川芎嗪通过PINK1/Parkin通路调控自噬对新生大鼠缺氧缺血性脑病的影响

Abstract

Objective

To study the effect of ligustrazine injection on mitophagy in neonatal rats with hypoxic-ischemic encephalopathy (HIE) and its molecular mechanism.

Methods

Neonatal Sprague-Dawley rats, aged 7 days, were randomly divided into a sham-operation group with 8 rats, a model group with 12 rats, and a ligustrazine group with 12 rats. The rats in the model group and the ligustrazine group were used to establish a neonatal rat model of HIE by ligation of the left common carotid artery followed by hypoxia treatment, and blood vessels were exposed without any other treatment for the rats in the sham-operation group. The rats in the ligustrazine group were intraperitoneally injected with ligustrazine (20 mg/kg) daily after hypoxia-ischemia, and those in the sham-operation group and the model group were intraperitoneally injected with an equal volume of normal saline daily. Samples were collected after 7 days of treatment. Hematoxylin and eosin staining and Nissl staining were used to observe the pathological changes of neurons in brain tissue; immunohistochemical staining was used to observe the positive expression of PINK1 and Parkin in the hippocampus and cortex; TUNEL staining was used to measure neuronal apoptosis; Western blotting was used to measure the expression levels of the mitophagy pathway proteins PINK1 and Parkin and the autophagy-related proteins Beclin-1, microtubule-associated protein 1 light chain 3 (LC3), and ubiquitin-binding protein (P62).

Results

Compared with the sham-operation group, the model group had a significant reduction in the number of neurons, an increase in intercellular space, loose arrangement, lipid vacuolization, and a reduction in Nissl bodies. The increased positive expression of PINK1 and Parkin, apoptosis rate of neurons, and protein expression levels of PINK1, Parkin, Beclin1 and LC3 (P<0.05) and the decreased protein expression level of P62 in the hippocampus were also observed in the model group (P<0.05). Compared with the model group, the ligustrazine group had a significant increase in the number of neurons with ordered arrangement and an increase in Nissl bodies, significant reductions in the positive expression of PINK1 and Parkin, the apoptosis rate of neurons, and the protein expression levels of PINK1, Parkin, Beclin1, and LC3 (P<0.05), and a significant increase in the protein expression level of P62 (P<0.05).

Conclusions

Ligustrazine can alleviate hypoxic-ischemic brain damage and inhibit neuronal apoptosis in neonatal rats to a certain extent, possibly by inhibiting PINK1/Parkin-mediated autophagy.

新生儿缺氧缺血性脑病（hypoxic-ischemic encephalopathy，HIE）是指各种围生期窒息引起的部分或完全缺氧、脑血流减少或暂停而导致胎儿或新生儿脑损伤。其病死率高，是导致新生儿急性死亡和慢性神经系统损伤的主要原因之一^［1］。每年约有100万新生儿死于出生窒息，无数新生儿因出生窒息造成严重的脑损伤且留下长期后遗症，给家庭与社会造成了严重负担^［2］。川芎嗪是活血行气药川芎的主要提取物之一，其具有抗炎、抗氧化、抗凝血、细胞保护及改善心功能等作用^［3］。段晨阳^［4］的研究显示，大脑缺氧缺血会导致线粒体损伤，而维持线粒体内环境稳态对细胞正常活动及机体健康至关重要。线粒体自噬是细胞内线粒体质量控制的重要机制，在生理水平下，线粒体自噬能够清除受损细胞器，保护神经元；一旦超出细胞可调控的生理水平，线粒体自噬就将启动细胞内的凋亡程序，引导细胞死亡^［5］。本实验通过建立HIE新生鼠模型，研究川芎嗪对缺氧缺血诱导的线粒体自噬的影响，并探讨川芎嗪治疗HIE的可能分子机制，以期为临床治疗提供依据。

1. 材料与方法

1.1. 实验动物及试剂

40只SPF级7日龄Sprague-Dawley新生大鼠，雌雄不限，体重11~14 g，新生大鼠和母鼠由三峡大学实验动物中心提供。川芎嗪注射液（批号72102041）购于湖北民族大学附属民大医院，苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色液（C211003）购于珠海贝索生物有限公司，免疫组化试剂盒（1902199710）购于福州迈新生物技术开发有限公司，一步法TUNEL原位细胞凋亡检测试剂盒（E-CK-A320）购于武汉伊莱瑞特生物公司，尼氏染色液（C0117）、PTEN诱导假定激酶1（PTEN-induced putative kinase 1，PINK1）抗体（AF7755）购于碧云天生物技术有限公司，Parkin抗体（WL02512）购于沈阳万类生物科技有限公司，自噬特异性基因（Beclin1）抗体（3495S）、泛素结合蛋白（P62）抗体（88588S）购于美国Cell Signaling Technology公司，微管相关蛋白1轻链3β（microtubule-associated protein 1 light chain 3β，LC3B）抗体（ab51520）、HRP标记山羊抗兔IgG（ab6721）、HRP标记山羊抗小鼠IgG（ab6789）购于英国Abcam公司。

1.2. 新生大鼠HIE模型制备

根据文献［6］采用的造模方法，将7日龄新生大鼠用乙醚麻醉后，从颈部正中切开皮肤，钝性剥离肌肉筋膜，分离出左侧颈总动脉并使用5号手术缝合线将左侧颈总动脉结扎，逐层缝合皮肤。手术结束后放回母鼠旁恢复1 h，然后将术后新生大鼠置于8% O₂+92% N₂密闭箱中缺氧2 h（氧流量2 L/min），缺氧结束后放回母鼠笼中常规喂养。

1.3. 实验动物分组与处理

将40只新生大鼠随机分为假手术组（n=8）、造模组（n=32）。造模组因各种原因死亡8只，将存活的24只随机分为模型组（n=12）、川芎嗪组（n=12），川芎嗪组在缺氧缺血完成后30 min给予腹腔注射川芎嗪注射液20 mg/kg，每日1次，共治疗7 d。同时，假手术组只暴露血管，不做其他处理）；模型组腹腔注射等体积的0.9%氯化钠溶液。观察各组新生大鼠的生长发育、行为活动及对刺激的反应情况。

1.4. 标本取材

药物干预7 d后，每组随机抽取4只新生大鼠进行脑组织固定。具体步骤如下：乙醚麻醉后，断头取脑，小心剥离出脑组织，沿大脑视交叉处做4~5 mm冠状切片，将其置于4%多聚甲醛中固定48 h，后进行脱水、石蜡包埋。采用HE染色、尼氏染色观察脑组织神经元形态学变化，免疫组织化学法观察PINK1、Parkin蛋白阳性细胞表达，采用TUNEL染色观察神经元凋亡情况。剩余各组新生鼠乙醚麻醉后，断头取脑，剥取左侧海马组织及皮质组织，放入事先标记好的EP管中，放入-80℃冰箱备用。

1.5. HE、尼氏染色

将石蜡块冷冻10 min后进行切片，厚度为4 μm，常规烤片后二甲苯脱蜡，梯度酒精至水、蒸馏水洗涤。后将切片放入苏木素染液中染色10 min，水洗1 min，分化15 s、水洗1 min，后置于伊红染色2 min，水洗1 min，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

同上行4 μm切片，烤片后二甲苯脱蜡、梯度酒精至水、蒸馏水洗涤。将尼氏染液水浴加热至37℃，再将切片放入尼氏染液中30 min，蒸馏水洗涤，脱水、透明、中性树胶封片。

1.6. 免疫组织化学染色

同上述方法将蜡块行4 μm切片，脱蜡至水，使用EDTA修复液高压修复，自然冷却后按照免疫组化试剂盒说明书依次滴加内源性过氧化物酶阻断液、非特异性染色阻断剂，PINK1（1∶100）、Parkin（1∶100）一抗孵育1 h，清洗后依次滴加生物素标记羊抗小鼠/兔聚合物、链霉菌抗生素蛋白-过氧化物酶，DAB显色，经复染、分化、返蓝后，中性树胶封片，扫描采集并分析图片，采用Image J计算阳性染色面积与总面积之比。

1.7. TUNEL染色

将4 μm切片常规脱蜡后按照试剂盒说明书步骤依次滴加蛋白酶K工作液、1×DNase Ⅰ Buffer、DNase Ⅰ工作液、TdT Equilibration Buffer，孵育后滴加阳性标记工作液，DAPI染色后滴加抗荧光猝灭封片剂封片，荧光显微镜下观察神经元凋亡情况，采用Image J计算细胞凋亡率。

1.8. Western blot

按照1 mg脑组织加入9 μL裂解液、0.09 μL蛋白酶抑制剂的比例进行组织匀浆、超声，匀浆液低温高速离心（4℃，12 000 r/min，15 min）后取上清液，用BCA蛋白试剂盒检测组织蛋白浓度。制备12％ SDS-PAGE凝胶，每孔上样3 μL，依次进行电泳、转膜、封闭、TBST洗膜，加入相应的PINK1（1∶1 000）、Parkin（1∶500）、LC3B（1∶1 500）、P62（1∶1 000）、Beclin1（1∶1 000）一抗，4℃孵育过夜。TBST洗膜3次，10 min/次，加山羊抗兔（1∶6 000）、山羊抗小鼠（1∶6 000）二抗。37℃孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min，滴加ECL化学发光显色液进行曝光处理，采用Image J软件计算灰度值。

1.9. 统计学分析

采用SPSS 22.0软件进行统计学分析，计量资料采用均数±标准差（ $\overline{x}\pm s$ ）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2. 结果

2.1. 各组新生大鼠一般生长情况

生后7 d假手术组新生大鼠出现细小的绒毛附着在全身皮肤上，两耳竖立；生后10~11 d鼠毛大致长齐；生后13~14 d双眼睁开，活动自如，反应敏捷。缺氧缺血造模后新生大鼠出现呼吸窘迫，四处翻滚，可见口周、眼周、四肢发绀、身体颤动、翻身困难、夹尾左旋，行为障碍在3~4 h消失，生后13~14 d右眼睁开，左眼闭合；与模型组比较，川芎嗪组部分新生大鼠在生后13~14 d双眼睁开，部分右眼睁开，活动自如。3组新生大鼠一般生长情况无明显差异。

在总体趋势上，各组新生大鼠体重都以不同的速度增长，且从造模后第2天起，模型组与川芎嗪组新生大鼠体重均低于假手术组，但3组新生大鼠体重术后不同时间点比较差异无统计学意义（P>0.05）。见图1。

图1. 各组新生大鼠在术后7 d的体重变化情况（n=8）.

2.2. 各组新生大鼠脑组织形态学的改变

HE染色及尼氏染色结果显示，假手术组新生大鼠海马与皮质中神经元细胞数量丰富，排列整齐，核居正中且圆，核仁清晰，尼氏小体数量丰富。模型组新生大鼠神经元细胞轮廓模糊，细胞间隙增大，数量减少，排列疏松紊乱，胞质空泡化，细胞核固缩，尼氏小体数量减少。川芎嗪组神经元细胞增多，排列整齐，核仁清晰，尼氏小体数量增多。见图2。

图2. 川芎嗪对HIE新生大鼠脑组织形态学的影响 假手术组脑组织中神经元细胞数量丰富，排列整齐、紧密；模型组脑组织中神经元细胞数量减少，排列疏松，细胞核固缩，胞质空泡化，尼氏小体减少；川芎嗪组神经元细胞数量增多，排列整齐，核仁清晰，尼氏小体数量增多。.

2.3. 川芎嗪对HIE新生大鼠脑组织海马区及皮质区中PINK1、Parkin表达的影响

与假手术组比较，模型组新生大鼠脑组织海马区及皮质区神经元细胞减少，胞质内均可见PINK1、Parkin阳性表达增多（P<0.05）；与模型组比较，川芎嗪组新生大鼠海马区及皮质区神经元细胞数量增加，PINK1、Parkin阳性表达减少（P<0.05）。见表1和图3。

表1.

各组新生大鼠脑组织海马区及皮质区中PINK1、Parkin阳性表达比较 （ $\overline{x}\pm s$ ，IOD/Area，n=3）

组别	PINK1		Parkin
	海马区	皮质区	海马区	皮质区
假手术组	5.82±1.79	3.72±0.55	5.49±0.39	5.51±0.94
模型组	16.89±1.37a	7.87±1.34a	15.35±4.32a	13.46±2.33a
川芎嗪组	8.54±1.68b	5.40±0.53b	7.64±0.47b	8.44±0.79b
F值	37.87	16.56	12.673	20.989
P值	<0.001	0.004	0.007	0.002

注：a示与假手术组比较，P<0.05；b示与模型组比较，P<0.05。［PINK1］PTEN诱导假定激酶1。

图3. 各组新生大鼠脑组织海马区及皮质区中PINK1、Parkin的表达变化（免疫组化染色，×40，n=3） PINK1、Parkin阳性表达呈棕黄色。模型组脑组织中海马区及皮质区PINK1、Parkin阳性表达较假手术组增多；川芎嗪组PINK1、Parkin阳性表达较模型组减少。.

2.4. 川芎嗪对HIE新生大鼠神经元凋亡的影响

与假手术组比较，模型组神经元凋亡率升高；与模型组比较，川芎嗪组神经元凋亡率降低（P<0.05）。见图4~5。

图4. 川芎嗪对HIE新生大鼠神经元凋亡的影响（TUNEL染色，×40，n=3） 绿色为凋亡细胞，蓝色为细胞核。假手术组中存在少量凋亡细胞，模型组与川芎嗪组中凋亡细胞数量明显增加，但川芎嗪组凋亡细胞数量明显少于模型组。.

图5. 各组新生大鼠神经元凋亡率比较 a示与假手术组比较，P<0.05；b示与模型组比较，P<0.05。.

2.5. 川芎嗪对HIE新生大鼠脑组织中PINK1/Parkin通路蛋白及自噬相关蛋白表达水平的影响

免疫印迹法检测结果显示，与假手术组比较，模型组PINK1、Parkin、Beclin1、LC3蛋白表达明显升高（P<0.05）；P62蛋白表达明显下降（P<0.05）。与模型组比较，川芎嗪组PINK1、Parkin、Beclin1、LC3蛋白表达下降（P<0.05）；P62蛋白表达明显升高（P<0.05）。见表2和图6。

表2.

各组新生大鼠海马组织中PINK1/Parkin通路蛋白及自噬相关蛋白相对表达水平比较 （ $\overline{x}\pm s$ ，n=5）

组别	PINK1	Parkin	P62	Beclin1	LC3
假手术组	0.50±0.14	0.76±0.10	0.97±0.17	0.48±0.28	0.60±0.14
模型组	1.09±0.20a	1.16±0.14a	0.58±0.15a	1.06±0.25a	1.00±0.10a
川芎嗪组	0.75±0.13b	0.92±0.03b	0.84±0.19b	0.71±0.27b	0.76±0.17b
F值	10.60	16.48	9.35	9.65	10.47
P值	0.011	<0.001	0.002	<0.001	0.002

注：a示与假手术组比较，P<0.05；b示与模型组比较，P<0.05。［PINK1］PTEN诱导假定激酶1；［P62］泛素结合蛋白；［Beclin1］自噬特异性基因；［LC3］微管相关蛋白1轻链3。

图6. 各组新生大鼠海马组织中PINK1/Parkin通路蛋白及自噬相关蛋白表达条带图 A：假手术组；B：模型组；C：川芎嗪组。.

3. 讨论

HIE是缺氧缺血性脑损伤导致的急性脑功能紊乱，每1 000名活产婴儿中，约有1.5例发生HIE^［7］。目前主要治疗方式是亚低温治疗。人体体温每降低1℃，大脑代谢将会降低约5%。在中度至重度HIE的足月儿中，在缺氧缺血事件后6 h内开始治疗，全身降温（33.5±0.5）℃，持续48~72 h，可显著提高存活率并减少残疾，但在超过了6 h后进行亚低温治疗则效果较差^［8-10］。目前在资源有限的环境中，并且进一步受到起始治疗窗狭窄的限制，亚低温治疗仍是一种昂贵且难以实现的治疗方式。因此，鉴于亚低温治疗的局限性，寻找一种适用性更强的疗法是全球共同面对的问题。

在新生儿发生缺氧缺血事件时，大脑神经元即可出现原发性细胞损伤。导致新生儿神经细胞损伤的具体机制并不十分明确，但线粒体功能障碍是导致细胞功能障碍的关键因素，神经元高度活跃的代谢决定了它对线粒体的稳定的绝对依赖^［11］。在缺血损伤后，特别是在二次衰竭受损的神经元中，重建线粒体动力学，通过线粒体自噬去除受损线粒体，从而补充新的线粒体，是功能恢复、临床症状缓解的关键一步^［12］。一旦缺氧缺血事件发生后，线粒体功能受损，为了维护细胞内环境稳态，线粒体发出一种“吃我”的信号来降解受损细胞器，这一过程称线粒体自噬。线粒体自噬是维持细胞内环境稳态的重要机制^［13］。在神经细胞中，损伤的线粒体若没有及时被清除，将会诱导细胞色素C的释放，进而引发细胞凋亡；但自噬被过度激活就会导致重要细胞器甚至细胞核被吞噬降解，引起细胞自噬性死亡。故自噬程度对细胞是否存活起着至关重要的作用。在严重缺氧缺血环境下，过度激活的线粒体自噬导致了神经元的死亡。本实验发现，各组新生大鼠一般生长情况无明显差异，但模型组新生大鼠线粒体自噬被激活，神经元凋亡增加。黄阳等^［14］的研究显示，过度激活的线粒体自噬可损伤缺氧缺血小鼠脑组织，通过敲除PINK1基因抑制线粒体自噬后，可对10日龄缺氧缺血性脑损伤小鼠产生保护作用。

PINK1是一种丝氨酸激酶，Parkin是一种E3泛素连接酶，PINK1在Parkin上游发挥作用。PINK1可以靶向受损线粒体，从而启动线粒体自噬功能^［15］。在正常情况下，PINK1从线粒体外膜移位至线粒体内膜上，并且快速被线粒体内膜蛋白酶PARL切割、降解。当线粒体受到损伤时，PINK1由外膜移至内膜的通道受阻，然后在线粒体外膜上形成二聚体从而避免被切割，进而完成超激活^［16］。超激活后的PINK1在线粒体外膜上募集并激活大量的E3泛素连接酶Parkin，将待降解的货物打上泛素化标签。本研究结果显示，模型组新生大鼠脑组织海马及皮质区中PINK1、Parkin的阳性表达增加，神经元数量减少，并出现核固缩、尼氏小体减少、细胞凋亡增加等病理改变，提示在脑组织发生缺氧缺血后，激活了PINK1/Parkin通路导致脑组织出现病理损伤，而川芎嗪组抑制了该通路的激活，减轻脑组织病理损伤。提示川芎嗪可通过抑制PINK1/Parkin通路的激活减轻脑组织损伤。

LC3对隔离膜的生长和自噬货物的识别至关重要，为了发挥其作用，新合成的LC3经过半胱氨酸蛋白酶ATG4在羧基末端甘氨酸120位点裂解形成LC3-Ⅰ，通过泛素样系统使LC3-Ⅰ与磷脂酰乙醇胺（PE）偶联形成LC3-Ⅱ，后者锚定在自噬小体膜上^［17］。Beclin1也是自噬的核心蛋白之一，Beclin1的表达可影响缺血诱导的自噬激活，它调控自噬体的合成和自噬体的成熟。众所周知，P62是自噬的效应因子，也是自噬底物，P62蛋白通过其LC3相互作用区域（LIR结构域）与LC3相互作用附着在自噬体上，从而通过其泛素结构域（UBA结构域）将附着在其上的泛素化物质运输到溶酶体并降解^［18］。以上三者都是自噬顺利完成不可或缺的组成部分。本实验结果显示模型组中Beclin1、LC3表达增加，P62表达下降，表明自噬处于增强状态，造成了神经元的凋亡增加；给予川芎嗪干预后，Beclin1、LC3表达下降，P62表达增加，过度激活的自噬被抑制，神经元凋亡减少，脑组织病理损伤减轻。从而推断川芎嗪对脑神经具有保护作用，且川芎嗪可通过抑制自噬发挥神经保护作用。上述推断与Guan等^［19］的研究结果一致。

综上所述，川芎嗪可改善HIE新生大鼠脑组织病理损伤，抑制神经元凋亡，其机制可能与川芎嗪抑制PINK1/Parkin通路从而抑制线粒体自噬相关。

基金资助

国家自然科学基金项目（82260821）。