二苯乙烯苷可抑制中波紫外线诱导的人皮肤成纤维细胞光老化

Abstract

目的

研究二苯乙烯苷（TSG）对紫外线B（UVB）诱导的人皮肤成纤维细胞（HSF）应激性提早衰老的作用及可能的机制。

方法

UVB小剂量、多次照射HSF，每次照射完毕后分别用0.02、0.10、0.50 mmol/L浓度的TSG处理。实验分为6组：空白对照组、模型对照组、UVB+0.02 mmol/L TSG组、UVB+0.10 mmol/L TSG组、UVB+0.50 mmol/L TSG组、TSG对照组。采用细胞计数法（CCK-8）检测细胞增殖活性；细胞化学染色法检测衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）表达；TBA法、WST-1法测定细胞丙二醛（MDA）含量和超氧化物歧化酶（SOD）活性；ELISA法测定细胞上清液中基质金属蛋白酶-1（MMP-1）的含量变化。

结果

与空白对照组比较，模型对照组细胞增殖活性减弱（ P < 0.05），SA-β-gal染色呈强阳性，细胞裂解液中SOD活性减弱、MDA含量增加，MMP-1浓度升高（ P < 0.05或 P < 0.01）。与模型对照组比较，UVB+各浓度TSG组细胞增殖活性改善（均 P < 0.05），SA-β-gal染色阳性率下降，细胞裂解液中SOD活性增强、MDA含量减少，MMP-1浓度减小（ P < 0.05或 P < 0.01）。

结论

TSG可以在一定程度上抑制UVB诱导的HSF应激性提早衰老，该作用可能与改善氧化应激、抑制MMP-1高表达有关。

皮肤光老化是由于皮肤长期暴露于紫外线造成的慢性损伤 ^{[ 1]} 。长期的紫外线暴露可引发真皮中成纤维细胞增殖能力下降、细胞内氧化应激平衡被打破，皮肤老化相关蛋白——基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)激活，这些改变与加速皮肤老化密切相关。其中，氧化应激反应不仅是皮肤衰老的重要原因，其产生的活性氧簇还可触发相关信号传导通路诱导皮肤组织MMP表达增多。后者可降解胶原蛋白等细胞外基质成分，引起皮肤松弛、皱纹形成等皮肤光老化改变 ^{[ 2]} 。为减缓皮肤衰老过程，很多抗氧化剂受到关注 ^{[ 2- 3]} 。二苯乙烯苷(tetrahydroxy stilbene-2-O-β-D-glycoside，TSG)是传统中药何首乌中的主要有效成分 ^{[ 4]} ，具有多种生理活性，包括抗氧化、抗衰老、保护微血管病变、减轻糖尿病并发症、预防老年痴呆等作用 ^{[ 5- 7]} 。为探究TSG对抗皮肤光老化的生物学作用及机制，本研究在体外培养人皮肤成纤维细胞(human skin fibroblast，HSF)，采用紫外线B(ultraviolet radiation B, UVB)低剂量、反复多次照射的方法诱导皮肤细胞的衰老模型。在此模型基础上用不同浓度TSG进行干预，观察衰老相关生物学标志的变化，现予报道。

原代培养的HSF由浙江大学化学工程与生物工程学院联合化学反应工程研究所惠赠。TSG粉末购于浙江省食品药品检验研究院，纯度大于95 %。细胞衰老相关β-半乳糖苷酶(senescence-associated-β-galactosidase, SA-β-gal)染色试剂盒购于碧云天生物技术研究所；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和丙二醛(maloudialdehyde，MDA)检测试剂盒、考马斯亮蓝溶液购于南京建成生物工程研究所；人MMP-1 ELISA试剂盒购于武汉博士德生物工程有限公司；CCK-8试剂盒购于上海翊圣生物科技有限公司。UVB发生仪为波兰Philips公司产品；辐射度计为美国International Light公司产品。

复苏HSF并接种于25 cm ²培养瓶中，用含10 % FBS、0.99 U/mL青霉素和链霉素的高糖DMEM培养基培养，置于37 ℃、5 %二氧化碳的培养箱中孵育。

取第4~10代对数生长期细胞，按一定密度分别接种于96孔板、6孔板、直径为100 mm的细胞培养皿中。实验分为6组：空白对照组、模型对照组、UVB+0.02 mmol/L TSG组、UVB+0.10 mmol/L TSG组、UVB+0.50 mmol/L TSG组、TSG对照组，每组设6个复孔。细胞生长至60 % ~70 %融合时，吸除培养基并用PBS清洗一次，在细胞表面覆一薄层PBS后开始照射。将UVB发生仪光源放置在培养板上方10 cm处，单次照射时间为20 s，单次剂量为10 mJ/cm ²。每次照射完毕后吸除PBS，模型对照组换为含1 % FBS的DMEM培养基继续培养，UVB+各浓度TSG组换为含1 % FBS和相应浓度药物的DMEM培养基继续培养。设定总照射剂量为60 mJ/cm ²，即每日照射2次，连续3 d。末次UVB照射后吸除PBS，模型对照组换为含10 % FBS的DMEM继续培养，UVB照射+各浓度TSG组换为含10 % FBS和对应浓度药物的DMEM培养基继续培养。空白对照组为相同条件下未经UVB照射和TSG处理的细胞，TSG对照组为用含0.50 mmol/L TSG的培养基予以同样处理，但不接受UVB照射的细胞。

将细胞按2.0×10 ³个/孔、100 μL细胞悬液/孔接种于96孔板中，根据照光与否分两块板接种。另设6个空白孔(每孔加入100 μL细胞培养液，作为吸光度检测时的调零)。末次照射后48 h，每孔加入10 μL CCK-8溶液，在培养箱中继续孵育1~4 h。用酶标仪在450 nm处测吸光度值。

末次UVB照射后48 h，吸除6孔板中细胞培养液，PBS清洗细胞1次，于各孔加入1 mL β-半乳糖苷酶染色固定液，15 min后移除细胞固定液，PBS洗涤细胞3次，每次3 min；吸除PBS，每孔加入1 mL染色工作液，保鲜膜封板以防蒸发，37 ℃孵育过夜，倒置显微镜下观察染色结果。衰老细胞显示为深蓝着染。细胞衰老发生率=染色阳性细胞/细胞总数×100 %。至少计数500个细胞。

末次UVB照射后48 h，收集6孔板培养的各组细胞于离心管中，弃去培养液，加入0.5 mL PBS重悬细胞，冰水浴超声破碎获得细胞匀浆。根据试剂盒说明书要求进行检测并计算结果。计算公式为：MDA含量(nmol/mg)=(测定管吸光度值－测定空白管吸光度值)÷(标准管吸光度值－标准空白管吸光度值)×标准品浓度÷蛋白含量; SOD活性(U/mg)=(对照管吸光度值－测定管吸光度值)/对照管吸光度值÷50 % ×反应液总体积/取样量÷蛋白含量。

末次UVB照射后48 h，收集培养皿中各组细胞培养上清液，2000~3000转/min离心20 min，取上清液分装。将各浓度标准品分别取100 μL依次加入酶标板的一排7孔中，一孔只加样品稀释液100 μL作为零孔，另设一孔作为3, 3′, 5, 5′-四甲基联苯胺(TMB)空白显色孔。将各组样本标记，分别加入相应孔中(100 μL/孔)。严格按照说明书步骤操作，反应结束后用酶标仪在450 nm处测定吸光度值，绘制标准曲线，将样本的吸光度值代入标准曲线方程，计算其浓度。

采用SPSS 13.0软件进行统计学分析。计量资料以均数±标准差( x ± s)描述，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用Tukey检验。显著性检验水平为 ɑ=0.05。

TSG对照组与空白对照组细胞增殖活性差异无统计学意义(0.461±0.017与0.478±0.025， P>0.05)，说明0.50 mmol/L浓度的TSG对HSF无明显毒性作用。与空白对照组比较，模型对照组(0.233±0.030)细胞活性减弱( P < 0.05)。UVB+各浓度TSG组细胞增殖活性(0.318±0.017、0.335±0.029、0.355± 0.022)与模型对照组差异均有统计学意义(均 P < 0.05)。UVB+各浓度TSG组间两两比较差异无统计学意义(均 P>0.05)。结果提示，HSF在接受累积剂量为60 mJ/cm ²的UVB处理之后，细胞增殖活性减弱，TSG处理后细胞增殖活性有所改善。

模型对照组SA-β-gal染色呈强阳性，加入TSG后，HSF的SA-β-gal染色阳性率下降( 图 1)。UVB+各浓度TSG组(85±4、58±6、47±5)与模型对照组(90±4)比较，除了UVB+0.02 mmol/L TSG组外，其余两组差异均有统计学意义(均 P < 0.05)。结果提示，TSG可在一定程度上拮抗UVB诱导的细胞衰老。

图1.

各组衰老相关β-半乳糖苷酶细胞化学染色图

空白对照组、TSG对照组可见个别蓝染细胞；模型对照组、UVB+各浓度TSG组可见不同程度较多数量的蓝染细胞.标尺=20 μm.UVB:紫外线B；TSG：二苯乙烯苷.

与空白对照组比较，模型对照组细胞裂解液中SOD活性减弱而MDA含量增加，差异均有统计学意义(均 P < 0.01)。与模型对照组比较，UVB+各浓度TSG组细胞MDA含量减少(均 P < 0.01)。除UVB+0.02 mmol/L TSG组外，其他UVB+TSG组的SOD活性均增强(均 P < 0.05)，见 图 2。结果提示，TSG可在一定程度上改善UVB诱导的氧化应激损伤。

图2.

各组SOD、MDA检测结果比较

与模型对照组比较， ^* P < 0.05.UVB:紫外线B；TSG：二苯乙烯苷.SOD：超氧化物歧化酶；MDA：丙二醛.

模型对照组MMP-1浓度最高，与空白对照组差异有统计学意义( P < 0.05)。UVB+0.10 mmol/L TSG组、UVB+0.50 mmol/L TSG组与模型对照组差异均有统计学意义(均 P < 0.05)。UVB+0.02 mmol/L TSG组、UVB+0.10 mmol/L TSG组、UVB+0.50 mmol/L、TSG对照组两两比较差异均有统计学意义(均 P < 0.05， 图 3)。结果提示，TSG可抑制UVB照射后HSF中光老化相关因子MMP-1的高表达。

图3.

各组衰老相关蛋白MMP-1浓度比较

与模型对照组比较， ^* P < 0.05；与UVB+0.02 mmol/L TSG组比较， ^# P < 0.05；与UVB+0.10 mmol/L TSG组比较， ^△ P < 0.05.UVB:紫外线B；TSG：二苯乙烯苷；MMP-1：基质金属蛋白酶1.

成纤维细胞是真皮的主要细胞，由于其在皮肤光老化过程中有很大改变，大多数学者采用成纤维细胞作为实验对象。与单次照射造成的损伤不同，光老化的原因在于长期的紫外线暴露。基于此，Debacq-Chainiaux等 ^{[ 8]} 选用UVB紫外光源，对HSF进行亚毒性剂量、多次辐射，这种由慢性、亚毒性剂量紫外线辐射或其他应激刺激引发的细胞衰老，称为应激性提早衰老。本研究参照上述方法，选用UVB对HSF用亚毒性剂量(10 mJ/cm ²)每天2次连续3 d照射，使HSF进入提早衰老状态。通过检测细胞的体外增殖能力、SA-β-gal活性和MMP-1衰老相关蛋白水平来评价该光老化模型的可靠性。

既往研究表明，TSG具有较强的抗氧化、清除自由基功能，作为一种有效的抗衰老成分，在老龄化凸显的当今社会极具研究价值。TSG对小鼠皮肤光老化和长波紫外线诱导的Hacat细胞氧化损伤有一定的保护作用 ^{[ 9- 10]} ，而其对人体皮肤细胞的作用和分子学改变还需要进一步研究论证。细胞的体外增殖能力和SA-β-gal活性是用于体外衰老研究的可靠生物学标志 ^{[ 11- 12]} 。在本研究中，CCK-8检测发现，空白对照组和TSG对照组(0.50 mmol/L)的细胞增殖活性几乎无差别，说明高浓度TSG对HSF无明显毒性作用。与模型对照组比较，UVB+各浓度TSG组细胞增殖能力增强，SA-β-gal活性减弱，说明经TSG干预后，UVB诱导的细胞衰老生物学指标表达下降。

皮肤光老化的分子生物学研究认为，自由基对细胞的损伤是皮肤衰老的原因之一。紫外线作用于皮肤细胞，细胞内的发色基团吸收紫外线能量后被激发，与皮肤组织中的分子氧相互作用，发生生物学反应，生成活性氧簇 ^{[ 13]} 。长期紫外线辐射使活性氧在皮肤组织中局部蓄积引发氧化应激反应，这种损伤不断积累，是皮肤老化的主要原因 ^{[ 14]} 。活性氧中的自由基成分攻击细胞膜中的脂质产生脂质过氧化物，其代谢产物MDA活性高低间接反映了细胞受到氧自由基攻击的严重程度。而SOD是机体最重要的抗氧化酶 ^{[ 15]} ，可保护细胞免受氧化应激损伤。本研究采用MDA和SOD作为观测氧化应激反应的指标，结果发现，与空白对照组比较，模型对照组SOD活性减弱而MDA含量急剧增加。因此，TSG可在一定程度上改善UVB诱导的氧化应激损伤。

过多的活性氧除了可以打破氧化应激平衡之外，还是引发皮肤组织内MMP表达增高的始动因素。紫外线刺激可通过细胞表面受体的活化和活性氧的产生，启动丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)和NF-κB信号通路，激活特定转录因子(AP-1、NF-κB)，调节MMP和胶原蛋白等靶基因表达 ^{[ 2]} 。与UVA相比，UVB能更快速地激活MMP，体内激活的MMP可导致皮肤真皮中支撑皮肤结构的胶原蛋白和弹性蛋白过度降解，从而出现皮肤松弛、皱纹形成等衰老症状。MMP-1作为MMP家族中的重要成员，可降解真皮中Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白，在紫外线辐射导致的光老化方面起着重要作用 ^{[ 16]} 。本研究结果显示，模型对照组MMP-1浓度最高，提示UVB照射可刺激成纤维细胞分泌MMP-1水平升高；TSG各浓度处理组MMP-1浓度减少，在TSG浓度达到0.50 mmol/L时，细胞培养上清液中MMP-1含量下降为模型对照组的一半以下，证实TSG可抑制UVB照射诱导的MMP-1高分泌，对HSF有光保护作用。

综上所述，TSG可提高HSF的增殖活性，改善氧化应激反应，抑制光老化相关因子MMP-1的高表达，对UVB诱导的HSF应激性提早衰老有一定的抑制作用。

Funding Statement

浙江省公益性技术应用研究计划（2016C33204）