血清成纤维细胞生长因子23对儿童低血磷性佝偻病的诊断价值研究

Abstract

目的

探讨血清成纤维细胞生长因子23（fibroblast growth factor 23，FGF23）在儿童低血磷性佝偻病中的诊断价值。

方法

选择2016年1月—2021年6月在南京医科大学附属儿童医院确诊为低血磷性佝偻病的28例儿童为佝偻病组，纳入2021年6—7月于该院儿童保健科就诊，性别、年龄与佝偻病组匹配的40例健康儿童为健康对照组。比较两组血清FGF23浓度差异，分析血清FGF23与低血磷性佝偻病临床特征、实验室检查结果的相关性，以及血清FGF23对低血磷性佝偻病的诊断价值。

结果

佝偻病组血清FGF23浓度高于健康对照组（P<0.05）。佝偻病组患儿血清FGF23与碱性磷酸酶呈正相关（r_s =0.38，P<0.05），与肾小管最大磷吸收/肾小球滤过率呈负相关（r_s =-0.64，P<0.05），与年龄、身高Z评分、性别、甲状旁腺素无相关性（P>0.05）。血清FGF23诊断儿童低血磷性佝偻病的灵敏度、特异度、最佳截断值、曲线下面积分别为0.821、0.925、55.77 pg/mL、0.874（P<0.05）。

结论

血清FGF23对儿童低血磷性佝偻病有良好的应用价值，可为临床早期诊断提供理论依据及指导意义。

遗传性低血磷性佝偻病/骨软化症是一组罕见的由钙磷代谢紊乱引起的骨矿化异常性疾病，儿童主要表现为下肢畸形、身材矮小、牙釉质发育不全等^［1］。根据其病因不同，可分为多种类型，最常见的是由X连锁磷酸调节中性肽酶同源物基因（phosphate-regulating gene with homologies to endopeptidases on the X chromosome，PHEX基因）突变引起的X连锁显性低血磷性佝偻病（X-linked dominant hypophosphatemic rickets，XLH或XLHR），发病率为1∶20 000~1∶25 000，占遗传性低血磷性佝偻病的80％以上。PHEX基因定位于染色体Xp22.1，其编码的蛋白质可下调成纤维细胞生长因子23（fibroblast growth factor 23，FGF23）表达。FGF23可降低肾近曲小管刷状缘膜上的钠-磷协同转运蛋白Ⅱa、Ⅱc数量，从而增加肾脏的磷排泄^［2］，也可通过抑制CYP27B1基因编码的1α-羟化酶表达，刺激CYP24A1基因表达编码24-羟化酶，减少1,25-二羟维生素D₃，间接抑制肠道吸收磷，是XLH的作用靶点。FGF23活性形式为完整成纤维细胞生长因子23（intact fibroblast growth factor 23，iFGF23），当其N端信号肽被去除，Arg179和Ser180之间的蛋白水解裂解将产生2个非活性片段（N-FGF23、C-FGF23）^［3］，其中iFGF23的生物学功能最为活跃，能有效反映FGF23与磷酸盐负荷的关系。目前国内外尚未统一FGF23正常浓度范围，而测量试剂盒种类多样，其中日本Kainos公司试剂盒一致性及稳定性较好^［4］。

低血磷性佝偻病需结合临床表现、实验室检查、影像学及基因检测明确诊断，但基因检测周期长、成本高，不利于低血磷性佝偻病的早期发现。我国低血磷性佝偻病患儿生存状况调查分析显示，患儿首次就医未确诊比例高达72.57%，60%以上经历过误诊，根据我中心研究数据，低血磷性佝偻病患儿平均确诊时长为42个月，平均需去3家医院才能确诊^［5］。早期诊断和治疗可改善骨骼矿化代谢，避免严重下肢畸形与生长迟缓^［6］。灵敏度高、特异度强的生物标志物是低血磷性佝偻病早诊断、早治疗的关键。另一方面，布罗索尤单抗（burosumab）是FGF23的单克隆抗体，可改善肾小管磷酸盐重吸收、血清磷水平和线性生长^［7-8］，已被列为低血磷性佝偻病的一线治疗用药，但尚缺乏特异性的监测指标。目前，FGF23浓度研究主要集中于欧美及日本成人慢性肾脏病、肿瘤性骨软化症患者^［9-10］，故本课题组拟通过横断面研究探讨正常及患病儿童FGF23浓度，分析其诊断价值，并探究其相关因素，为低血磷性佝偻病患儿的诊断提供依据。

1. 资料与方法

1.1. 研究对象

以我院2016年1月—2021年6月期间收治的28例低血磷性佝偻病患儿为佝偻病组，男性20例（71%），女性8例（29%）；0~<5岁7例（25%），5~<10岁11例（39%），10~<18岁10例（36%）；XLH患儿24例（86%），临床诊断为低血磷性佝偻病但基因检测阴性者4例（14%）。身高（长）测量用于评估患儿生长情况，并使用国际儿童和青少年在线辅助计算器将身高转化为Z评分^［11］。

纳入标准：（1）0~<18岁经基因检测或临床符合低血磷性佝偻病诊断标准^［12］的患儿；（2）入组前停服磷酸盐制剂及维生素D至少2周；（3）无其他伴随疾病，入组家属对本次研究知情同意。排除标准：（1）入组前使用肾毒性药物；（2）患有肝性、肾性、内分泌功能障碍疾病。

以随机抽样方法随机抽取2021年6—7月就诊于南京医科大学附属儿童医院儿童保健科的40例健康体检儿童为健康对照组，男性32例（80%），女性8例（20%）。纳入标准：（1）0~<18岁健康儿童；（2）近2个月无服用磷酸盐、维生素D制剂；（3）检验其肝肾功能、电解质、尿钙、尿磷均正常；（4）家族中无相关遗传性、慢性及其他异常疾病史。

本研究经南京医科大学附属儿童医院伦理委员会批准（202103041-1）。

1.2. 基因检测

22例（79%）患儿基因检测采用二代测序，由北京迈基诺基因科技股份有限公司完成；6例（21%）患儿采用PHEX基因靶向检测。4例基因检测阴性者有3例采用PHEX基因靶向检测，1例为二代测序。

1.3. 实验室检查

隔夜空腹至少8 h以上取血，由我院检验科测定生化指标、甲状旁腺素（parathyroid hormone，PTH）、25-羟维生素D［25-hydroxyvitamin D，25(OH)D］、尿磷、尿肌酐。生化指标分析包括：血磷、血钙、血钾、血钠、血氯、血镁、血肌酐、总蛋白、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP），根据Walton等^［13］的列线图计算肾小球滤过率校正的肾脏磷最大重吸收率即肾小管最大磷吸收/肾小球滤过率（renal tubules absorbed maximum phosphorus/glomerular filtration rate，TmP/GFR）。

检测FGF23浓度：全血样本采集当日离心分离血清，所有血清样本均存储于-80℃低温冻存，避免反复冻融。采用双抗夹心酶联免疫吸附法进行iFGF23测定，试剂盒购于Kainos公司，该试剂盒iFGF23测定范围为3~800 ng/L。测定步骤：准备试剂及标准品，所有待测患儿血清提前一晚置于4℃冰箱解冻；取50 μL缓冲液加入每个微孔中；取50 μL FGF23标准品稀释液或待测血清分别加入相应微孔，覆铝膜以避光，置于摇床上室温孵育2 h；移去覆膜，洗板4次，每次每孔加入300 μL洗液，最后完全移除洗液；每微孔中加入100 μL HRP标记的FGF23抗体，覆膜，室温摇床孵育1 h；移去覆膜，洗板4次，最后完全移除洗液；取100 μL底物加入每孔，覆膜，置于铝箔避光室温孵育30 min；移除铝箔和覆膜，每孔立即加入100 μL反应终止液，覆膜轻摇1 min；用酶标仪在10 min内读取450 nm（第二波长取600 nm）的吸光度，计算各孔iFGF23浓度。结果由标准品的浓度和光密度值绘出的标准曲线图及直线回归方程得出。

1.4. 资料收集

收集两组儿童的资料，包括：（1）年龄、性别、身高（长）；（2）血清FGF23、电解质（钾、钠、氯、钙、磷、镁）、ALP、25(OH)D、血肌酐、血总蛋白、尿肌酐、尿磷等结果，其中血肌酐、尿肌酐、尿磷用于计算TmP/GFR。儿童不同年龄段血磷及ALP正常范围参照2021年我国国家卫生健康委员会颁布的儿童临床常用生化检验项目参考区间^［14］。

1.5. 统计学分析

采用SPSS 26.0对数据进行统计学分析。作图采用GraphPad Prism 9.0.1软件。正态分布的计量资料用均值±标准差（ $\overline{x}\pm s$ ）表示，组间比较采用两样本t检验；非正态分布的计量资料用中位数（四分位数间距）［M（P ₂₅，P ₇₅）］表示，组间比较采用Mann-Whitney U检验。计数资料以例数和百分率（%）表示，组间比较采用卡方检验。偏态分布或等级变量的相关性分析采用Spearman秩相关。采用受试者操作特征曲线分析FGF23对儿童低血磷性佝偻病的诊断价值。P<0.05表示差异有统计学意义。

2. 结果

2.1. 两组儿童临床资料比较

佝偻病组共28例，18例（64%）系家族遗传性病例，其中16例来自母亲，2例来自父亲；10例（36%）系散发病例。24例PHEX基因突变患儿中，共检出18个不同的基因突变分布（图1），其中截短突变14例（58%），非截短突变10例（42%）。佝偻病组与健康对照组的性别、年龄、血钾、血钠、血氯比较差异无统计学意义（P>0.05）。佝偻病组血清FGF23、ALP水平高于健康对照组（P<0.01），血磷、血钙、血镁、血总蛋白低于健康对照组（P<0.05）。见表1。

图1. PHEX基因外显子结构 图中方框为外显子结构，箭头所指为本研究中确定的18个突变位点碱基位置。.

表1.

两组儿童临床资料比较

项目	健康对照组 (n=40)	佝偻病组 (n=28)	${\chi }^2$ /t/Z值	P值
男性 [例(%)]	32(80)	20(71)	0.67	0.56
年龄 ( $\overline{x}\pm s$ , 岁)	8±3	9±5	0.29	0.78
ALP ( $\overline{x}\pm s$ , U/L)	271±69	511±148	9.26	<0.01
血磷 [M(P 25, P 75), mmol/L]	1.64(1.60, 1.75)	0.82(0.71, 0.95)	6.48	<0.01
血钙 [M(P 25, P 75), mmol/L]	2.60(2.55, 2.66)	2.33(2.25, 2.38)	6.64	<0.01
血钾 ( $\overline{x}\pm s$ , mmol/L)	4.2±0.3	4.3±0.4	1.42	0.14
血钠 ( $\overline{x}\pm s$ , mmol/L)	140.0±1.4	139.6±1.7	1.18	0.24
血氯 ( $\overline{x}\pm s$ , mmol/L)	103.59±1.8	104.50±2.2	1.88	0.07
血镁 ( $\overline{x}\pm s$ , mmol/L)	0.99±0.65	0.80±0.05	12.83	<0.01
血总蛋白 ( $\overline{x}\pm s$ , mmol/L)	71±5	69±4	2.20	0.03
血清FGF23 [M(P 25, P 75), pg/mL]	33.52(24.78, 42.63)	75.14(57.07, 100.67)	5.30	<0.01

注：［FGF23］成纤维细胞生长因子23；［ALP］碱性磷酸酶。

2.2. 佝偻病组患儿血清 FGF23与临床指标的关系

Spearman秩相关分析显示，低血磷性佝偻病患儿血清FGF23浓度与TmP/GFR呈显著负相关（r_s =-0.64，P<0.01），与ALP、25(OH)D呈正相关（分别r_s =0.38、0.39，均P=0.04），见图2。年龄（r_s =-0.04，P=0.84）、身高Z评分（r_s =-0.25，P=0.20）、性别（r_s =-0.12，P=0.23）、PTH（r_s =-0.04，P=0.87）与血清FGF23浓度无显著相关性。

图2. 低血磷性佝偻病患儿血清FGF23与ALP、25(OH)D、TmP/GFR的相关性分析图.

2.3. 绘制血清FGF23对诊断低血磷性佝偻病的受试者操作特征曲线

受试者操作特征曲线分析结果显示，FGF23诊断低血磷性佝偻病的曲线下面积为0.874（95%CI：0.782~0.965），约登指数为0.746，灵敏度为0.821，特异度为0.925，阳性预测值为0.885，阴性预测值为0.881，最佳截断值为55.77 pg/mL（P<0.01），见图3。

图3. FGF23诊断低血磷性佝偻病的受试者操作特征曲线.

3. 讨论

本研究利用日本Kainos公司试剂盒对两组儿童进行iFGF23水平检测，结果显示，佝偻病组血清FGF23浓度高于健康对照组，与Endo等^［15］研究结果一致。一项纳入227例儿童的横断面研究中，血清FGF23浓度为（44±37）pg/mL，但该研究中半数儿童为肾功能异常者，不能代表正常儿童的水平^［16］。Jonsson等^［17］报道26例儿童［（10.9±5.5）岁］FGF23浓度为（69±36）mL/RU。本研究中健康对照组儿童血清FGF23浓度为33.52（24.78，42.63）pg/mL，与Smith等^［10］测量健康人群FGF23浓度为11.7~48.6 pg/mL大致相似（年龄25~62岁，晨起空腹8:00—10:00）。本研究相关性分析结果显示XLH患儿FGF23浓度并无性别差异，与Ichikawa等^［18］的关于小鼠体外FGF23与性别剂量效应的研究结果一致，具体机制尚不清楚，可能与X染色体随机失活、等位基因表达差异有关。

本研究发现健康对照组和佝偻病组FGF23、血镁、总蛋白、血磷、血钙水平差异有统计学意义。低血磷性佝偻病患儿由于内环境稳态被打破，除钙磷代谢异常外可能伴有其他电解质紊乱。Hamano^［19］在低镁与骨密度的相关性研究中发现，低镁可能是导致营养不良患儿骨密度改变的重要因素，所以对于蛋白质营养不良的低血磷性佝偻病患儿，尤其是合并低镁血症者，早期加镁治疗可能对改善骨骼矿化具有重要意义。

诊断方面，本研究显示FGF23诊断低血磷性佝偻病的曲线下面积为0.874，最佳截断值为55.77 pg/mL，与FGF23预测肿瘤性骨软化症的灵敏度（86%）^［20］相似，提示FGF23作为诊断低血磷性佝偻病生物标志物的效能较高。Ito等^［21］分析FGF23诊断FGF23相关/不相关低血磷性佝偻病的灵敏度和特异度分别为100%和81.8%，这有力地支持了FGF23具有作为新的临床诊断标志物的潜能。但目前不同FGF23试剂盒的诊断截断值尚不完全确定，未来有必要继续积累更多的FGF23临床检测数据，以确定中国儿童的正常参考范围。

本研究发现血清FGF23浓度与ALP呈正相关，低血磷性佝偻病患儿由于生长板软骨细胞终末分化和矿化所需磷酸盐供应不足，成骨细胞活跃，故ALP增高明显。TmP/GFR是稳定状态下测量肾脏重吸收磷的最佳方法，可有效代表肾磷阈，低血磷性佝偻病患儿TmP/GFR显著降低。本研究中血清FGF23浓度与TmP/GFR呈负相关，与Yamamoto等^［22］的研究结果一致。由于布罗索尤单抗通过直接结合FGF23抑制其生物活性，提高肾脏重吸收磷，改善TmP/GFR以维持血磷在正常范围内，故FGF23或许可成为监测布罗索尤单抗疗效的有效指标。既往认为，FGF23浓度过高可引起1,25-二羟维生素D₃生成不足^［23］，从而减少钙磷吸收，但本研究显示二者呈正相关，原因可能与本研究中患儿非初诊，曾长期服用大剂量骨化三醇有关，而活性维生素D的半衰期长达2~3周，停药2周后患儿体内可能仍残留部分外源性活性维生素D。本研究表明FGF23浓度与年龄、身高Z评分无显著相关性。一项包含29例（成人14例，儿童15例）的回顾性研究中，FGF23浓度与身高标准差分数、发病年龄均无相关性^［24］，可能与患儿身高受遗传、治疗时间、营养状况等多因素影响相关。

总之，FGF23是肠、肾、骨之间联系、调节的纽带，其血清浓度不仅与多种辅助诊断的生化标志物相关，是低血磷性佝偻病的潜在诊断靶标，同时也有可能成为评估布罗索尤单抗疗效的指标。

本研究尚存在以下局限性：（1）XLH为罕见病，本研究样本量小且为单中心研究，仍需进一步的前瞻性研究证实血清FGF23浓度对疾病发生发展的独立预测价值；（2）未能评估FGF23浓度对低血磷性佝偻病不同年龄段、不同类型低血磷性佝偻病的诊断价值，以及不同检测方法的差异；（3）影响FGF23因素较多，未来可行多重线性回归分析，减小其他混杂因素带来的偏倚。鉴于这些局限性，我们的结果需要在更大的样本和更广泛的年龄范围中进行前瞻性、多中心研究。

基金资助

国家自然科学基金面上项目（81770662）。

利益冲突声明

所有作者声明不存在利益冲突。