ZEB2调控胰腺癌PANC-1细胞迁移和侵袭的实验研究

Abstract

Objective

To investigate the effects and mechanisms of zinc finger E-box binding homeobox transcription factor-2 (ZEB2) on the proliferation, colony formation, migration, and invasion abilities and the epithelial-mesenchymal transition (EMT) of PANC-1 cells, a human pancreatic cancer cell line.

Methods

Data on the expression of ZEB2 in pancreatic cancer tissues and paracancerous tissues from The Cancer Genome Atlas (TCGA) database were analyzed. PANC-1 pancreatic cancer cells were divided into si-NC group, si-ZEB2 group, pcDNA3.1 group, and pcDNA3.1-ZEB2 group. qRT-PCR and Western blot were conducted to confirm the effectiveness of ZEB2 knockdown or overexpression. CCK-8, colony formation, wound healing, and Transwell assays were conducted to examine the effects of ZEB2 on the proliferation, colony formation, migration, and invasion of PANC-1 cells. qRT-PCR and immunofluorescence assays were performed to examine the expression of E-cadherin and vimentin, the EMT markers, in the cells. Prediction of proteins interacting with ZEB2 was made through the STRING database.

Results

TCGA database analysis showed that the expression level of ZEB2 in pancreatic cancer tissues was significantly higher than that in adjacent tissues (P<0.05). Compared with those of cells in the control group, the proliferation, colony formation, migration, and invasion of cells in the si-ZEB2 group were decreased (P<0.05). Compared with those of cells in the pcDNA3.1 group, the proliferation, colony formation, migration and invasion of cells in the pcDNA3.1-ZEB2 group were increased (all P<0.05). According to the results of qRT-PCR and immunofluorescence assays, compared with those of the si-NC group, the expression of E-cadherin mRNA, an epithelial marker, in the si-ZEB2 group increased, while the expression of vimentin mRNA, an mesenchymal marker, and the protein decreased. Compared with those of the pcDNA3.1 group, the expression of E-cadherin mRNA in the PANC-1 cells of the pcDNA3.1-ZEB2 group decreased, while the expression of vimentin mRNA and the protein increased (all P<0.05). Analysis with the STRING database predicted that 10 proteins had close interaction with ZEB2.

Conclusion

Overexpression of ZEB2 promotes the migration, invasion, and the EMT process of PANC-1 pancreatic cancer cells.

胰腺癌（pancreatic cancer, PC）是一种高度恶性的消化系统实体肿瘤，其早期的临床症状不明显，大部分患者在确诊时已达癌症晚期，错过手术治疗的最佳时间，只有少数人可以进行根治性切除术，且患者术后的预后情况及5年生存率仍不乐观，是困扰全世界的健康难题之一。因此，迫切需要了解胰腺癌发生发展的潜在分子机制，寻找肿瘤治疗新靶点，为临床诊疗手段的革新和发展提供更多的实验依据。

锌指E-box结合同源异型盒2基因（zinc finger E-box binding homeobox transcription factor-2, ZEB2）位于染色体2q22.3，长度为70 kb，由10个外显子组成，结构上包括一个中央同源框和两个锌指域^[1]。有文献研究报道，ZEB2通过抑制E-cadherin的表达来诱导细胞发生上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）^[2]，促进细胞迁移和侵袭，在多种类型的癌症中起促癌作用。此外，ZEB2与各种癌症亚型的不良预后和较差的总生存期有关^[3]。因此，ZEB2可在发育和疾病过程中发挥重要作用，是上皮向间质转化的有效诱导剂^[4]，是EMT在癌症和发育过程中的关键参与者之一。

本研究通过体外细胞实验，探讨ZEB2对胰腺癌PANC-1细胞迁移和侵袭能力的调控作用，以期为胰腺癌新的治疗靶点的选取提供理论依据。

1. 材料与方法

1.1. 实验材料

人胰腺癌细胞系PANC-1购自武汉普诺赛公司。DMEM高糖细胞培养基、青霉素-链霉素混合液、胰酶（含0.02%EDTA）均购自北京中生奥邦生物科技有限公司，胎牛血清购自美国BI有限公司，Lipofectamine 2000购自美国Thermo公司，Trizol总RNA提取试剂购于美国Thermo公司，实验过程中所用质粒pcDNA3.1、pcDNA3.1-ZEB2（ZEB2过表达质粒），3条si-ZEB2（ZEB2敲降si-RNA，标号分别为si-ZEB2#1、si-ZEB2#2、si-ZEB2#3）及其对照si-RNA（si-NC）均购自通用生物（安徽）股份有限公司，CCK-8试剂盒购自武汉优试生物技术有限公司，反转录试剂盒及qRT-PCR试剂盒购自北京聚合美生物科技有限公司，兔源抗ZEB2单克隆抗体、兔源抗Vimentin单克隆抗体均购自Affinity生物研究中心，10×电泳缓冲液、10×蛋白电转缓冲液、10×封闭-洗涤缓冲液（TBST）、ECL发光液、羊抗兔二抗均购自北京普利莱基因技术有限公司。

1.2. 数据库在线分析

分析癌症基因组图谱数据库（The Cancer Genome Atlas, TCGA）中胰腺癌组织和癌旁组织（包括179例胰腺癌组织和171例癌旁组织）的基因表达（http://tcga-data.nci.nih.gov/taga/），利用GEPIA在线工具获得ZEB2在胰腺癌组织中表达的柱状图 （http://gepia.cancer-pku.cn/）。为了确定ZEB2调节PANC-1细胞生物学功能的具体分子机制，利用STRING在线数据库分析与ZEB2有相互作用的蛋白（https://cn.string-db.org/），蛋白名称输入“ZEB2”、物种选择“Homo sapiens”，获得ZEB2的蛋白-蛋白互作网络图（PPI）。

1.3. 细胞培养及分组

PANC-1细胞采用含10%胎牛血清的DMEM高糖完全培养基，配制完全培养基时加入1%双抗。细胞放置在含体积分数5%CO₂的37 ℃恒温孵育箱中进行细胞培养，按1∶2或1∶3比例传代，每隔2天传代1次。实验分为si-NC组、si-ZEB2组、pcDNA3.1组、pcDNA3.1-ZEB2组，各组分别转染si-NC、si-ZEB2、pcDNA3.1和pcDNA3.1-ZEB2，转染步骤参照Lipofectamine 2000说明书，转染终浓度均为20 nmol/L，转染4～6 h后换无双抗含血清的培养液。

1.4. qRT-PCR检测ZEB2对PANC-1细胞中E-cadherin、vimentin、ZEB2 mRNA表达的影响

采用Trizol法提取细胞总RNA，通过Nanodrop仪器测定所提RNA质量及浓度，使用逆转录试剂盒将mRNA逆转录为cDNA。根据说明书使用qRT-PCR系统进行检测，引物由上海生工公司合成，序列见表1，反应程序如下：两步法PCR扩增标准程序：95 ℃ 30 s，1个循环；95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40个循环。以GAPDH作为内参，使用2^−ΔΔct计算基因相对表达量，实验重复3次。

表 1. Primer sequences.

引物序列

Gene name	Primer sequences
E-cadherin (F)	5′-AGTCACTGACACCAACGATAAT-3′
E-cadherin (R)	5′-ATCGTTGTTCACTGGATTTGTG-3′
Vimentin (F)	5′-TCGTGAATACCAAGACCTGCTCAATG-3′
Vimentin (R)	5′-AATCCTGCTCTCCTCGCCTTCC-3′
ZEB2 (F)	5′-GAAGACAGAGAGTGGCATGTAT-3′
ZEB2 (R)	5′-GTGTGTTCGTATTTATGTCGCA-3′
GAPDH (F)	5′-CAGGAGGCATTGCTGATGAT-3′
GAPDH (R)	5′-GAAGGCCTGGGGCTCATTT-3′

1.5. Western blot检测ZEB2对PANC-1细胞中ZEB2蛋白表达的影响

细胞转染48 h后，提取总蛋白，使用BCA检测试剂盒测定细胞蛋白浓度。将蛋白变性后按照每孔15 μg上样，进行SDS-PAGE电泳、转膜，脱脂奶粉室温封闭2 h，然后在对应抗体中4 ℃孵育过夜。第2 d二抗孵育2 h后，ECL显色，拍照后通过ImageJ软件分析条带灰度值，实验重复3次。

1.6. CCK-8实验检测ZEB2对PANC-1细胞增殖的影响

各组细胞转染后24 h，用胰酶将其消化，以5×10³个/孔接种于96孔板，每组设置3个复孔，于接种后24 h、48 h、72 h、96 h每孔加入10 μL CCK-8试剂和100 μL培养液。孵育2 h后，用酶标仪测定450 nm波长下吸光度值，实验重复3次。

1.7. 克隆形成实验检测ZEB2对PANC-1细胞克隆形成的影响

取各组转染后24 h的细胞以2×10³个/孔接种于6孔板，每组设3个复孔。培养过程中每3 d补加一次培养液，在倒置显微镜下观察细胞集落形成情况。选取细胞数≥50个的集落作为计数的对象，结晶紫对细胞进行染色，在光线适宜处拍照。

1.8. 划痕实验检测ZEB2对PANC-1细胞迁移距离的影响

将各组细胞按照2×10⁵个/孔接种于6孔板中，当细胞密度达到50%时进行转染。换液后，用200 μL枪头在孔内均匀划直线，PBS清洗细胞碎片，加入无血清培养基，显微镜下拍照，随后置于培养箱中继续培养。转染后24 h、48 h时在显微镜下观察细胞迁移状态并拍照。计算各组细胞迁移率，迁移距离用ImageJ软件测量，迁移率=（0 h划痕宽度−24/48 h划痕宽度）/0 h划痕宽度×100%，实验重复3次。

1.9. Transwell小室检测ZEB2对PANC-1细胞迁移和侵袭的影响

提前制备质量浓度约为200 μg/mL的Matrigel基质胶工作液，按100 μL/孔加至侵袭实验所用小室上室（迁移实验不加），置于37 °C孵箱孵育30 min，等待基质胶凝固。将转染后的细胞以5×10⁴/孔接种于Transwell上层小室，上室使用无血清培养基，下层小室加入650 μL含20%FBS的DMEM培养基，置于培养箱中培养24 h。次日，取出上层小室，吸净其中培养液，生理盐水洗3遍，棉签轻拭，用结晶紫染色5～10 min，生理盐水洗净。显微镜下随机选取视野进行拍照，利用Image J软件计算各组细胞迁移数，计算穿膜细胞数量的平均值，实验重复3次。

1.10. 免疫荧光技术检测ZEB2对PANC-1细胞中蛋白表达的影响

收集各组转染24 h的细胞，适量接种至共聚焦小皿中继续培养，细胞生长至50%后弃去培养液，用PBS在摇床上清洗2次，每次5 min。4%多聚甲醛固定30 min，清洗后0.2%Triton-X-100对细胞打孔，每孔加入5%BSA进行免疫封闭1 h，在对应一抗中室温结合30 min，置于4 ℃孵育过夜。次日在室温条件下摇床避光孵育二抗45 min，清洗后每孔避光加入DAPI室温孵育，用荧光显微镜观察拍照，并利用Image J软件对平均荧光强度进行定量分析，实验重复3次。

1.11. 统计学方法

采用Prism 7.0统计学软件对各项实验数据进行分析处理。结果采用表示，两个独立样本间的比较采用独立样本t检验，两个以上分组组别之间通过单因素方差分析进行比较，P< 0.05为差异有统计学意义。

2. 结果

2.1. ZEB2在正常胰腺组织和胰腺癌组织中的表达差异

见图1。根据TCGA数据库对179例胰腺癌组织和171例癌旁组织中ZEB2 mRNA的表达差异进行分析，结果表明，与癌旁组织相比，ZEB2在胰腺癌组织中表达量明显升高（P<0.001）。

图 1.

The expression of ZEB2 mRNA in pancreatic cancer tissues and paracancerous tissues

ZEB2 mRNA在胰腺癌组织和癌旁组织中的表达水平

TPM: transcripts per million; ^*** P<0.001, vs. normal group.

2.2. ZEB2敲降和过表达效率的检测

为证明转染有效性，在PANC-1细胞中转染si-NC、3条敲降si-ZEB2（si-ZEB2#1、si-ZEB2#2、si-ZEB2#3）、pcDNA3.1空载对照或pcDNA3.1-ZEB2过表达质粒，采用qRT-PCR技术和Western blot技术在mRNA和蛋白水平检测各组细胞中ZEB2的表达水平。如图2所示，与si-NC组相比，3组si-ZEB2组ZEB2 mRNA和蛋白表达水平均降低（P<0.01），选取敲降效果最好的si-ZEB2#2进行后续实验研究。如图3所示，与pcDNA3.1组相比，pcDNA3.1-ZEB2组ZEB2 mRNA和蛋白表达水平均提高（P<0.001）。

图 2.

ZEB2 mRNA (A) and proteins (B) in PANC-1 cells of the knockdown group

敲降组PANC-1细胞中ZEB2 mRNA（A）和蛋白（B）的检测结果

^** P<0.01, ^**** P<0.0001, vs. si-NC group, n=3.

图 3.

ZEB2 mRNA (A) and proteins (B) in PANC-1 cells of the overexpression group

过表达组PANC-1细胞中ZEB2 mRNA（A）和蛋白（B）的检测结果

^*** P<0.001, vs. pcDNA3.1 group, n=3.

2.3. 敲降或过表达ZEB2对PANC-1细胞增殖、集落形成能力的影响

结果如图4所示，与si-NC组相比，si-ZEB2组PANC-1细胞增殖、集落形成能力减弱（P均<0.05）；而与pcDNA3.1组相比，pcDNA3.1-ZEB2组细胞增殖、集落形成能力增强，差异均有统计学意义（P均<0.05）。

图 4.

Effect of ZEB2 on proliferation (A, B) and colony forming (C, D) ability of PANC-1 cells

ZEB2对PANC-1细胞增殖（A、B）和集落形成（C、D）能力的影响

^* P<0.05, ^** P<0.01, ^*** P<0.001, vs. si-NC or pcDNA3.1 groups, n=3.

2.4. 敲降或过表达ZEB2对PANC-1细胞迁移和侵袭能力的影响

如图5、图6所示。与si-NC组相比，si-ZEB2组PANC-1细胞迁移距离在转染24 h、48 h时减少，细胞迁移数量和侵袭数量减少；而与pcDNA3.1组相比，pcDNA3.1-ZEB2组细胞迁移距离在转染24 h、48 h时增加，细胞迁移数量和侵袭数量增加，差异均有统计学意义（P均<0.05）。

图 5.

Effect of ZEB2 on the migration distance of PANC-1 cells

ZEB2对PANC-1细胞迁移距离的影响

^* P<0.05, ^** P<0.01, vs. si-NC and pcDNA3.1 group, n=3.

图 6.

Effect of ZEB2 on the migration (A) and invasion (B) of PANC-1 cells (crystal violet staining×100)

ZEB2对PANC-1细胞迁移（A）和侵袭（B）数量的影响（结晶紫染色×100）

^* P<0.05, ^*** P<0.001, vs. si-NC and pcDNA3.1 groups, n=3.

2.5. 敲降或过表达ZEB2对PANC-1细胞中EMT标志物表达水平的影响

如图7所示，与si-NC组相比，si-ZEB2组细胞中敲降ZEB2后，上皮标志物E-cadherin mRNA表达水平升高，而间质标志物vimentin mRNA和蛋白的表达水平均降低；而与pcDNA3.1组相比，pcDNA3.1-ZEB2组细胞中过表达ZEB2后，E-cadherin mRNA表达水平降低、vimentin mRNA和蛋白表达水平均升高，以上差异均有统计学意义（P均<0.05）。

图 7.

Effect of ZEB2 on the expression of EMT markers in PANC-1 cells（×200）

ZEB2对PANC-1细胞中EMT标志物表达的影响（×200）

A-B: the qRT-PCR assay; C-D: the immunofluorescence assay. ^* P<0.05, ^** P<0.01, ^*** P<0.001, vs. si-NC and pcDNA3.1 groups, n=3.

2.6. 生物信息学预测与ZEB2有相互作用的蛋白

PPI筛选出10个与ZEB2具有相互作用及靶向关系的蛋白，包括EMT相关蛋白ZEB1、CDH1（E-cadherin）、CDH2（N-cadherin）、Twist1、Twist2，见图8，提示ZEB2与细胞的迁移侵袭能力相关。

图 8.

PPI（protein-protein interaction） analysis of ZEB2 with STRING database

STRING分析ZEB2的PPI

3. 讨论

胰腺癌是常见消化系统恶性肿瘤之一，是名副其实的“癌中之王”，其恶性程度高，侵袭性强，发展迅速，预后极差^[5]。随着饮食结构和生活规律的变化，胰腺癌成为现如今一种十分常见的恶性消化道肿瘤。胰腺癌的病因复杂，近年来的调查报告发现其发生与吸烟、饮酒、高脂肪和高蛋白饮食、过量饮用咖啡、环境污染及遗传等因素有关^[6]。胰腺癌易转移、预后差，对其作出早期诊断可能为患者的治疗提供帮助，改善患者生存质量并提高患者生存期。

ZEB2通过抑制E-cadherin的表达来诱导细胞发生EMT，促进细胞迁移和侵袭，在多种类型的癌症中起促癌作用。例如，ZEB2通过促进Wnt/β-catenin信号传导进而促进结直肠癌^[7]，ZEB2能够促进三阴性乳腺癌发生EMT和转移^[8]，ZEB2作为miR-498在肝癌细胞中的下游效应子，其过表达挽救了miR-498对肝癌细胞增殖，迁移和侵袭的抑制作用^[9]。此外，ZEB2与各种癌症亚型的不良预后和较差的总生存期有关^[10]。

本研究结果显示，与癌旁组织相比，胰腺癌组织中ZEB2表达水平升高。高表达的ZEB2可以增强胰腺癌细胞的增殖、集落形成、迁移和侵袭能力，抑制EMT上皮标志物E-cadherin的表达，促进EMT间质标志物vimentin的表达；而对ZEB2进行敲降可有效抑制胰腺癌细胞的增殖、集落形成、迁移和侵袭，上调E-cadherin的表达，下调vimentin的水平。STRING网站分析出10个与ZEB2具有相互作用的蛋白，包括EMT相关蛋白ZEB1^[11-12]、CDH1（E-cadherin）^[13-14]、CDH2（N-cadherin）^[15]、Twist1^[16]、Twist2^[17]，后续课题组将继续研究ZEB2与多种EMT相关因子的关系，以及与ZEB2有相互作用的上游基因，以完善整条通路，为胰腺癌的早期发现和治疗提供更多分子机制层面的理论支持。

综上所述，ZEB2作为一种胰腺癌的促癌因子，可能在胰腺癌的深入探究中具有重要的研究价值，其机制可能与调控细胞迁移侵袭能力、调控EMT相关因子的表达相关。

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利益冲突　所有作者均声明不存在利益冲突

Funding Statement

河北省自然科学基金资助项目（No. H2021209026、No. H2021105019）、河北省人力资源和社会保障厅项目（No. C20210340）、河北省重点研发计划项目（No. 213777115D）和河北省财政厅项目（冀财预复[2020]397号）资助