基于数据挖掘和网络药理学探讨中药治疗胃癌前病变的分子生物学机制

Abstract

目的

：通过数据挖掘和网络药理学方法分析治疗胃癌前病变的高频次中药及其分子生物学机制。

方法

：以“胃癌前病变”“胃癌前疾病”“胃黏膜上皮内瘤变”“胃黏膜异型增生”“胃癌前状态”“慢性胃炎，萎缩性”“中西医结合”“中医药疗法”“疗效评价”“随机对照试验”“gastric precancerous lesions”“gastric precancerous disease”“gastric mucosal intraepithelial neoplasia”“gastric mucosal heterogeneous hyperplasia”“gastric precancerous state”“chronic gastritis，atrophic”“combined Chinese and Western medicine”“Chinese medicine therapy”“efficacy evaluation”“randomized controlled trial”等为关键词，在中国期刊全文数据库、万方数据、维普数据库、PubMed和Embase等数据库中检索2001—2021年发表的文献。对符合纳排标准的文献进行信息提取，构建数据库，统计高频次中药。运用中药系统药理学数据库与分析平台和GeneCards数据库获取中药化合物及胃癌前病变靶标，构建蛋白质-蛋白质相互作用网络图，并筛选核心靶点，通过Metascape平台对核心靶点进行基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析，阐明前六味中药的活性成分、靶点、作用通路等。

结果

：共纳入482个药方，603味中药，应用频率较高的前六味中药依次为乌梅（63.35%）、莪术（58.54%）、白芍（54.06%）、丹参（49.92%）、白花蛇舌草（46.43%）、黄芪（45.44%）。网络药理分析结果显示，六味中药的活性成分乌梅4种、莪术3种、白芍9种、丹参13种、白花蛇舌草7种、黄芪9种；预测靶点乌梅77个、莪术11个、白芍33个、丹参58个、白花蛇舌草65个、黄芪89个，这些靶点分别与疾病基因进行对比后，共获得交集基因98个，其中与治疗胃癌前病变相关性较高的靶点依次为HSP90AA1、AKT1、TP53、STAT3、MAPK1、TNF。GO富集分析结果显示，高频次中药的活性成分多通过对无机物的反应、激素反应、腺体发育、细胞迁移的正向调节、细胞运动的正向调节等生物学过程发挥作用，靶点包含囊泡腔、分泌颗粒腔体、细胞质囊泡腔体、转录调节器复合体等细胞组分，具有激酶结合、蛋白激酶结合、DNA转录因子结合等分子功能。KEGG通路富集分析结果显示，白芍、乌梅、丹参、黄芪主要通过癌症通路和PI3K-AKT通路等发挥作用，莪术和白花蛇舌草主要通过癌症通路、癌症中的蛋白多糖等发挥作用，并且六味中药均涉及癌症通路，五味中药涉及PI3K-AKT通路。

结论

：本文通过数据挖掘筛选出中医药治疗胃癌前病变的前六味高频次中药，并运用网络药理学分析揭示了其通过癌症通路、PI3K-AKT通路、癌症中的蛋白多糖等参与细胞增殖、分化、免疫、炎症等过程从而发挥对胃癌前病变的作用。

中药系统药理学数据库与分析平台（Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）;蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）;基因本体（Gene Ontology，GO）;京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）;丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）;肿瘤蛋白P53（tumor protein p53，TP53）；蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）;信号转导及转录激活因子（signal transduction and activator of transcription，STAT）;热休克蛋白90α家族A（heat shock protein 90 kDa alpha class A，HSP90AA）;肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）;磷脂酰肌醇3激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）;

胃癌前病变是一个病理性概念，指一类癌变发生率较高的胃黏膜病理组织学变化，包括胃黏膜萎缩、肠上皮化生和异型增生。根据Correa级联反应 ^[1] ，胃癌前病变常伴随于慢性萎缩性胃炎，且随着病变的进展、萎缩的加重，胃癌发生风险增加，故积极干预治疗胃癌前病变对胃癌的防治意义重大。胃癌前病变是一种多因素疾病，发病机制复杂，目前尚无有效的药物可阻止或延缓疾病的进展。中药具有多途径、多靶点、多机制的特点，黄芪、白花蛇舌草、莪术等中药不仅可以改善胃癌前病变相关症状，还可以延缓其进展 ^[2] ，但具体作用机制尚不完全清楚。

运用数据挖掘方法将海量知识进行归纳分析，寻求疾病本质与辨证施治的关键联系已成为中医药科研工作者的工具。网络药理学基于系统生物学、多向药理学、基因组学、蛋白质组学等学科理论，依据组学、高通量筛选、网络可视化及网络分析等技术，揭示“药物-基因-靶点-疾病”多层次、多角度的生物网络关系，以预测药物可能的作用机制，为发现药物的药理、药效与机制提供重要参考 ^[3] 。本研究采用数据挖掘和网络药理学相结合的研究方法，分析中医药治疗胃癌前病变的高频次使用中药及其作用机制，以期为临床治疗和实验研究提供依据。

资料与方法

文献检索及纳排标准

以“胃癌前病变”“胃癌前疾病”“胃黏膜上皮内瘤变”“胃黏膜异型增生”“胃癌前状态”“慢性胃炎，萎缩性”“中西医结合”“中医药疗法”“疗效评价”“随机对照试验”“gastric precancerous lesions”“gastric precancerous disease”“gastric mucosal intraepithelial neoplasia”“gastric mucosal heterogeneous hyperplasia”“gastric precancerous state”“chronic gastritis，atrophic ”“combined Chinese and Western medicine”“Chinese medicine therapy”“efficacy evaluation”“randomized controlled trial”等为关键词，在中国期刊全文数据库、万方数据库、维普数据库、PubMed和Embase等数据库中检索2001—2021年发表的文献。

根据Cochrane手册关于干预性试验研究纳入标准结合专家组意见制订文献纳入标准：①语言为中文或英文；②研究类型为随机对照试验、临床对照试验或队列研究；③研究中干预措施为中草药、中西医结合等，对照药物为西药对症治疗、中成药、西药联合中药等。排除以下文献：①研究未设置对照组；②研究样本量小于30；③无法获取全文；④研究采用重复中药处方；⑤处方药物信息不全。

采用EndNote软件构建处方数据库

采用EndNote 20软件进行文献筛查、管理，采用Excel 2021和Epidata 3.1软件对文献信息进行提取、整理、归类，建立数据库。提取发表年份、题目、研究人群、随机、对照、盲法、样本量、对照药物、中医证型、疾病诊断标准、纳排标准等信息。

采用《中药大辞典》 ^[4] 和《中药学》 ^[5] 对所得处方用药名称进行规范整理，采用Excel 2021和SPSS 20.0软件进行药物数据统计分析。

通过数据库获取中药化合物及其靶标

通过TCMSP（ https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php） ^[6] 查询乌梅、莪术、白芍、丹参、白花蛇舌草、黄芪的化学成分。使用ADME参数筛选出可能的活性成分，设定口服生物利用度不低于30%、类药性不低于0.18、其他参数为默认值进行药物成分筛选。同时，运用TCMSP查找筛选所得化合物对应的靶标信息，将所得靶标信息输入Uniprot（ https://www.uniprot.org/）获取靶标对应的基因Symbol。

通过数据库和软件获取胃癌前病变靶点

以“gastric precancerous lesions”为关键词输入GeneCards: The Human Gene Database（ https://www.genecards.org/） ^[7] ，选取评分25及以上的靶点 ^{[ 8- 11]} 作为疾病靶点，利用Jvenn工具 ^[12] 获取药物与疾病靶点的交集。

运用软件构建PPI网络图和筛选核心靶点

将所得高频次中药治疗胃癌前病变的作用靶点合并去重，并导入STRING（ https://string-db.org） ^[13] ，设置物种为“Homo sapiens”，选取置信度高于0.9的数据，导出TSV文件。最后运用Cytoscape 3.9.1软件绘制PPI网络图，再使用软件所提供的“network analyzer”板块进行网络拓扑学分析，依据度值获得核心蛋白，并对PPI网络图进行美化。

通过Metascape网站进行GO富集和KEGG通路分析

通过Metascape平台（ http://metascape.org） ^[14] 对核心靶点进行GO富集分析和KEGG通路富集分析，将物种限制为“Homo sapiens”，以 P<0.05作为筛选条件，得到GO富集分析和KEGG通路分析结果，运用Excel 2021软件进行数据可视化并使用R语言绘制气泡图和桑基图。采用Cytoscape 3.9.1软件构建中药活性成分-靶点-信号通路网络图。

结果

纳入文献基本情况

初检得到文献9506篇，剔除重复文献后复检，根据纳入及排除标准进行手工筛选，阅读题目、摘要、全文，最终纳入887篇文献（ 图1）。

图1 .

治疗胃癌前病变中药相关文献筛选流程图

治疗胃癌前病变中药筛选结果

最终共纳入482个药方，603味中药，筛选频率较高的前六味中药依次为乌梅（63.35%）、莪术（58.54%）、白芍（54.06%）、丹参（49.92%）、白花蛇舌草（46.43%）、黄芪（45.44%），其中黄芪作为君药的使用频率最高（24.9%），其次为丹参（10.58%）。

治疗胃癌前病变中药活性成分及靶点筛选结果

在TCMSP中以口服生物利用度不低于30%、类药性不低于0.18 为筛选条件，共获得116种活性成分和340个靶点，其中活性成分乌梅8种、莪术3种、白芍13种、丹参65种、白花蛇舌草7种、黄芪20种。在GeneCards数据库中获取疾病相关基因，筛选评分25及以上的基因，得到459种疾病基因。将前述六味中药靶点分别与疾病基因进行对比后，共获得交集基因98个（ 图2），其中乌梅77个、莪术11个、白芍33个、丹参58个、白花蛇舌草65个、黄芪89个。剔除不含交集基因的活性成分并结合大量药效成分研究文献分析 ^{[ 15- 40]} ，得到与治疗胃癌前病变有关的活性成分共有45种，包括乌梅4种、莪术3种、白芍9种、丹参13种、白花蛇舌草7种、黄芪9种（附表1）。结果显示，乌梅活性成分包括槲皮素、β-谷甾醇、山柰酚等，莪术活性成分包括红豆杉素、文姜素、双去甲氧基姜黄素，白芍活性成分包括β-谷甾醇、山柰酚、儿茶素等，丹参活性成分包括1，2，5，6-四氢丹参酮、茯苓甾醇、脱氢丹参酮ⅡA等，白花蛇舌草活性成分包括麦芽糖醇、槲皮素、β-谷甾醇等，黄芪活性成分包括麦饭石、山柰酚、槲皮素等。

图2 .

六味治疗胃癌前病变中药“疾病基因-中药靶标基因”韦恩图

绿色圆圈代表胃癌前病变靶点，蓝色圆圈代表六味中药的靶点，中间深绿代表疾病与中药的交集靶点.

治疗胃癌前病变中药作用靶点网络分析

按照度值的高低排序后，获得白芍、乌梅、丹参、黄芪、白花蛇舌草、莪术六味中药度值前三位的核心蛋白分别为MAPK1、JUN、RELA，TP53、JUN、AKT1，TP53、STAT3、AKT1，TP53、JUN、HSP90AA1，HSP90AA1、TP53、RELA，ESR1、MAPK1、MAPK14。对六味中药的核心蛋白进行合并去重，制作PPI网络图（ 图3）。结果显示，与治疗胃癌前病变相关性较高的靶点为HSP90AA1、AKT1、TP53、STAT3、MAPK1、TNF。

图3 .

六味治疗胃癌前病变中药度值前三位核心蛋白蛋白质-蛋白质相互作用网络图

网络图中包含102个节点, 463条边，图中圆形节点代表每个基因蛋白，边代表连接的两个蛋白有相互作用关系. 节点面积越大、蓝色越深，度值越高，即该靶点与其他靶点的相关性越高，在网络中越重要.

GO富集分析结果

将六味中药与疾病的交集基因（乌梅77个、莪术11个、白芍33个、丹参58个、白花蛇舌草65个、黄芪89个）分别导入Metascape进行GO富集分析。统计出上述中药中符合筛选标准的富集条目共1666条，其中分子功能121条、生物学过程1474条、细胞组成71条。根据所富集的基因数对其进行排序，选择前十的GO富集分析结果绘制气泡图，见 图4。六味中药的活性成分多通过对无机物的反应（response to inorganic substance）、激素反应（response to hormone）、腺体发育（gland development）、细胞迁移的正向调节（positive regulation of cell migration）、细胞运动的正向调节（positive regulation of cell motility）等生物学过程发挥作用，靶点包含囊泡腔（vesicle lumen）、分泌颗粒腔体（secretory granule lumen）、细胞质囊泡腔体（cytoplasmic vesicle lumen）、转录调节器复合体（transcription regulator complex）等细胞组分，具有激酶结合（kinase binding），蛋白激酶结合（protein kinase binding）、DNA转录因子结合（DNA-binding transcription factor binding）等分子功能。

图4 .

六味治疗胃癌前病变中药靶点基因本体富集分析结果

圆形代表生物学过程，三角形代表细胞组成，正方形代表分子功能.

KEGG富集分析结果

以 P<0.05为筛选条件共获得通路白芍131条、乌梅166条、丹参139条、黄芪168条、莪术23条、白花蛇舌草154条。根据基因数排序，分别取前十条通路（附表2）并运用R语言绘制桑基图（ 图5）。结果可见，白芍、乌梅、丹参、黄芪主要通过癌症通路（pathways in cancer）和PI3K-AKT通路等发挥作用，莪术和白花蛇舌草主要通过癌症通路、癌症中的蛋白多糖（proteoglycans in cancer）等发挥作用，并且六味中药均涉及癌症通路，五味中药涉及PI3K-AKT通路；六味中药治疗胃癌前病变利用度较高的通路为癌症通路、PI3K-AKT通路和癌症中的蛋白多糖等。

图5 .

六味治疗胃癌前病变中药靶点京都基因与基因组百科全书富集分析结果

采用Cytoscape软件构建白芍、乌梅、丹参、黄芪、莪术、白花蛇舌草的化合物-靶点-通路网络图，见 图6。六味中药贡献最大的通路均为癌症通路，且均涉及HSP90AA1、AKT1、TP53、STAT3、MAPK1、TNF六个靶点，后者与异生物质代谢、炎症、细胞增殖、基因转录有关，可能具有消灭致癌物质、抗炎、抗菌和抑制细胞增殖、分化等作用。

图6 .

六味治疗胃癌前病变相关化合物-靶点-通路网络图

菱形代表靶点，三角形代表通路，圆形代表化合物，图标随着化合物-靶点、靶点-通路的相关性增强而增大、颜色加深.

讨论

胃癌前病变是指具有恶性转化可能的胃黏膜病理改变，与胃癌密切相关 ^[41] ，严重威胁人类的生命健康。传统医学认为其核心病机是气虚血瘀，发病与情志失和、饮食不调、外邪犯胃及脾胃素虚等多种因素有关 ^[42] 。现代医学认为，胃癌前病变的发生与多种病理过程反复作用于胃上皮组织而导致胃固有腺体减少、黏膜萎缩有关 ^{[ 43- 45]} ，如幽门螺杆菌诱导胃上皮细胞释放炎症介质诱发炎症反应、病毒侵袭诱发机体免疫反应、细胞毒素相关蛋白直接损害胃黏膜等。研究证实，中草药治疗胃癌前病变有一定疗效优势 ^[46] ，但其作用机制尚未明确。本文结合数据挖掘和网络药理学方法探讨了六味高频次中药乌梅、莪术、白芍、丹参、白花蛇舌草、黄芪对胃癌前病变的干预作用，分别筛选药物的活性成分及核心靶点，阐明其治疗胃癌前病变的作用机制。

六味中药筛选得到的主要活性成分包括β-谷甾醇、山柰酚、槲皮素等。β‐谷甾醇有较强的抗炎和调节免疫作用 ^[47] ，可使胃癌细胞中AMPK、PTEN蛋白表达增加，HSP90蛋白表达下调，诱导肿瘤细胞凋亡并抑制其生长 ^[48] 。研究表明，山柰酚可通过抑制EPK/MAPK通路、PI3K-AKT通路诱导胃癌细胞凋亡 ^[49] 。槲皮素可以抑制由炎症因子脂多糖所引起的中性粒细胞自发性凋亡的延迟；同时槲皮素也降低中性粒细胞对炎症因子的敏感性，从而达到抗炎的目的 ^[50] 。此外，于志君等 ^[51] 发现，槲皮素可抑制胃癌MGC-803细胞的增殖，从而在抑制肿瘤淋巴结转移中发挥作用。

乌梅、莪术、白芍、丹参、白花蛇舌草、黄芪与胃癌前病变的交集靶点分别有77、11、33、58、65、89个，具有统计学意义的通路分别有166、23、131、139、154、168条。在预测的靶点中，HSP90AA1是细胞内最活跃的分子伴侣之一，在肿瘤的发生、发展及侵袭转移过程中发挥着重要作用。过度表达的HSP90AA1可导致强烈的免疫反应，进而参与肿瘤的形成 ^[52] 。MAPK1是由丝氨酸-苏氨酸激酶组成的蛋白激酶，其激活与胃癌细胞的侵袭密切相关。研究表明，在胃癌细胞系中敲低 MAPK1表达可抑制细胞增殖、迁移及侵袭，诱导凋亡 ^[53] 。AKT1是维持免疫系统功能的重要氨基酸，可调节许多过程，包括代谢、增殖、细胞存活等，与胃癌细胞增殖密切相关 ^[54] 。TP53是现已知与人类肿瘤发生相关性最高的抑癌基因，与肿瘤的增殖、分化等过程密切相关，且在胃癌组织中呈高表达 ^{[ 55- 56]} 。STAT3信号通路在调控胃癌的发生、发展中具有重要作用，可通过调控细胞自噬进而影响胃癌患者微血管生成能力 ^[57] 。TNF是由巨噬细胞及淋巴细胞分泌的一种具有广泛生物学活性的细胞因子，可引起肿瘤坏死性出血，正常水平TNF-α可以维持机体内环境的稳定并促进组织修复，促进肿瘤细胞凋亡 ^[58] 。研究表明，TNF-α主要通过作用于体外培养的胃癌细胞SGC-7901，从而抑制胃癌细胞的生长，且抑制率与其浓度呈线性相关 ^[59] 。

在预测的通路中，癌症通路和PI3K-AKT信号通路是白芍、乌梅、丹参、黄芪最主要的通路；癌症通路和癌症中的蛋白多糖是莪术和白花蛇舌草最主要的通路；PI3K-AKT信号通路是在外环境压力下细胞生存的关键调节因素，当肿瘤细胞的生存环境有压力时，该通路被激活，参与调节细胞的生长、增殖、凋亡、迁移、血管生成和周期运行 ^[60] 。肿瘤微环境中的许多蛋白多糖有助于各种类型癌症的生物学过程，包括增殖、黏附、血管生成和转移，从而影响肿瘤进展 ^[61] 。六味中药共有的通路是癌症通路，其通过参与细胞增殖、分化、免疫、炎症、血管调节等过程发挥相应的调节作用 ^[62] 。

综上所述，本文从数据层面分析了中药治疗胃癌前病变的多成分、多靶点、多通路的作用机制，结果表明治疗胃癌前病变的六味高频次中药均涉及免疫、癌症、信号转导等共同通路，其中五味涉及炎症相关通路，且白芍、乌梅、丹参、黄芪的主要通路和靶点基本相同，可能均通过介导机体免疫、炎症相关机制，发挥抗炎、抗菌及遏制病毒对机体的破坏等作用；莪术和白花蛇舌草主要通过癌症相关通路发挥抑制肿瘤细胞增殖、分化，促进其凋亡等作用，从而达到延缓胃癌前病变进展的目的。本研究体现了中药治疗胃癌前病变高频用药的一致性和科学性，有助于揭示中医药防治胃癌前病变的重要机制，同时为中成药及固定复方的研究提供了思路。

COMPETING INTERESTS

所有作者均声明不存在利益冲突

Funding Statement

中央级公益性科研院所基本科研业务费（2020YJSZX-5）