儿童Alport综合征COL4A5基因型及临床特点分析

Abstract

目的

探讨儿童Alport综合征（Alport syndrome，AS）致病基因COL4A5基因型与临床表型的特点。

方法

回顾性分析19例存在COL4A5基因突变的AS患儿的基因检测结果和临床资料。

结果

19例COL4A5基因突变导致的AS患儿中，1例（5%）存在COL4A5基因新突变位点c.3372A>G(p.P1124=)，其表现为AS合并IgA血管炎肾炎；3例（16%）存在COL4A5基因大片段缺失，其中2例（例7为新突变位点：loss51-53）起病即存在肉眼血尿和蛋白尿，1例（例13，存在新突变位点：loss3-53）仅有镜下血尿；其余15例（79%）患儿均为AS的常见临床表型，其中7例存在COL4A5基因新突变位点。3例（16%）患儿合并COL4A4基因突变，1例（5%）合并COL4A3基因突变，在这些双基因突变患儿中有2例起病即为肉眼血尿合并蛋白尿。

结论

该研究拓展了AS致病基因COL4A5的基因型和表型谱；发生COL4A5基因大片段缺失突变或COL4A5合并COL4A3或COL4A4的双基因突变患儿的临床表现更严重。

Alport综合征（Alport syndrome，AS）是继多囊性肾病后导致遗传性进行性肾功能衰竭最常见的原因之一^［1］。AS主要表现为持续性血尿和进行性肾功能衰竭等，肾外特征主要包括感音神经性耳聋及眼部病变等。AS是由编码肾小球基底膜Ⅳ型胶原α3、α4、α5链的COL4A3、COL4A4和COL4A5基因突变引起的，导致肾小球基底膜结构破坏^［2］。在遗传方式上，AS包括X-连锁Alport综合征（X-link Alport syndrome，XLAS）、常染色体隐性Alport综合征（autosomal recessive Alport syndrome，ARAS）和常染色体显性Alport综合征（autosomal dominant Alport syndrome，ADAS）3种。AS患儿中，XLAS约占85%，通常由COL4A5基因突变引起；而ARAS和ADAS分别约占14%和1%，是由COL4A3或COL4A4基因的纯合突变或复合杂合突变引起。据报道，AS的患病率约为1/5 000^［3］，儿童AS约有13%^［4］。AS早期很难发现，肾活检或者基因检测是必要的。尽管有关AS致病基因的基因型与临床表型的研究已取得一定进展，但随着医学技术的进步与发展，新的基因型不断被发现，其基因型与表型的关系有待进一步完善。本研究拟通过回顾性分析我中心近5年收治的19例XLAS患儿基因检测结果及临床资料，探讨COL4A5基因型与临床表型的特点。

1. 资料与方法

1.1. 研究对象

选择2017年4月—2022年3月就诊于郑州大学附属儿童医院肾脏风湿科、符合AS诊断标准且资料完整的19例患儿为研究对象。根据2018年《Alport综合征诊断和治疗专家推荐意见》^［5］，符合以下条件中（1）+（2）/（3）/（4）即可诊断：（1）主要表现为持续性的肾小球源性血尿或血尿伴有蛋白尿；（2）肾活检组织学检查中电镜下可见肾小球基底膜弥漫性增厚或厚薄不一、致密层撕裂分层、篮网状改变；（3）Ⅳ型胶原α链免疫荧光检查提示α3、α4、α5链免疫荧光染色异常或皮肤基底Ⅳ型胶原α5链免疫荧光染色异常；（4）基因检测发现COL4A5基因具有一个致病性突变。

1.2. 资料收集

通过医院电子病历系统收集患儿性别、起病年龄、临床表现、家族史、尿常规、肾功能、听力、眼部检查结果等临床资料，收集患儿肾脏组织光镜、免疫荧光和电镜结果。

1.3. 基因检测

采集患儿及其家系成员的外周血标本每人2 mL（乙二胺四乙酸抗凝血）送至第三方公司（智因东方北京全谱医学检验实验室、北京迈基诺基因科技股份有限公司），采用IDT的xGen Exome Research Panel v2.0进行全外显子组捕获测序。基因突变分析依据美国医学遗传学与基因组学学会 （American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG）制定的测序变异解读指南进行致病性等级分类^［6］。对候选致病基因进行聚合酶链反应后，经ABI3730测序仪进行Sanger测序验证。

所有研究对象的监护人均对本研究知情同意，并签署书面知情同意书。本研究获郑州大学附属儿童医院伦理委员会批准（2023-K-042）。

2. 结果

2.1. 一般情况

19例AS患儿中，男性12例（63%），女性7例（37%），男女比例为1.7∶1。起病年龄范围1岁1个月至11岁8个月，中位年龄为3.7岁，≤3岁者6例（32%），>3岁且<6岁者6例（32%），≥6岁者7例（37%）。19例（100%）均以血尿为首发表现，11例（58%）合并蛋白尿，2例（11%）有听力损伤。19例患儿中，17例（89%）家族史阳性。见表1。

表1.

19例AS患儿的临床表现

编号	性别	起病年龄	起病表现	家族史	肾脏表现			肾外表现	电镜下表现	α3链	α5链
					24 h尿蛋白定量(mg/d)	尿红细胞(个/μL)	尿蛋白定性
1	女	4岁11个月	镜下血尿	父亲为尿毒症，已故	45	193	-	无	未做	未做	未做
2	女	2岁4个月	肉眼血尿	母亲有蛋白尿	208	607	++	无	未见典型基底膜致密层撕裂、分层改变	表达正常	节段性阳性
3	女	2岁8个月	镜下血尿	父亲为慢性肾脏病5期	54	166	-	无	未做	未做	未做
4	男	11岁8个月	镜下血尿	母亲有血尿、蛋白尿	186	224	-	听力异常	未见典型基底膜致密层撕裂、分层改变	节段性阳性	节段性阳性
5	男	2岁	肉眼血尿	母亲有血尿	300	426	++	无	基底膜厚薄不均，可见节段性分层、撕裂	表达缺失	表达缺失
6	男	9岁	镜下血尿	母亲有血尿，舅舅有肾病	3 235	721	+++	听力异常	未做	未做	未做
7	男	3岁8个月	肉眼血尿	母亲有蛋白尿	207	52	+	无	基底膜厚薄不一，基底膜致密层可见撕裂、分层改变	表达缺失	表达缺失
8	男	1岁8个月	镜下血尿	无	214	7 948	+	无	基底膜厚薄不一，基底膜致密物节段性撕裂、分层改变	表达缺失	表达缺失
9	男	1岁7个月	肉眼血尿	无	未做	1 400	++	无	基底膜厚薄不一，可见基底膜致密层撕裂、分层改变	表达缺失	表达缺失
10	男	3岁1个月	镜下血尿	母亲有血尿蛋白尿，外婆因急性肾炎尿毒症去世	200	26	-	无	未做	未做	未做
11	男	6岁	肉眼血尿	母亲、妹妹有镜下血尿，外婆、外公有肉眼血尿	274	3 826	+	无	基底膜节段性变薄，基底膜致密层可见节段性撕裂、分层改变	节段性阳性	节段性阳性
12	男	4岁4个月	肉眼血尿	母亲有血尿、蛋白尿	95	504	++	无	基底膜厚薄不一，基底膜致密层增厚，部分呈撕裂状和蛛网状	未做	未做
13	男	10岁4个月	镜下血尿	母亲有血尿	64	140	+-	无	未见典型基底膜致密层撕裂、分层改变	表达正常	表达正常
14	女	1岁1个月	镜下血尿	父亲、叔叔确诊为慢性肾脏病5期，均伴听力减退	16	81	-	无	未做	未做	未做
15	女	6岁9个月	镜下血尿	父亲、姐姐均有镜下血尿	43	600	-	无	未见典型基底膜致密层撕裂、分层改变	表达正常	表达缺失
16	女	9岁	肉眼血尿	母亲有血尿、蛋白尿	993	3 445	+	无	未做	未做	未做
17	男	10岁6个月	肉眼血尿	母亲有血尿、蛋白尿	1 076	1 332	++	无	未做	未做	未做
18	男	3岁4个月	肉眼血尿	父亲有血尿	22	144	-	无	未做	未做	未做
19	女	3岁2个月	镜下血尿	姐姐有镜下血尿	97	300	-	无	肾小球基底膜厚薄不一，局部可疑撕裂、分层改变	表达正常	节段性阳性

注：蛋白尿定义为尿中蛋白含量超过正常范围时称之为蛋白尿，如尿蛋白含量>150 mg/d或>4 mg/(m²·h)或100 mg/L，或尿蛋白质定性检查为阳性^［7］。

2.2. AS患儿基因诊断及遗传学特点

19例AS患儿分别来自19个家系。单纯COL4A5基因突变15例（79%），其中错义突变7种，大片段缺失突变3种，剪接突变2种，截断突变1种，移码突变1种，同义突变1种，其中有10个新突变位点；COL4A5合并COL4A3或COL4A4基因突变4例（例16、17、18、19）。通过Sanger测序家系验证，12种基因突变来自母亲，6种基因突变来自父亲，1例为自发突变，4例突变来源不详。见表2。

表2.

19例AS患儿的基因突变位点及致病性分析

编号	突变基因	外显子位置	核苷酸变化	氨基酸变化	het/hemi	致病性分析	突变类型	突变来源	是否报道	遗传方式
1	COL4A5	Exon9	c.529G>C	p.G177R	het	可能致病	错义突变	不详 (父亲未采样)	是	XLD
2	COL4A5	Exon47	c.4444C>T	p.Q1482*204	het	可能致病	截断突变	母亲	否	XLD
3	COL4A5	Exon10	c.590C>T	p.L197L	het	未知	错义突变	母亲	否	XLD
4	COL4A5	Exon30	c.2440G>A	p.G814A	hemi	可能致病	错义突变	母亲	否	XLD
5	COL4A5	Exon43	c.3925-1G>A	splicing	hemi	致病	剪接突变	母亲	是	XLD
6	COL4A5	Exon23	c.1543-1544delGG	p.E516Kfs*28	hemi	可能致病	移码突变	不详 (父母未采样)	否	XLD
7	COL4A5	loss51-53	loss51-53		hemi	致病	缺失突变	母亲	否	XLD
8	COL4A5	Exon31	c.2605G>A	p.G869R	hemi	致病	错义突变	自发	是	XLD
9	COL4A5	loss2-37	loss2-37		hemi	致病	缺失突变	不详 (父母未采样)	是	XLD
10	COL4A5	-	c.321+1(I VS5)G>T	-	hemi	可能致病	剪接突变	母亲	否	XLD
11	COL4A5	Exon23	c.1543G>A	p.G515R	hemi	可能致病	错义突变	母亲	是	XLD
12	COL4A5	Exon41	c.3721G>T	p.G1241C	het	可能致病	错义突变	母亲	是	XLD
13	COL4A5	Exon3	c.143G>A	p.G48E	hemi	可能致病	错义突变	母亲	否	XLD
14	COL4A5	loss3-53	loss3-53		het	致病	缺失突变	父亲	否	XLD
15	COL4A5	Exon37	c.3372A>G	p.P1124=	het	未知	同义突变	父亲	否	XLD
16	COL4A5	Exon14	c.834+5G>A	splicing	het	可能致病	剪接突变	母亲	是	双基因突变
	COL4A4	Exon46	c4421C>T	p.T1474M	het	未知	错义突变	不详 (父亲未采样)	是
17	COL4A5	Exon22	c.1424G>C	p.G475A	hemi	未知	错义突变	母亲	否	双基因突变
	COL4A4	Exon31	c.2722C>T	p.R908W	het	未知	错义突变	父亲	否
18	COL4A5	Exon43	c.3940C>T	p.P1314S	hemi	未知	错义突变	母亲	是	双基因突变
	COL4A3	Exon42	c.3627G>A	p.M1209I	het	未知	错义突变	父亲	是
19	COL4A5	Exon21	c.1414G>A	p.G472R	het	可能致病	错义突变	父亲	是	双基因突变
	COL4A4	Exon48	c.4961C>A	p.T1654K	het	未知	错义突变	父亲	否

注：［hemi］半合子突变；［het］杂合变异；［XLD］X连锁Alport综合征。-表示该突变发生在Exon4往后一位的5号内含子，未发生在外显子内，氨基酸变化未知。空格表示大片段缺失，氨基酸变化未知。

2.3. 肾脏病理结果

11例患儿完成肾活检。光镜结果提示11例（100%）均为肾小球轻微病变。电镜结果显示，6例（55%）可见基底膜致密层撕裂、分层改变；1例（9%）为局部可疑撕裂、分层改变；4例（36%）未见致密层撕裂、分层改变。11例行肾活检患儿中，10例行Ⅳ型胶原免疫荧光检测，其中4例（40%）α3、α5均表达缺失；2例（20%）α3表达正常，α5节段性阳性；2例（20%）α3、α5节段性阳性；1例（10%）α3表达正常，α5表达缺失；1例（10%）α3、α5表达正常。见表1、图1。

图1. 部分患儿典型的肾脏病理图 A~C图为光镜下结果，A、B图均为过碘酸雪夫染色，图中可见肾小球系膜细胞和基质轻微增生，肾小管上皮细胞空泡变性；C图为苏木精-伊红染色，图片未见异常。D~F图为Ⅳ型胶原免疫荧光染色，D、F图可见α5链表达缺失；E图可见α5链有肾小球基底膜及包曼氏囊节段性阳性、肾小管基底膜表达缺失。G~I图为电镜下结果，G图可见基底膜厚薄不一，厚度100~170 nm，基底膜致密物节段性撕裂、分层改变；H图可见基底膜节段性变薄；I图可见基底膜致密层撕裂、分层改变，空泡变性。上述图片放大倍数均为400×。.

2.4. COL4A5基因型与表型关联性

3例患儿存在COL4A5基因大片段缺失（例7，loss51-53；例9，loss2-37；例14，loss3-53），其中例7、例9起病即存在肉眼血尿和蛋白尿，例14起病仅有镜下血尿，其父亲及叔叔均为慢性肾脏病5期并伴有听力减退，基因检测提示其父亲与叔叔在COL4A5基因突变位点处存在与患儿相同的缺失。1例（例15）表现为AS合并IgA血管炎肾炎，其临床表现仅有镜下血尿，结合肾脏病理及基因检测结果明确诊断为COL4A5基因突变的AS。

2.5. 随访

19例患儿中，12例失访，7例不定期于我院复诊。截至2023年4月14日，中位随访时间26（范围：16~69）个月，7例患儿肾功能均正常，病情未进展。

3. 讨论

AS是一种预后较差的遗传性肾脏疾病，由于病情进展速度较快，早期诊断十分重要。据报道，皮肤基底膜Ⅳ型胶原α5链免疫荧光染色、肾活检电镜检查及基因检测对AS的检出率分别为77.8％、92.6％和96.6％^［8］。因此，肾活检及基因检测对诊断该病是必要的。

本研究有11例患儿行肾活检，10例患儿行Ⅳ型胶原免疫荧光染色，结果显示Ⅳ型胶原染色诊断率为90%（9/10），电镜下诊断率为55%（6/11），Ⅳ型胶原免疫荧光检测诊断率较高，电镜诊断率较低，可能与样本量较少有关。研究证明基因检测对诊断AS至关重要^［9］。本研究有1例患儿（例13），家族史阳性，临床表现无特异性，肾活检无AS典型改变，但基因检测结果提示为COL4A5基因突变的AS。另有1例患儿（例15），以反复出血性皮疹入院，临床诊断IgA血管炎肾炎，因患儿合并孤立性血尿，行肾活检提示未见典型基底膜致密层撕裂、分层改变，Ⅳ型胶原染色显示α5链表达缺失。追问病史有血尿家族史，基因检测出COL4A5基因突变c.3372A>G(p.P1124=)，该变异为同义突变。以上结果提示基因检测是十分必要的。

随着基因检测的普及，多基因遗传模式开始被发现，Mencarelli等^［10］最先提出了双基因遗传的可能性。研究表明，COL4A5合并COL4A3或COL4A4的双基因突变患儿临床表现的严重程度介于ARAS与ADAS之间。Choi等^［11］研究也提出，AS可能由双基因控制，但该研究并未证实临床表型加重是两种基因共同作用的结果或是两种基因中的一种突变所致。Zhang等^［12］报道称，COL4A5合并COL4A3或COL4A4基因突变的男性XLAS患儿会有更严重的蛋白尿。胡宁宁等^［13］研究发现COL4A5合并COL4A3或COL4A4双基因突变女性XLAS患者发病年龄较早，且合并有不同程度的蛋白尿。此外，Savige等^［14］研究表明具有致病性COL4A3或COL4A4基因突变可能表现出比单个突变更严重的临床表型。本研究中，4例患儿存在双基因突变，其中3例为COL4A5合并COL4A4基因，1例为COL4A5合并COL4A3基因。研究发现，4例患儿中，2例表现为肉眼血尿合并蛋白尿，1例肉眼血尿及1例镜下血尿。该4例患儿是由双基因突变所致的AS，但由于观察例数偏少，且未进行生物学功能验证，还需进一步研究。

有关男性XLAS患者基因型与表型相关性研究中，具有大片段缺失的突变比错义突变临床表现更为严重^［15-17］。本研究中，3例患儿存在大片段缺失，其中2例男性患儿均有肉眼血尿合并蛋白尿，临床表型较重。另1例（例14）为女性患儿，其父亲与叔叔均被诊断为慢性肾脏病5期，并伴听力减退，而该患儿目前仅表现出镜下血尿，可能是该患儿年龄较小，疾病进展未达到肉眼血尿水平，需要进一步随访。

Plant等^［18］曾报道1例年轻女性杂合子，4岁时即有血尿表现，肾活检支持AS诊断，其父亲DNA的单链构象多态性分析显示，拥有大致等量的正常和突变等位基因，但当时父亲表型正常，43岁时才有肾功能衰竭表现。该研究指出不排除XY/XXY的体细胞嵌合体可能，且由于嵌合体的出现，导致其表型更类似于杂合子女性患者的表型，使得父亲表型更轻微。本研究中的例3，临床表现为镜下血尿，基因突变来自母亲，但其母亲无临床表现。我们推测，（1）X染色体失活：Navarro-Cobos等^［19］研究表明，XX雌性和XY雄性之间的等效X连锁基因表达通常通过X染色体失活来实现，但X染色体的失活并不是100%，大约有15%的X连锁基因在一定程度上出现基因逃逸，且这些逃逸的失活基因仍可有不同程度的表达。我们推测，该患儿母亲体内出现致病基因的失活，当致病基因传递给该患儿后，失活的基因出现不同程度的表达，从而表现出母亲表型正常，女儿患病。（2）嵌合体：嵌合体是一种由至少两个具有不同基因型的细胞群组成的个体。当携带者中存在足够比例表达正常基因的细胞时，则临床表现正常；若表达异常基因的细胞比例多于正常细胞，则出现相应的临床表现^［20］。因此，该患儿体内由于表达异常细胞的比例高于正常细胞，从而出现临床表型。

综上所述，本研究拓宽了已知的COL4A5基因突变谱及临床表型，对AS的诊断和遗传咨询、预后有一定的指导意义。

基金资助

河南省重点研发与推广专项（科技攻关）项目（212102310441）。

利益冲突声明

所有作者声明不存在利益冲突关系。