mL可替宁的阴性尿液样本进行分析，结果见 图 3。结果显示，试纸T线完全消失的阈值为100 ng/mL，胶体金免疫层析试纸在贮存期间的稳定性和重复性较好。
图 3 .
胶体金免疫层析试纸灵敏度、稳定性及重复性检测结果
A：可替宁浓度分别为0、25、50、100和200 ng/mL时胶体金免疫层析试纸结果；B：胶体金免疫层析试纸的稳定性试验；C：胶体金免疫层析试纸的测量重复性.
2.5. 人体样本检测结果
应用建立的ic-ELISA定量测定35份人体尿液样本，当测定样本的浓度超过标准曲线的线性范围时，将尿液稀释适当倍数后再进行检测。吸烟者样本中可替宁浓度为126.87~13814.13 ng/mL，非吸烟者样本可替宁浓度在148.74 ng/mL及以下。
采用制备的胶体金免疫层析试纸进行检测，吸烟者样本中可替宁均为阳性；非吸烟者样本中，阳性2例(ic-ELISA测定结果均高于截断值100 ng/mL)，其余均为阴性。结果可见，两种方法可替宁检测结果吻合。检测出的非吸烟样本中的可替宁很有可能来源于生活中的被动吸烟过程。
3. 讨论
吸烟会增加个体患多种严重健康疾病的风险，是世界范围内导致死亡和疾病的主要原因之一 [ 13] 。二手烟来自点燃的香烟头和吸烟者呼出的烟。吸入二手烟，也被称为被动吸烟，会增加二手烟暴露个体患上与吸烟者相同疾病的风险 [ 14] 。虽然世界各国都相继出台了各种禁烟政策，但在公共场所随处吸烟的现象屡禁不止。公众对是否暴露于环境烟草烟雾以及潜在健康影响的担忧与日俱增。对人体内环境烟草烟雾的含量进行测定可反映个体是否暴露于环境烟草烟雾。测定烟草相关代谢物作为人类的生物标志物可能是一个有用的工具。本文资料中，我们使用可替宁作为生物标志物，利用单抗同时建立了两种针对可替宁的免疫学检测方法(ic-ELISA和胶体金免疫层析试纸)，两种方法的原理是分析物与固定抗原竞争与抗体结合。由于可替宁是小分子抗原，因此在对抗体进行评估时，还需采用ic-ELISA检测可替宁的抑制率。ic-ELISA的原理是固相抗原与游离抗原(样品)竞争结合抗体，游离抗原浓度越高，竞争优势越明显，游离抗原会结合并带走更多的抗原导致最终的吸光度值减小。设置一系列不同浓度的抗原进行反应，得到吸光度值随抗原浓度变化的线性曲线，从而实现对抗原的检测。
ELISA法适用于分析物的定量检测。在我们之前的研究中，开发了基于多克隆抗体的竞争性ELISA来量化人类尿液样本中的可替宁 [ 11] 。但多克隆抗体的生产存在批量差异，难以保证抗体生产的一致性。稳定的高特异性、高亲和力的单抗是建立良好的免疫检测方法的基础。本文制备了一种高质量的可替宁单抗，该抗体可用于人体尿液中可替宁的ELISA定量检测。本研究建立的ELISA法目前已完成方法学验证，应用于少量样本检测结果显示，吸烟者样本中的可替宁含量显著高于非吸烟者样本。许多文献报道了人群体内可替宁的含量，不同种族人群的可替宁水平不同 [ 15- 17] ，但吸烟人群中可替宁含量均高于非吸烟人群。本研究建立的ELISA法有望用于监测人群环境烟草接触水平以及为环境烟草暴露水平对人体危害研究提供可靠方法。胶体金免疫层析试纸具有快速、简便、廉价等优点，本研究中胶体金免疫层析条带的截断值为100 ng/mL，可用于人体尿液样本中可替宁的快速定性检测。
综上，本研究制备了一种针对可替宁的特异性单抗，同时建立了针对可替宁的两种免疫检测方法(ic-ELISA和胶体金免疫层析试纸)，两种方法均可准确、快速地检测出人体尿液样本中的可替宁，有望成为监测环境烟草接触的有效检测方法。
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Associated Data
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Data Citations
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