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Sheng Wu Yi Xue Gong Cheng Xue Za Zhi = Journal of Biomedical Engineering logoLink to Sheng Wu Yi Xue Gong Cheng Xue Za Zhi = Journal of Biomedical Engineering
. 2023 Aug 25;40(4):770–777. [Article in Chinese] doi: 10.7507/1001-5515.202207056

新型手性自组装短肽R-LIFE-1的理化性质及其对外泌体的控释研究

Physicochemical properties of a novel chiral self-assembling peptide R-LIFE-1 and its controlled release to exosomes

欣怡 罗 1, 迪 苏 1, 娜 卢 1, 源 万 1, 桂岑 刘 1, 忠礼 罗 1,*
PMCID: PMC10477380  PMID: 37666768

Abstract

本研究旨在探究手性自组装短肽R-LIFE-1对外泌体的包裹控释作用。采用原子力显微镜、透射电镜及冷冻扫描电镜等观察短肽R-LIFE-1的成胶能力及形态结构；采用光镜观察及荧光染色探究R-LIFE-1的生物相容性；采用超滤离心法提取外泌体并采用Western blot、纳米粒径追踪分析（NTA）、透射电镜检测外泌体质量；采用激光共聚焦显微镜及BCA蛋白定量探究短肽水凝胶对外泌体的控释效果。结果显示手性自组装短肽R-LIFE-1能够在离子触发下快速自组装形成稳定的纳米纤维网络膜片状结构，具有良好的生物相容性，能够负载外泌体对它进行包裹控释，提高外泌体的利用效率。本研究证明短肽R-LIFE-1可对外泌体进行控释，是一种理想的组织工程材料。

Keywords: 手性自组装短肽, 水凝胶, 外泌体, 控释

0. 引言

外泌体作为一类具有双层膜结构的细胞外微小囊泡[1]，直径在30～150 nm，这种微小囊泡内含有各种细胞特异的蛋白、脂质、核酸，能够作为信号分子传递给其他细胞[2]，在很多病理生理过程中发挥着重要作用[3–6]，包括免疫调节[7]、细胞生长和分化[8]、组织修复[9]等。近年来，越来越多的研究将外泌体应用于各类组织的修复，包括骨组织[10]、血管组织[11]、神经组织[9]、心肌组织[12]等，展现出了十分优秀的修复能力[13-14]，同时作为一种细胞替代疗法，能够减少干细胞修复产生的免疫、炎症风险[15]。成纤维细胞是构成皮肤真皮层的主要细胞[16]，功能活动旺盛，具有明显的蛋白质合成和分泌活动[17]。研究表明人真皮成纤维细胞（human dermal fibroblast，HDF）来源的外泌体在光老化[18]、糖尿病皮肤创伤[19]、缺血性创伤[20]等方面均有着优秀的修复能力。

手性自组装短肽（chiral self-assembling peptide，CSAP）是一种高分子纳米材料，能够在离子触发下自组装形成有序的纳米纤维支架[21]，形成含水量十分丰富的水凝胶支架，不仅具有良好的力学性能[22]，还具有很好的生物相容性[23]，因此自从Zhang等[24]合成这种纳米材料以来，CSAP已被广泛应用于各个领域，包括多种组织细胞和干细胞的三维培养、再生医学和组织工程、3D组织打印、小分子和生长因子等的持续释放[21, 25-26]。本课题组此前已经研究过CSAP在皮肤[27]、子宫[28]、心肌[29]、软骨[30]等组织中的修复作用，在这些组织中CSAP均展现出了优越的修复能力。因此我们有理由认为新合成的包含十个氨基酸序列的手性自组装短肽R-LIFE-1能够形成纳米三维网络结构，并且具有控释外泌体的作用。

本研究选用新型短肽R-LIFE-1作为研究主体，旨在观察它在离子触发下自组装形成纳米水凝胶的过程、形成后的纳米膜片的宏观及微观结构，以及作为生物材料的生物相容性等方面的性能。其次，本课题希望结合目前广泛应用于组织修复的外泌体，为外泌体提供纳米支架载体，控制它的释放，以期达到更稳定的体内浓度和更快速的修复速度。

1. 材料与方法

1.1. 材料

1.1.1. 主要试剂

短肽R-LIFE-1（纯度>95%），其氨基酸序列为：Arg Leu Glu Cys Lys Ile Asp Phe Cys Glu，成都赛恩贝生物科技有限公司赠送。DMEM培养基购于美国Gibco公司；0.25%胰蛋白酶购于美国Hyclone公司；胎牛血清购于中国依科赛生物科技有限公司；BCA试剂盒、Calcein-AM/PI双染试剂盒购于上海碧云天生物技术有限公司；刚果红、苯胺蓝染液购于北京索莱宝科技有限公司；鼠抗人CD9、CD63抗体及羊抗鼠抗体购于武汉三鹰生物技术有限公司；PVDF膜、超滤离心管、针头过滤器购于美国Millipore公司；HDF购于武汉普诺赛生命科技有限公司。

1.1.2. 主要仪器

CO2细胞培养箱、超净工作台、酶标仪（Thermo Fisher Scientific公司，美国），倒置荧光显微镜（OLYMPUS公司，日本），透射电子显微镜（JEOL公司，日本），纳米颗粒追踪分析仪（Malvern公司，英国），原子力显微镜（布鲁克公司，德国），冷冻扫描电镜（日立公司，日本）。

1.2. 方法

1.2.1. 刚果红、苯胺蓝染色

用PBS将R-LIFE-1短肽母液稀释至2.5 mg/mL，自组装0、24、48 h；取10 μL稀释后的短肽溶液滴加在载玻片上，分别取10 μL刚果红和苯胺蓝染色液滴加到短肽液滴上，染色30 s，将载玻片置于光学显微镜下观察并拍照。

1.2.2. 原子力显微镜

用PBS将短肽R-LIFE-1母液稀释至5 mg/mL，放入4℃冰箱冷藏，待短肽自组装24 h后进行原子力显微镜检测；取15 μL短肽水凝胶滴加到新撕开的云母片表面上，静置60 s后用ddH2O反复冲洗，用滤纸吸干云母片表面水分，自然晾干；上机检测，选取合适位置及视野拍照。

1.2.3. 透射电镜

用PBS将短肽R-LIFE-1母液稀释至2.5 mg/mL，放入4 ℃冰箱冷藏，待短肽自组装24 h后进行透射电镜检测；超声分散5 min，用移液器取10 μL短肽水凝胶滴加在铜网上，10 min后用滤纸吸走多余液体，待铜网自然晾干1 h；开机，调节参数至合适，选择合适的视野及放大倍数并拍照。

1.2.4. 短肽水凝胶三维培养HDF

根据实验需求，每孔取3 000个处于对数生长期的HDF于离心管中，加入100 μL/孔的完全培养基，吹打混合均匀，制成分散均匀的细胞悬液；每孔取100 μL细胞悬液，接种于96孔板中，再在每个孔内加入25 μL的PBS，为后续短肽成胶提供离子；每孔添加25 μL短肽母液，添加进去后立即吹打混匀，使细胞包裹进短肽水凝胶中，置于细胞培养箱中培养；24 h后，记为铺板第一天。

1.2.5. HDF三维培养的Live/Dead染色

铺板方法同上，HDF在细胞培养箱（37 ℃，5% CO2）分别培养3、5、7天后取出进行染色；吸出旧培养基后PBS清洗2次，多聚甲醛（20 μL/孔）固定细胞约10 min，PBS清洗2次；按每个复孔加入100 μL现配制的Calcein-AM/PI荧光染色液，加入PBS缓冲液清洗，荧光显微镜采图。

1.2.6. 外泌体的提取

选取处于生长对数期的HDF，接种于T75细胞培养瓶内，观察细胞生长到70%左右时，PBS清洗三遍，更换为不含FBS的高糖DMEM培养基，培养72 h；收集HDF培养72 h后的上清液，3 000 g离心20 min，收集上清液并用0.22 μm针头过滤器过滤一遍，将过滤后的上清液转移到超滤离心管内，3 000 g离心20 min；将超滤离心管上层内剩余的液体转移到EP管内，即为提取纯化后的外泌体，短期内储存于−80 ℃。

1.2.7. 透射电镜鉴定外泌体形态

将新鲜提取的HDF来源外泌体（HDF-Exo）用PBS稀释十倍；用移液器取10 μL样品滴加在铜网上，10 min后用滤纸吸走多余液体；用移液器吸取10 μL的3%磷钨酸滴在铜网上，3 min后用滤纸吸走多余液体；干燥，静置1 h，待铜网自然晾干；上机检测，选择合适视野拍照。

1.2.8. Western-blot鉴定外泌体标记性蛋白

将提取得到的外泌体裂解提取总蛋白，采用BCA蛋白定量法测定外泌体样本的蛋白浓度，采用10% SDS-PAGE胶电泳分离，200 mA转膜1 h，5%脱脂牛奶室温封闭1 h，PVDF膜正面朝上分别投入稀释的CD61、CD9、Tsg101一抗，4 ℃孵育过夜，二抗室温孵育1 h，ECL显影。

1.2.9. NTA鉴定外泌体粒径及浓度

提取新鲜HDF-Exo100 μL进行检测；ddH2O清洗样本池；校准仪器；PBS清洗样本池HDF-Exo以PBS稀释十倍后上机检测。

1.2.10. 短肽水凝胶对外泌体的控释曲线

提取外泌体，并采用BCA蛋白测定法测定所提取外泌体的蛋白浓度；将50 μL外泌体悬液与50 μL PBS在孔内混匀，再添加50 μL短肽母液混匀，待短肽形成水凝胶后往孔内缓慢加入50 μL PBS，重复3个复孔；分别待12、24、48、72、96、144、192、240 h时吸取10 μL上层PBS采用BCA试剂盒测定蛋白浓度，计算并绘制控释曲线。

2. 结果

2.1. 手性自组装短肽R-LIFE-1的物理性质分析

在离子的触发下，液态的短肽母液在短时间的自组装后形成了水凝胶形态，凝结在管底，倒置离心管后在重力的作用下水凝胶无法下流，初步证明它已经改变液体形态转化为水凝胶形态。R-LIFE-1的结构模拟图可揭示它由十个氨基酸序列构成，可在离子触发下通过氢键、分子间作用力、交替的亲疏水性及交替的正负电荷等作用力完成分子间的自组装（见图1a）。

图 1.

Physical properties of self-assembling peptide R-LIFE-1

手性自组装短肽R-LIFE-1的物理性质

a. R-LIFE-1短肽自组装形成水凝胶及R-LIFE-1结构模拟图；b. 短肽R-LIFE-1成胶过程（刚果红染色、苯胺蓝染色，× 100）；c. 自组装短肽R-LIFE-1的原子力显微镜图

a. R-LIFE-1 self-assembled hydrogel and structure simulation diagram of R-LIFE-1; b. R- LIFE-1 gelatinization process (Congo red staining, aniline blue staining, × 100); c. atomic force microscopy of self-assembling peptide R-LIFE-1

图 1

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刚果红染色结果（见图1b）显示：R-LIFE-1在0 h便可观察到纤维膜片状结构的出现；自组装24 h后形成了大量且致密的纤维薄膜状结构；自组装48 h后纤维薄膜结构依然存在且完整，且有增多的趋势，并且水凝胶所形成的结构更致密，边界更清晰，苯胺蓝染色结果进一步印证了刚果红染色的结果。表明R-LIFE-1具有快速形成水凝胶的能力，同时成胶效果很好。

原子力显微镜结果（见图1c）显示，R-LIFE-1经过24 h自组装后形成了纳米纤维结构，这些纳米纤维长度约为200 nm，直径约为30 nm，且纳米纤维之间相互交联，形成了纤维网络状物理结构，纤维结构稳定，相互交织成网，形成大片的网状膜片。表明短肽水凝胶膜片能够为细胞的三维培养以及外泌体的包裹释放提供稳固的空间支架与负载材料。

2.2. 采用R-LIFE-1短肽水凝胶构建三维培养及其生物相容性研究

HDF细胞在二维培养的环境下表现为贴壁生长，培养3天后，可以观察到视野下细胞全部长满，细胞边缘模糊，生长状态较差，并产生部分凋亡细胞。HDF细胞在R-LIFE-1水凝胶基质中进行三维培养时，细胞表现为圆球形多层空间生长，培养3天时，R-LIFE-1水凝胶组可见细胞仍呈圆球形多层空间生长，且细胞边缘清晰，折光性强，生长状态良好。证明短肽水凝胶可以为细胞培养及外泌体的包裹提供稳定的空间支架，并且具有良好的生物相容性(见图2a）。

图 2.

3D culture model of HDF cells constructed by R-LIFE-1

手性自组装短肽R-LIFE-1水凝胶构建的HDF细胞三维培养模型

a. 光镜下观察HDF细胞在二维和三维环境下的生长情况（× 100）；b. Live/Dead染色观察HDF细胞在二维和三维环境下的生长情况（× 40）

a. observation of the growth of HDF cells in 2D and 3D environment under light microscope (× 100); b. observation of the growth of HDF cells in 2D and 3D environment with Live/Dead staining (× 40)

图 2

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活/死细胞染色结果(见图2b）显示：HDF细胞二维培养第1天，细胞基本绿染，呈星形扁平状细胞结构，生长状态良好；第3天，细胞大多数绿染，结构模糊，出现部分红色死亡细胞；第5天细胞密度进一步增加，视野中出现大部分为红染的死亡细胞；第7天细胞生长十分拥挤，红染的死亡细胞密集分布。HDF细胞连续三维培养7天，可见细胞呈现三维空间分布，基本为绿染的活细胞，且绿染的活细胞数量逐日增多，而红染的死亡细胞较少，散在分布。证明短肽R-LIFE-1水凝胶具有良好的生物相容性，是一种理想的组织工程支架。

2.3. 外泌体的提取及鉴定

本研究采用超滤离心法从HDF的培养上清中分离细胞外泌体。外泌体的透射电镜结果(见图3a）显示，本研究提取的外泌体呈现单面凹陷的茶托样结构，能观察到典型的囊泡状双层膜结构，符合外泌体的形态特征，可用作后续实验。

图 3.

Identification of exosome derived from human dermal fibroblasts

HDF来源外泌体的鉴定

a. 外泌体的透射电镜图；b. Western blot法检测外泌体CD9、CD63和Tsg101的表达；c. 纳米粒径追踪分析检测外泌体粒径分布

a. TEM images of exosomes; b. the expressions of CD9, CD63 and Tsg101 in exosomes were detected by Western blot; c. the particle size distribution of exosomes was detected by nanoparticle tracking analysis

图 3

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为了进一步检测本研究所提取的外泌体是否符合标准，我们采用了Western blot检测HDF-Exo表面特异性蛋白CD9、CD63、Tsg101，结果显示外泌体组的CD9、CD63、Tsg101条带明显阳性(见图3b）；采用纳米粒径追踪分析（nanoparticle tracking analysis，NTA）检测外泌体粒径大小，结果显示样本粒径分布在40～200 nm之间，平均粒径为122.3 nm，浓度在4.33 × 109 particle/mL(见图3c）。Western blot及NTA结果证明我们提取得到的外泌体质量符合标准，可用作后续实验。

2.4. R-LIFE-1短肽水凝胶对外泌体的包裹、控释作用

短肽水凝胶及水凝胶包裹外泌体后的冷冻扫描电镜结果(见图4a）可以看到，短肽水凝胶形成了纳米纤维网络状结构，外泌体附着在水凝胶的纤维膜片结构上，外泌体形态未发生改变，短肽水凝胶的膜片结构也未受影响。证明短肽水凝胶能够为外泌体包裹控释提供网络状的物理支架结构。

图 4.

The encapsulation and controlled release of R-LIFE-1 hydrogel on exosomes

R-LIFE-1短肽水凝胶对外泌体的包裹、控释作用

a. R-LIFE-1短肽水凝胶包裹外泌体后的冷冻扫描电镜图；b. R-LIFE-1短肽水凝胶对外泌体的控释曲线

a. cryo-scanning electron microscopy image of R-LIFE-1 CSAP hydrogel; b. control release curve of R-LIFE-1 CSAP hydrogel for exosomes

图 4

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短肽水凝胶对外泌体的控释曲线(见图4b）显示，将外泌体包裹于水凝胶内之后的12 h，外泌体的释放率为20%，24 h后释放率为34%，此后6天内释放率逐渐上升，到第十天释放率达到99%。因此R-LIFE-1水凝胶能够有效包裹外泌体，控制其平稳释放，延长外泌体的半衰期，提高外泌体的利用效率。

3. 讨论

外泌体是一种具有双层膜结构的细胞外微小囊泡，能够被大多数细胞所分泌，直径在30～150 nm，这种微小囊泡内含有各种细胞特异的蛋白、脂质、核酸，能够作为信号分子传递给其他细胞，在很多病理生理过程中发挥着重要作用。

CSAP作为一类具有生物功能的三维仿生材料，具有独特的优势，可应用于原代细胞和干细胞的三维培养，小分子、生长因子的持续释放，以及再生修复和组织工程领域中。Onak等[31]证明了CSAP形成的三维环境促进了人间充质干细胞的增殖和成骨分化，可应用于骨组织修复；Chow等[32]证明加入血管生成区肽段的CSAP能促进血管生成和伤口愈合；Bruggeman等[33]证明了CSAP可有效控释生长因子，对再生医学有重要意义；Ligorio等[34]证明了CSAP可作为一种3D可注射细胞递送平台。

本研究结果显示，短肽R-LIFE-1由十个氨基酸合成，在各种离子的触发下可以自发地组装，形成纳米纤维，纳米纤维相互交联形成纳米纤维网络状结构，纳米纤维网进一步相互交联形成层叠状膜片结构，能够为细胞的三维培养以及外泌体的包裹释放提供稳固的空间支架与负载材料。同时，从材料来源上看，短肽R-LIFE-1水凝胶具有极为优秀的生物相容性，采用水凝胶进行细胞三维培养的结果也证明细胞在水凝胶中生长状态良好。因此，我们可以证明短肽R-LIFE-1水凝胶是一种十分理想的组织工程支架材料，能够为细胞的三维培养及外泌体的控制释放提供一种有前景的纳米水凝胶材料。

本研究可初步表明新型短肽R-LIFE-1水凝胶可包裹外泌体，对外泌体产生控释作用，但对外泌体的功能作用未进行进一步的研究，并且对短肽水凝胶的修复作用也未进行探究，后续还将研究外泌体对相关组织损伤的修复作用以及联合短肽水凝胶是否能够协同外泌体发挥作用。

4. 结论

综上所述，HDF来源的外泌体是一种比干细胞外泌体更易得、产量更大的外泌体。R-LIFE-1短肽水凝胶能够快速形成三维网络支架，稳定负载细胞及外泌体，具有良好的生物相容性和较小的细胞毒性，是一种理想的可应用于组织修复的组织工程材料。外泌体及水凝胶均具有修复组织损伤的能力，因此采用水凝胶负载外泌体为组织工程提供了一种新的研究思路，未来可应用于包括皮肤、黏膜、血管等组织的快速修复，具有广阔的临床应用前景。

重要声明

利益冲突声明：本文全体作者均声明不存在利益冲突。

作者贡献声明：罗欣怡主要参与实验设计、数据收集、数据分析和论文写作的全过程，苏迪主要参与数据收集、数据分析和论文写作过程，卢娜主要参与数据收集、数据分析和论文写作过程，万源主要参与数据分析和论文写作过程，刘桂岑主要参与数据分析和论文写作过程，罗忠礼主要参与实验设计、数据分析和论文写作过程并进行了技术指导支持及材料支持。

致谢：感谢成都赛恩贝外科学研究院对本课题的大力支持。

Funding Statement

国家自然科学基金（31771101，31540019）

The National Natural Science Foundation of China

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Articles from Sheng Wu Yi Xue Gong Cheng Xue Za Zhi = Journal of Biomedical Engineering are provided here courtesy of West China Hospital of Sichuan University

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