无比山药丸对氢化可的松致肾阳虚模型小鼠性功能的影响

Abstract

目的:

探讨无比山药丸对氢化可的松致肾阳虚模型小鼠性功能的影响。

方法:

采用雄性昆明小鼠皮下注射氢化可的松10 d制备肾阳虚模型，灌胃给予无比山药丸（0.91、1.82、2.73 g/kg）连续9周。观察小鼠一般行为学（自主活动、抓力）；交配实验检测雄鼠性行为（捕捉、骑跨、射精次数及潜伏期）；ELISA法测定血清皮质醇、促肾上腺皮质激素、促黄体生成素、促卵泡生成素、雌二醇、睾酮水平；计算肾脏、附睾、睾丸和精囊器官指数；HE染色观察小鼠睾丸组织形态；TUNEL法检测睾丸细胞凋亡情况；免疫组织化学法检测睾丸组织增殖细胞核抗原（PCNA）蛋白表达水平。

结果:

无比山药丸能提高肾阳虚模型小鼠自主活动次数、抓力及捕捉次数，缩短捕捉潜伏期（均 P< 0.01）；升高血清睾酮、皮质醇、促肾上腺皮质激素水平，降低血清促卵泡生成素水平（ P< 0.05或 P< 0.01）；提高睾丸指数（ P< 0.05），改善睾丸病变；抑制细胞凋亡，促进睾丸PCNA蛋白表达。

结论:

无比山药丸能改善氢化可的松致肾阳虚小鼠性功能障碍，其机制可能与调节下丘脑-垂体-肾上腺轴，促进睾丸组织细胞增殖，抑制细胞凋亡有关。

无比山药丸，原名“无比薯蓣丸”，首见于唐代《备急千金要方》，后《太平惠民和剂局方》收录时命名为“无比山药丸”，延续至今。该丸由山药、熟地、菟丝子、泽泻等12味药组成，具有健脾补肾的功效，主要用于脾肾两虚，食少肌瘦，腰膝酸软，目眩耳鸣等。《素问·灵兰秘典论》曰：“肾者，作强之官，伎巧出焉”。作强、伎巧指性功能，即肾影响男女生殖器官的发育及生殖能力。目前，性功能障碍已严重影响男性健康 ^{[ 1]} ，其中肾阳虚较为常见 ^{[ 2]} 。古书中论述“凡病人虚劳，多日无力，别无热证者，宜补之，可用无比山药丸则愈矣”。临床研究显示，无比山药丸对肾炎 ^{[ 3]} 、肾性血尿 ^{[ 4]} 等肾脏疾病具有一定疗效，但其对肾阳虚性功能的改善作用尚缺乏相关研究。

本团队前期研究发现无比山药丸对腺嘌呤致肾阳虚大鼠性功能障碍有一定疗效，其机制可能与调节下丘脑-垂体-性腺轴、影响睾丸TGF-β1、CYP19蛋白表达有关 ^{[ 5]} 。基于“肾主生殖”理论及本团队前期研究成果，本文探讨了无比山药丸对氢化可的松致肾阳虚模型小鼠性功能的影响，并从下丘脑-垂体-肾上腺轴、性激素分泌、生殖细胞的增殖与凋亡角度探讨其作用机制，验证无比山药丸改善肾阳虚性功能低下的作用，并对相关机制进行研究。

1. 材料与方法

1.1. 动物、试剂和仪器

清洁级昆明小鼠60只，雄性，4周龄，体质量为(18±2)g，购自上海杰思捷实验动物有限公司，合格证号：311620400007145，动物生产许可证号：SCXK(沪)2013-0006。清洁级昆明小鼠60只，雌性，5~6周龄，体质量为(25±2)g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，合格证号：2015000547220，动物生产许可证号：SCXK(沪)2017-0005。按照动物实验伦理规范进行实验。

无比山药丸为杭州胡庆余堂药业有限公司产品；金匮肾气丸为北京同仁堂科技发展股份有限公司制药厂产品；氢化可的松注射液为天津金耀药业有限公司产品；黄体酮注射液、苯甲酸雌二醇注射液均为四川金科药业有限责任公司产品；皮质醇、促肾上腺皮质激素、睾酮、雌二醇、黄体生成素、卵泡刺激素试剂盒均为上海源叶生物科技有限公司产品；HE染液为南京建成生物工程研究所产品；二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒、抗荧光淬灭封片液、一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒均为碧云天生物技术有限公司产品；小鼠二步法免疫组织化学试剂盒为北京中杉金桥生物科技有限公司产品；增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)抗体为美国Santa Cruz Biotechnology公司产品。

YLS-1A多功能小鼠自动活动记录仪、YLS-13A大小鼠抓力测定仪为山东省医学科学院设备站产品；Micro CL17微量离心机为美国Thermo Fisher Scientific公司产品；PowerWave 340酶标仪为美国BioTek公司产品；Tissue-Tek VIP 5Jr自动脱水机为日本Sakura Finetek公司产品；MEIKO EC360包埋机为美康仪器设备制造高淳县有限公司产品；RM2245型半自动切片机为德国Leica公司产品；正置荧光显微镜为德国Zeiss公司产品。

1.2. 模型制备及干预措施

健康雄性小鼠60只，按体质量随机分为6组，即正常对照组、模型对照组、金匮肾气丸组(1.365 g/kg)、无比山药丸小、中、大3个剂量组(0.91、1.82、2.73 g/kg)，每组10只。各给药组按对应剂量灌胃，正常对照组和模型对照组灌胃给予等体积蒸馏水(0.1 mL/10 g)，1次/d，连续6周。灌胃6周后，除正常对照组外，其余各组按25 mg/kg的剂量皮下注射氢化可的松10 d造成肾阳虚模型小鼠。造模期间正常灌胃给药，共持续9周。造模期间观察小鼠体征变化，参照国家技术监督局发布的《中医临床诊疗术语》中肾阳虚证的判断准则，小鼠出现腰膝酸软(抓力降低)、性欲减退(捕捉、骑跨障碍)、畏寒肢冷(恶寒扎堆)等肾阳虚主证，精神萎靡(自主活动降低)、发槁齿摇(皮毛无光泽)等肾阳虚次证，认定造模成功。模型对照组死亡1只，金匮肾气丸组死亡2只，两组最终纳入统计9只和8只，其余组最终纳入统计均为10只。

无比山药丸剂量设计依据：无比山药丸临床剂量为每日18 g(以体质量60 kg计算)，换算成小鼠给药剂量约为2.73 g/kg，结合前期预实验结果，将2.73 g/kg定为大剂量，根据大剂量:中剂量:小剂量=3:2:1，设计小鼠给药剂量分别为2.73、1.82、0.91 g/kg。

1.3. 一般行为学观察

实验期间每3 d称一次体质量并记录，交配实验前1 d检测小鼠抓力和自主活动。采用抓力测定仪测定小鼠抓力。将抓力测定仪放置于水平桌面上，然后将小鼠轻放至抓力板上，待小鼠抓牢后，抓住鼠尾缓慢匀速向后牵拉，仪器发出声响时的数值记为小鼠最大抓力值，每只小鼠测定3次，取平均值。自主活动是在下午安静昏暗环境下，将小鼠放入自主活动箱内，适应5 min后，记录接下来5 min内小鼠的活动次数。

1.4. 交配实验检测雄鼠性行为

小鼠交配实验在末次给药当天20:00—24:00进行。每只雌鼠于交配实验前48 h皮下注射苯甲酸雌二醇注射液20 μg，交配实验前4 h注射黄体酮注射液0.5 mg，促使发情时间同步于交配时间。按文献[ 5]中的方法观察小鼠的交配行为30 min，分别记录各组雄鼠的捕捉、骑跨、射精的次数及潜伏期。

1.5. ELISA法检测血清皮质醇、促肾上腺皮质激素及性激素水平

小鼠交配实验结束1 d后，禁食不禁水12 h，麻醉后眼眶取血约0.7 mL，二氧化碳窒息处死，血样于4 ℃环境下存放2 h，1200× g离心10 min2次，取上层血清，采用ELISA法检测血清中促肾上腺皮质激素、皮质醇、睾酮、雌二醇、黄体生成素、卵泡刺激素水平。

1.6. 器官指数测定

小鼠末次给药后，禁食不禁水12 h，称重，处死后取肾、精囊、附睾和睾丸，称重并计算器官指数，即器官指数=器官重量(mg)/小鼠体质量(g)。

1.7. HE染色观察睾丸组织形态

取经10 %甲醛固定的小鼠睾丸组织进行脱水、包埋、切片，制得4 μm石蜡切片，进行常规HE染色，中性树脂封片干燥后，光镜下观察睾丸组织形态学变化。

1.8. TUNEL法测定睾丸组织细胞凋亡情况

取制备好的4 μm睾丸组织石蜡切片，按TUNEL试剂盒说明书上的步骤操作，用抗荧光淬灭封片液封片后在荧光显微镜下观察，荧光细胞即为凋亡细胞。

1.9. 免疫组织化学法测定睾丸组织PCNA表达

取4 μm睾丸组织石蜡切片，通过抗原修复、3 %过氧化氢消除内源性过氧化氢酶的活性、5 % BSA封闭、4 ℃孵育一抗过夜、37 ℃孵育二抗15 min、DAB显色、苏木素染色、脱水、中性树脂封片干燥，镜下观察睾丸组织PCNA的表达。

1.10. 统计学方法

采用SPSS 20.0软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差(${\bar x}$± s)表示，采用单因素方差分析，方差齐时用LSD分析，方差不齐时用Tamhane's T2分析。 P＜0.05表示差异有统计学意义。

2. 结果

2.1. 无比山药丸对肾阳虚证候的影响

与正常对照组比较，模型对照组自主活动次数和抓力值均下降(均 P＜0.01)，提示造模成功。与模型对照组比较，无比山药丸组自主活动次数增加、抓力增大，自主活动次数增加以小剂量组最明显( P＜0.01)，抓力值在3个剂量组间差异不明显( 表 1)。结果提示，无比山药丸可以改善肾阳虚模型小鼠的肾阳虚证候。

表1 各组自主活动及抓力比较

组别	n	自主活动(次)	抓力(g)
正常对照组	10	190±28	199±28
模型对照组	9	152±15 **	157±10 **
金匮肾气丸组	8	172±24	191±37
无比山药丸小剂量组	10	183±27 ##	188±6 ##
无比山药丸中剂量组	10	172±16	189±6 ##
无比山药丸大剂量组	10	177±19 #	191±16 ##

与正常对照组比较， ^** P＜0.01；与模型对照组比较， ^# P＜0.05， ^## P＜0.01.

2.2. 无比山药丸对肾阳虚小鼠性行为的影响

与正常对照组比较，模型对照组捕捉、骑跨潜伏期均延长(均 P＜0.01)，捕捉次数减少( P＜0.01)；与模型对照组比较，无比山药丸小、中、大剂量组捕捉潜伏期缩短(均 P＜0.01)，其中大剂量组捕捉次数增加( P＜0.01)。骑跨次数、射精潜伏期和射精次数各组间差异无统计学意义(均 P＞0.05)，见 表 2。结果提示，无比山药丸可以改善肾阳虚模型小鼠的性行为。

表2 各组性行为比较

组别	n	捕捉		射精		骑跨
潜伏期(s)	次数(次)		潜伏期(s)	次数(次)		潜伏期(s)	次数(次)
正常对照组	10	54±20	13.0±3.7		968±334	4.7±2.9		1238±400	3.5±2.7
模型对照组	9	86±31 **	6.7±2.5 **		1432±366 **	2.3±2.1		1528±261	1.7±1.7
金匮肾气丸组	8	82±20	7.0±1.8		1326±339	3.5±2.7		1416±337	2.9±2.2
无比山药丸小剂量组	10	53±26 ##	7.9±1.5		1337±388	3.2±2.4		1417±404	2.5±1.9
无比山药丸中剂量组	10	54±32 ##	8.3±1.9		1210±289	4.5±3.0		1276±327	3.4±2.3
无比山药丸大剂量组	10	47±20 ##	11.6±2.2 ##		1113±382	4.6±3.2		1221±381	3.5±2.6

与正常对照组比较， ^** P＜0.01；与模型对照组比较， ^## P＜0.01.

2.3. 无比山药丸对肾阳虚小鼠促肾上腺皮质激素和皮质醇的影响

与正常对照组比较，模型对照组血清中促肾上腺皮质激素、皮质醇水平均降低(均 P＜0.01)；与模型对照组比较，无比山药丸小、中、大剂量组促肾上腺皮质激素和皮质醇水平升高，其中小剂量组和中剂量组促肾上腺皮质激素水平与模型对照组差异有统计学意义(均 P＜0.05)，大剂量组皮质醇水平与模型对照组差异有统计学意义( P＜0.05)，见 表 3。结果提示，无比山药丸可以改善肾阳虚模型小鼠的促肾上腺皮质激素及皮质醇水平。

表3 各组促肾上腺皮质激素和皮质醇水平比较

组别	n	促肾上腺皮质激素(pmol/L)	皮质醇(nmol/L)
正常对照组	10	8.60±1.40	23.17±3.31
模型对照组	9	6.77±1.46 **	18.46±2.52 **
金匮肾气丸组	8	8.24±1.17 #	21.67±2.54
无比山药丸小剂量组	10	8.43±1.57 #	21.26±4.68
无比山药丸中剂量组	10	8.45±1.47 #	21.04±2.54
无比山药丸大剂量组	10	7.77±1.19	21.76±3.97 #

与正常对照组比较， ^** P＜0.01；与模型对照组比较， ^# P＜0.05.

2.4. 无比山药丸对肾阳虚小鼠性激素的影响

与正常对照组比较，模型对照组血清中黄体生成素水平升高( P＜0.05)，睾酮水平降低( P＜0.01)；与模型对照组比较，无比山药丸小剂量组卵泡刺激素水平降低( P＜0.01)，中、大剂量组睾酮水平升高(均 P＜0.05)，见 表 4。结果提示，无比山药丸可以调节肾阳虚模型小鼠的性激素水平。

表4 各组性激素水平比较

组别	n	黄体生成素(U/L)	卵泡刺激素(U/L)	雌二醇(pmol/L)	睾酮(nmol/L)
正常对照组	10	4.35±0.41	38.1±3.3	38.7±8.1	2.02±0.30
模型对照组	9	4.91±0.10 *	42.4±4.9	35.5±3.0	1.54±0.30 **
金匮肾气丸组	8	4.57±0.35	42.8±6.6	33.3±4.3	1.78±0.22
无比山药丸小剂量组	10	4.48±0.49	34.2±7.0 ##	35.0±3.1	1.52±0.16
无比山药丸中剂量组	10	4.51±0.54	37.1±7.3	38.9±3.7	1.78±0.30 #
无比山药丸大剂量组	10	4.64±0.31	41.8±7.8	39.4±3.6	1.82±0.22 #

与正常对照组比较， ^* P＜0.05， ^** P＜0.01；与模型对照组比较， ^# P＜0.05， ^## P＜0.01.

2.5. 无比山药丸对肾阳虚小鼠器官指数的影响

与正常对照组比较，模型对照组睾丸指数降低；无比山药丸大剂量组睾丸指数较模型对照组增加( P＜0.05)，见 表 5。结果提示，无比山药丸可以改善肾阳虚模型小鼠的睾丸指数。

表5 各组生殖器官和肾脏指数比较

组别	n	睾丸指数	附睾指数	精囊指数	肾脏指数
正常对照组	10	6.59±0.95	1.33±0.22	4.72±1.23	15.59±1.60
模型对照组	9	5.78±0.47	1.29±0.21	4.89±0.68	15.30±2.12
金匮肾气丸组	8	6.04±1.96	1.25±0.25	4.59±1.62	14.83±0.90
无比山药丸小剂量组	10	6.06±1.18	1.32±0.32	4.59±0.83	15.62±3.23
无比山药丸中剂量组	10	5.89±0.84	1.21±0.17	5.22±1.02	15.82±1.82
无比山药丸大剂量组	10	6.86±0.95 *	1.47±0.12	5.32±1.37	16.84±3.68

与模型对照组比较， ^* P＜0.05.

2.6. 无比山药丸对肾阳虚小鼠睾丸组织形态学的影响

正常对照组睾丸生精小管管径较大、排列紧密，间质丰富，各级生精细胞形态、数量正常，排列规则，细胞成熟度高。与正常对照组比较，模型对照组睾丸萎缩，生精小管管径变小，排列稀疏，间质细胞数量明显减少，管内各级生精细胞排列紊乱，管腔内精子数目减少，细胞成熟度降低。与模型对照组比较，无比山药丸各剂量组睾丸病变明显改善，见 图 1。结果提示，无比山药丸可以改善肾阳虚模型小鼠的睾丸组织形态学。

2.7. 无比山药丸对肾阳虚小鼠睾丸组织细胞凋亡的影响

与正常对照组比较，模型对照组睾丸组织凋亡细胞数量增加，主要见于精原细胞和初级精母细胞；与模型对照组比较，无比山药丸各剂量组睾丸组织凋亡细胞数量减少，见 图 2。结果提示，无比山药丸可以抑制肾阳虚模型小鼠睾丸组织细胞凋亡。

2.8. 无比山药丸对肾阳虚小鼠睾丸组织PCNA表达的影响

PCNA在小鼠睾丸生精细胞内表达，主要为精原细胞和部分精母细胞。与正常对照组相比，模型对照组睾丸PCNA蛋白表达减少；与模型对照组相比，无比山药丸各剂量组睾丸PCNA蛋白表达增加，见 图 3。结果提示，无比山药丸可以提高肾阳虚模型小鼠睾丸组织PCNA蛋白表达，促进肾阳虚模型小鼠睾丸组织细胞增殖。

3. 讨论

肾阳虚又称命门火衰，是元阳不足、温煦失职、气化无权而出现的腰膝酸软、神疲乏力以及性机能衰退等临床表现的概称。多因素体阳虚、年高肾亏、久病及肾、房劳过度，损耗肾阳所致。肾阳为一身阳气之本，“五脏之阳气，非此不能发”，肾阳推动和激发脏腑的各种机能。中医往往将补阳药和补阴药相配伍来治疗肾阳虚，认为阳得阴助而生化无穷。无比山药丸用山药益肾健脾，配以肉苁蓉、巴戟天、菟丝子、杜仲温补肾阳，五味子、山茱萸、地黄培补真阴，泽泻、茯苓泄肾浊、利水湿，更以赤石脂涩精止遗，阴阳并补、补中有运，补而不滞。

本研究采用较为经典的皮下注射氢化可的松致肾阳虚模型 ^{[ 6]} ，观察无比山药丸对肾阳虚模型小鼠性功能的影响。注射氢化可的松等外源性糖皮质激素，可抑制垂体前叶促肾上腺皮质激素的释放，使肾上腺皮质分泌的类固醇激素含量减少，出现肾阳虚症状 ^{[ 7]} 。肾阳虚证的主要症状包括腰膝酸软、精神萎靡、性功能障碍等，用抓力指标量化“腰膝酸软”，用自主活动次数量化“精神萎靡”，用生殖器官指数及性功能指标等量化“性功能障碍” ^{[ 8]} 。小鼠交配实验是性功能鉴定的常用方法。研究结果显示，无比山药丸可提高模型小鼠促肾上腺皮质激素、皮质醇水平，提高自主活动、抓力、睾丸指数及捕捉次数，缩短模型小鼠捕捉潜伏期。生殖器官萎缩及病变在一定程度上可导致性功能障碍。HE染色结果显示，无比山药丸可改善模型小鼠睾丸萎缩，生精小管管径变小、排列稀疏，生精细胞排列紊乱，间质细胞及精子数量减少，细胞成熟度低等。以上研究结果提示，无比山药丸可能通过改善肾阳虚小鼠肾上腺轴功能，改善肾阳虚模型小鼠精神疲惫、腰膝酸软、性功能障碍等肾阳虚证候。

性行为受性激素调节，下丘脑合成促性腺激素释放激素，促使垂体促性腺激素细胞分泌黄体生成素和卵泡刺激素，黄体生成素和卵泡刺激素调节性激素睾酮、雌二醇的合成及分泌，而性激素又会反向调节垂体及下丘脑，形成反馈回路来维持内分泌稳态 ^{[ 9]} 。本文资料显示，无比山药丸可降低模型小鼠卵泡刺激素水平，升高睾酮水平，推测无比山药丸可能通过作用调节性激素分泌水平，从而改善性功能。

精子的发生与生精细胞增殖、凋亡密切相关，机体通过生精细胞增殖、凋亡来维持精子的正常数量和功能 ^{[ 10]} 。研究显示，肾阳虚动物模型睾丸生精细胞增殖减少、凋亡增多可能是生精障碍的原因之一 ^{[ 11]} 。本团队前期研究发现，无比山药丸可影响睾丸组织TGF-β1、CYP19蛋白表达，但对睾丸组织细胞增殖凋亡情况缺乏相关探讨。本文资料显示，无比山药丸可减轻模型小鼠睾丸细胞凋亡。PCNA表达可衡量细胞增殖状态，睾丸发生生精障碍时，PCNA表达显著降低 ^{[ 12]} 。免疫组织化学结果显示，无比山药丸可增加睾丸组织PCNA表达。因此推测无比山药丸改善肾阳虚模型小鼠生精功能的作用机制可能与促进睾丸组织细胞增殖、抑制细胞凋亡有关。

综上所述，无比山药丸可以通过影响下丘脑-垂体-肾上腺轴、调节性激素分泌水平及促进生精细胞增殖、抑制细胞凋亡来调整性功能，同时改善肾阳虚小鼠腰膝酸软、神疲乏力等肾阳虚表征。在改善性功能障碍方面，仅大剂量(2.73 g/kg)能提高睾丸组织器官指数及捕捉次数，且大剂量对改善主要性激素水平(睾酮)及降低捕捉潜伏期疗效最为显著。在改善肾阳虚表征及下丘脑-垂体-肾上腺轴方面，各剂量间疗效差异并不明显。因此，无比山药丸大剂量对肾阳虚性功能障碍疗效较优。