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. 2023 Aug 25;52(4):473–484. [Article in Chinese] doi: 10.3724/zdxbyxb-2023-0091

环状RNA-SCAF8通过miR-93-5p/TXNIP通路促进血管内皮细胞焦亡

CircRNA-SCAF8 promotes vascular endothelial cell pyroptosis by regulating the miR-93-5p/TXNIP axis

王 冰 1,2,#, 于 欣雨 1,#,3, 陈 天驰 1, 邱 宸阳 1, 陆 炜 2, 郑 祥韬 3,✉,✉, 吴 子衡 1,✉,✉
Editors: 余 方, 沈 敏
PMCID: PMC10495250  PMID: 37643981

Abstract

目的

探究环状RNA（circRNA）-SR相关CTD相关因子8（SCAF8）在高糖环境下对血管内皮细胞焦亡发挥的作用及机制。

方法

将来源于人脐静脉内皮细胞分为正常对照组、高糖对照组分别置于5、33 mmol/L葡萄糖浓度的细胞培养基培养，RNA对照组、circRNA-SCAF8抑制组、微RNA（miR）-93-5p过表达组和miR-93-5p抑制组分别在高糖环境下加入无功能siRNA、circRNA-SCAF8抑制分子、miR-93-5p过表达分子和miR-93-5p抑制剂。采用细胞计数试剂盒8（CCK-8）法、流式细胞术和Hoechst 33342/碘化丙啶双荧光染色法检测细胞存活率和焦亡率，采用蛋白质印迹法和酶联免疫吸附法检测凋亡相关斑点样蛋白（ASC）、胱天蛋白酶1（caspase-1）、Gasdermin D蛋白（GSDMD）、NOD样受体家族蛋白3（NLRP-3）、硫氧还蛋白相互作用蛋白（TXNIP）、IL-18和IL-1β等焦亡相关因子表达，采用定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）检测circRNA-SCAF8、miR-93-5p和TXNIP的基因表达，采用荧光原位杂交法定位circRNA-SCAF8和miR-93-5p，采用双荧光素酶实验验证miR-93-5p与上下游分子的靶向调控关系。

结果

与RNA对照组比较，circRNA-SCAF8抑制组和miR-93-5p过表达组细胞存活率升高（均P<0.01），细胞焦亡率降低（均P<0.01），TXNIP、NLRP-3、caspase-1、GSDMD、ASC、IL-18和IL-1β等焦亡相关因子的表达量显著减少（均P<0.05）；抑制circRNA-SCAF8后miR-93-5p的表达量显著增加（P<0.01），过表达miR-93-5p后circRNA-SCAF8的表达有降低趋势，但差异无统计学意义（P>0.05）。miR-93-5p通过与circRNA-SCAF8的3 ´ UTR区结合下调circRNA-SCAF8表达，miR-93-5p通过与TXNIP的3 ´ UTR区结合下调TXNIP表达。circRNA-SCAF8和miR-93-5p均位于细胞质中，在细胞中高度关联。qRT-PCR结果显示，过表达或抑制miR-93-5p后，TXNIP的相对表达量较RNA对照组分别增加或减少（均P<0.05），证明miR-93-5p可调控TXNIP基因表达。

结论

circRNA-SCAF8/miR-93-5p/TXNIP通路可能参与调控高糖环境下血管内皮细胞焦亡。

Keywords: 2型糖尿病, 细胞焦亡, 人脐静脉内皮细胞, 硫氧还蛋白相互作用蛋白, 环状RNA-SR相关CTD相关因子8, 微RNA-93-5p

血管并发症是2型糖尿病患者死亡的主要原因［1-2］。糖尿病血管并发症与血管内皮功能受损密切相关，但高糖环境诱发内皮功能障碍的机制目前尚不完全清楚，研究表明可能与细胞焦亡相关［3-7］。细胞焦亡又称细胞炎性坏死，是一种依赖于caspase-1亚族（caspase-1、4、5、11）诱导的坏死性和炎症性细胞程序性死亡，与细胞凋亡之间存在质膜破裂等共同特征［8］。研究显示，经典和非经典信号通路都参与细胞焦亡［9-10］。在经典通路中，NLRP-3感知外部刺激［11-12］，与ASC结合后激活caspase-1，caspase-1切割促炎性细胞因子IL-18和IL-1β从而引起细胞炎症；在非经典通路中，caspase-4、5、11可以感知细菌脂多糖，形成炎性小体来切割GSDMD，从而释放炎症介质、产生炎症反应［13］。三磷酸腺苷也可以激活巨噬细胞中的caspase-3，诱导细胞焦亡［14］。

circRNA是一类没有3 ´ -5 ´ 多聚腺苷酸化尾的闭环结构内源性非编码RNA，在癌症、骨关节炎和血管功能障碍等多种疾病的发展中起着至关重要的作用［15-19］。目前，已有研究证实circRNA-SCAF8在细胞焦亡中发挥作用［20-21］，但其通过何种通路调控血管内皮细胞焦亡尚未证实。研究显示，circRNA可以通过精准调控miRNA［22-23］，沉默靶mRNA或修饰mRNA翻译来影响蛋白质编码基因的表达，这条通路在肝细胞癌中已经得到了印证［24］。此外，circRNA作用于miR-93-5p在糖尿病和动脉粥样硬化中也发挥重要作用［25-26］。miR-93-5p下游的TXNIP不仅在葡萄糖摄取、代谢和利用方面发挥重要作用［27-28］，还能引发内皮细胞功能障碍［28］。本研究通过细胞实验，以期验证高糖条件下circRNA-SCAF8通过作用于miR-93-5p来调控TXNIP的表达促进血管内皮细胞焦亡。

1. 材料与方法

1.1. 细胞、试剂和主要仪器

HUEVC（产品号CM-H082）来源于ScienCell公司；人胚胎肾293细胞（Expi293F GnTI细胞系）来源于ThermoFisher Scientific公司。

细胞培养基、胎牛血清、青霉素和链霉素溶液为Biological Industries公司产品；CCK-8试剂盒为Dojindo公司产品；Annexin-FITC溶液和碘化丙啶溶液为BD Bioscience公司产品；Hoechst 33342/碘化丙啶双荧光染色试剂盒、BCA蛋白检测盒、RIPA缓冲液为上海碧云天生物技术有限公司产品；细胞转染液、FISH试剂盒和LipofectamineTM 2000转染液为ThermoFisher Scientific公司产品；质粒小量制备试剂盒为上海捷瑞生物工程有限公司产品；SDS聚丙烯酰胺凝胶、聚偏二氟乙烯膜为Invitrogen公司产品；TXNIP为Abcam公司产品；鼠单抗caspase-1（42 000、45 000）、兔多抗NLRP3（118 000）为Santa Cruz公司产品；兔单抗TNXIP（44 000）、兔多抗ASC（25 000）和兔多抗GSDMD（35 000/53 000）为Affinity公司产品；HRP标记羊抗小鼠二抗、HRP标记羊抗兔二抗为武汉博士德生物工程有限公司产品；NLRP3为Novus公司产品；caspase-1为Santa Cruz公司产品；IL-18和IL-1β ELISA试剂盒为上海鼎桑生物科技有限公司产品；TRIzol试剂为Ambion公司产品；HiScript逆转录酶试剂盒为南京诺唯赞生物科技股份有限公司产品。

GAPDH、TXNIP、miR-93-5p和circRNA-SCAF8引物由青岛科技有限公司设计并合成；circRNA-SCAF8抑制分子（序列号CAGCAGTTGTATTCCCTGA）、miR-93-5p过表达分子（序列号CAAAGTGCTGTTCGTGCAGGTAG）、miR-93-5p抑制剂、无功能siRNA（序列号TTCTCCGAACGTGTCACGT）由广州锐博生物技术有限公司设计并合成。

共聚焦显微镜为Leica公司产品；酶标仪为Molecular Devices公司产品；倒置显微镜为Olympus公司产品；低速离心机来源于德国Eppendorf公司；微量分光光度计为上海奥盛集团有限公司产品；紫外分析仪为北京君意东方电泳设备有限公司产品；qRT-PCR仪为美国ABI公司产品；双荧光素酶报告分析系统为美国Promega公司产品。

1.2. HUVEC复苏和培养

从液氮中取出细胞冻存管，迅速放入37 ℃水浴中解冻。用75%乙醇擦拭冻存管后，吸取内容物至15 mL无菌离心管中，逐滴加入预温至37 ℃的培养液4~5 mL，混匀，室温500×g离心10 min，弃上清液。用培养液4~5 mL洗涤一次后离心弃去上清液，加HUVEC完全培养液4~5 mL备用。每支HUVEC冻存管含细胞数为5×105个。

用去离子水配制0.5%明胶溶液，过滤除菌。取2~4个T25培养瓶，每个培养瓶中加入2~3 mL 0.5%明胶溶液并摇匀，使包被液布满培养瓶底面，置于37 ℃培养箱内放置2 h。细胞接种前吸净包被液，每瓶加培养液3~5 mL，按2500~5000个/cm2接种，摇匀后置于37 ℃，5%二氧化碳培养箱内培养24 h，至细胞完全贴壁。更换培养液后继续培养。每周更换培养液两次，至细胞长至覆盖培养面的70%~80%后进行传代或冻存。

1.3. HUEVC分组及干预

正常对照组：HUVEC置于5 mmol/L葡萄糖浓度的细胞培养基（10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素溶液）中生长，置于37 ℃、含5%二氧化碳的加湿二氧化碳培养箱中培养；高糖对照组：HUVEC置于33 mmol/L葡萄糖浓度的细胞培养基，其余条件同正常对照组；RNA对照组：高糖环境下加入无功能siRNA；circRNA-SCAF8抑制组：高糖环境下加入circRNA-SCAF8抑制分子；miR-93-5p过表达组：高糖环境下加入miR-93-5p过表达分子；miR-93-5p抑制组：高糖环境下加入miR-93-5p抑制剂。

1.4. CCK-8法检测细胞存活率

选取生长状态良好的对数生长期HUVEC制作细胞悬液，混匀，将HUVEC以1×105个/孔接种于六孔板中，使细胞密度不低于1000个/孔，培养板置于37 ℃、5%二氧化碳培养箱内培养24 h。每孔加入CCK-8试剂10 μL，轻振混匀，另设空白对照组（含培养基和CCK-8溶液，不含细胞）。将培养板置于37 ℃、5%二氧化碳培养箱孵育1~4 h，最佳孵育时间通过目测染色程度或用酶标仪测定决定。使用酶标仪在450 nm波长处测定吸光度值，重复测定三次。细胞存活率（%）=（各组细胞吸光度值/空白对照组吸光度值）×100%。

1.5. 流式细胞术和Hoechst 33342/碘化丙啶双荧光染色法检测细胞焦亡

流式细胞术：在六孔板培养HUVEC，待细胞生长达到60%~70%后把细胞培养液吸出至离心管内，PBS洗涤贴壁细胞一次，加入适量胰蛋白酶细胞消化液消化细胞。室温孵育，吸除胰蛋白酶细胞消化液。收集的细胞培养液稍混匀，转移到离心管内，1000×g离心5 min，弃上清液，收集细胞，用PBS轻轻重悬细胞并计数。每管加入5 μL膜联蛋白V-FITC液和碘化丙啶溶液后混匀，避光孵育15 min。采用流式细胞仪检测，实验结果以荧光强度散点图表示，通过观察荧光染色的细胞在四象限的分布判断焦亡细胞比例。

Hoechst 33342/碘化丙啶双荧光染色法：将HUVEC以5×103个/孔接种于24孔板中，用腺病毒转染液转染细胞。稳定转染的细胞使用5 μL Hoechst 33342在37 ℃下避光孵育10 min，再用3 μL碘化丙啶溶液在室温下处理15 min。通过荧光显微镜显像观察焦亡细胞在视野中的比例。

1.6. 蛋白质印迹法检测焦亡相关蛋白表达

采用RIPA缓冲液从1×105个细胞中分离总蛋白，采用BCA蛋白检测盒进行蛋白浓度定量。用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离总蛋白，并将分离的蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜上。将膜封闭1 h后，与一抗在4 ℃环境下孵育过夜，然后与二抗在室温下孵育1 h。电泳检测TXNIP、NLRP-3、caspase-1、ASC、GSDMD和GAPDH。用ECL化学发光试剂对蛋白条带进行可视化处理，用ImageJ软件分析其灰度。以GAPDH为内参，分别计算TXNIP、NLRP-3、caspase-1、ASC和GSDMD与GAPDH的相对表达量并归一化处理。

1.7. ELISA法检测细胞中IL-18和IL-1β的表达

使用ELISA试剂盒测定HUVEC中IL-1β和IL-18的浓度。用包被缓冲液稀释特异性抗体球蛋白至最适浓度（1~10 μg/mL），每孔加0.3 mL，4 ℃过夜。次日弃去溶液，用洗涤缓冲液洗三次，每次3 min。每孔加入0.2 mL用稀释缓冲液稀释的含抗原的被检标本，置于37 ℃环境孵育1~2 h，然后洗涤。各孔再加入0.2 mL用稀释缓冲液稀释的酶标记特异性抗体溶液，37 ℃作用1~2 h，然后洗涤。再加入0.2 mL底物溶液，室温作用30 min。最后各孔中加入2 mol/L柠檬酸0.05 mL。目测或用酶标比色计测定吸光度值。颜色越深说明阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅。使用ELISA检测仪于450 nm波长处测定各孔吸光度值，以空白对照孔调零，大于规定的阴性对照吸光度值的2.1倍即为阳性。

1.8. qRT-PCR检测circRNA-SCAF8、miR-93-5p和TXNIP的基因表达

采用TRIzol试剂分离RNA，使用HiScript逆转录酶试剂盒和qRT-PCR仪将RNA逆转录成cDNA后进行检测。采用GenBank数据库查询基因序列并设计引物，见表1。将20 μL反应液中含10×PCR扩增缓冲液2 μL、四种dNTP（10 mmol/L）2 μL、RNA酶抑制剂20 U、mRNA 1~2 μg（或RNA 5~10 μg）、引物1 μL等充分混匀后，于42 ℃反应60 min，反应完毕后将反应管在95 ℃下加热5 min，使逆转录酶失活和RNA-cDNA杂合物变性。以该cDNA第一链为模板，以内参GADPH为对照进行平衡，同体系扩增目的基因的相对量。反应结束后根据扩增曲线数据，采用2－ΔΔCt法计算mRNA相对转录水平。

表1.

各目的基因引物序列

目的基因 序列（5 ´ →3 ´ ）
GAPDH 正向：TCAAGAAGGTGGTGAAGCAGG
反向：TCAAAGGTGGAGGAGTGGGT
TXNIP 正向：TGAAGGCTTTTCTTGACCGC
反向：TCGAGCAGAGACAGACACC
miR-93-5p 环引物：GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGA GGTATTCGCACTGGATACGACCTACCTGC
正向：TGCGCCAAAGTGCTGTTCGTGCA
反向：CCAGTGCAGGGTCCGAGGTATT
circRNA-SCAF8 正向：GGATTCCGCCTCCAGTTGTC
反向：GGATTCCGCCTCCAGTTGTC
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GAPDH：甘油醛-3-磷酸脱氢酶；TXNIP：硫氧还蛋白相互作用蛋白；miR：微RNA；circRNA：环状RNA；SCAF：SR相关CTD相关因子.

1.9. FISH观察circRNA-SCAF8和miR-93-5p定位

使用LipofectamineTM 2000转染液将含有过表达质粒的pcDNA载体转染至2×105个HUVEC。用PBS清洗细胞，并用4%多聚甲醛固定10 min。使用70%乙醇渗透12 h，再次用PBS洗涤三次，然后将细胞在50%甲酰胺和2 mol/L柠檬酸钠缓冲液中水化10 min。取200 μL复染溶液滴加在玻片标本上，用共聚焦显微镜观察，通过细胞内红色荧光（miRNA）和绿色荧光（circRNA）观察circRNA-SCAF8和miR-93-5p定位。

1.10. 双荧光素酶实验验证miR-93-5p与上下游分子的靶向调控关系

通过双荧光素酶实验验证miR-93-5p与circRNA-SCAF8和TXNIP在基因层面的靶向调控关系。验证miR-93-5p与circRNA-SCAF8靶向互作时，使用质粒小量制备试剂盒构建荧光素酶报告质粒，产生携带野生型或突变型circRNA-SCAF8质粒的荧光素酶报告基因。使用LipofectamineTM 2000转染液将含有pcDNA circRNA-SCAF8质粒的荧光素酶载体与miR-93-5p过表达分子、miR-93-5p抑制剂或无功能siRNA共转染至人胚胎肾293细胞。48 h后收集并裂解细胞。验证miR-93-5p/TXNIP信号通路是否激活时，构建荧光素酶报告质粒，产生携带野生型或突变型TXNIP基因质粒的荧光素酶报告基因，其余步骤同上所述。使用双荧光素酶报告分析仪评估荧光强度，通过荧光强度推断基因表达水平。

1.11. 统计学方法

采用GraphPad 7软件进行统计分析。每个实验数据用三个样本进行重复分析，符合正态分布的计量资料采用均数±标准差（ x¯±s ）表示，组间比较采用t检验或单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2. 结 果

2.1. circRNA-SCAF8抑制分子、miR-93-5p过表达分子和miR-93-5p抑制剂的构建

circRNA-SCAF8抑制组的circRNA-SCAF8相对表达量为0.40±0.05，显著低于正常对照组（1.00±0.00，P<0.01）、高糖对照组（1.70±0.40，P<0.01）和RNA对照组（1.55±0.57，P<0.05）。提示circRNA-SCAF8抑制分子对circRNA-SCAF8的表达具有显著抑制效果，证明circRNA-SCAF8抑制组模型构建成功。

miR-93-5p过表达组的miR-93-5p相对表达量为10.21±1.67，显著高于正常对照组（1.00±0.00，P<0.01）、高糖对照组（0.40±0.04，P<0.01）和RNA对照组（0.32±0.09，P<0.01）。提示miR-93-5p过表达分子对miR-93-5p的表达具有显著增强效果，证明miR-93-5p过表达组模型构建成功。

miR-93-5p抑制组的miR-93-5p相对表达量为0.12±0.02，显著低于正常对照组（1.00±0.00，P<0.01）、高糖对照组（0.34±0.05，P<0.01）和RNA对照组（0.33±0.07，P<0.01）。提示miR-93-5p抑制剂对miR-93-5p的表达具有显著抑制效果，证明miR-93-5p抑制组模型构建成功。

2.2. 抑制circRNA-SCAF8表达对细胞焦亡、焦亡相关蛋白和miR-93-5p表达的影响

CCK-8法和流式细胞术检测结果显示，circRNA-SCAF8抑制组细胞存活率较RNA对照组显著升高（P<0.01），细胞焦亡率较RNA对照组显著下降（P<0.01），见表2和图1。Hoechst 33342/碘化丙啶双荧光染色结果显示，circRNA-SCAF8抑制组焦亡细胞在视野中的比例较RNA对照组下降，见图2。提示抑制circRNA-SCAF8可减少HUVEC焦亡。

表2.

circRNA-SCAF8抑制组与各对照组的细胞存活率和细胞焦亡率比较

组 别 n 细胞存活率 细胞焦亡率
正常对照组 3 110.6±2.7 3.13±0.46
高糖对照组 3 92.9±1.7** 15.53±0.57**
RNA对照组 3 91.6±2.7 14.78±0.56
circRNA-SCAF8抑制组 3 99.8±1.2## 9.23±0.80##
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与正常对照组比较，** P<0.01；与RNA对照组比较，## P<0.01. circRNA：环状RNA；SCAF：SR相关CTD相关因子.

x¯±s ，%

图1. circRNA-SCAF8抑制组与各对照组流式细胞检测结果.

图1

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circRNA：环状RNA；SCAF：SR相关CTD相关因子.

图2. circRNA-SCAF8抑制组与各对照组Hoechst 33342/碘化丙啶荧光染色图.

图2

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蓝色荧光信号为活细胞，红色荧光信号为焦亡细胞. 标尺=1000 μm. circRNA：环状RNA；SCAF：SR相关CTD相关因子.

蛋白质印迹法和ELISA检测结果显示，circRNA-SCAF8抑制组TXNIP、NLRP-3、caspase-1、GSDMD、ASC、IL-18和IL-1β等焦亡相关因子的表达量显著低于RNA对照组（P<0.05），见图3、表3。结果提示，抑制circRNA-SCAF8可降低焦亡相关因子的表达。

图3. circRNA-SCAF8抑制组与各对照组焦亡相关因子表达电泳图.

图3

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circRNA：环状RNA；SCAF：SR相关CTD相关因子；NLRP：NOD样受体家族蛋白；TXNLP：硫氧还蛋白相互作用蛋白；caspase：胱天蛋白酶； GSDMD：Gasdermin D蛋白；ASC：凋亡相关斑点样蛋白；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脱氢酶.

表3.

circRNA-SCAF8抑制组与各对照组焦亡相关因子表达比较

组 别 NLRP-3 caspase-1 TXNLP GSDMD ASC IL-18（pg/mL） IL-1β（pg/mL）
正常对照组 0.29±0.07 0.05±0.01 0.26±0.04 0.16±0.02 0.20±0.02 11.9±2.2 8.8±2.9
高糖对照组 0.62±0.10** 0.19±0.04** 0.64±0.08** 0.34±0.04* 0.51±0.04** 41.2±6.6** 61.1±10.6**
RNA对照组 0.58±0.09 0.20±0.06 0.63±0.09 0.32±0.06 0.50±0.05 41.8±4.6 60.1±6.5
circRNA-SCAF8抑制组 0.43±0.06# 0.12±0.02# 0.35±0.06## 0.21±0.03# 0.26±0.04# 25.8±3.9# 27.1±5.6##
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与正常对照组比较，* P<0.05，** P<0.01；与RNA对照组比较，# P<0.05，## P<0.01. circRNA：环状RNA；SCAF：SR相关CTD相关因子；NLRP：NOD样受体家族蛋白；caspase：胱天蛋白酶； TXNLP：硫氧还蛋白相互作用蛋白；GSDMD：Gasdermin D蛋白；ASC：凋亡相关斑点样蛋白.

x¯±s ，n=3

qRT-PCR结果显示，正常对照组、高糖对照组、RNA对照组和circRNA-SCAF8抑制组miR-93-5p的表达量分别为1.00±0.00、0.38±0.05、0.41±0.13和0.74±0.07，其中高糖对照组较正常对照组miR-93-5p表达量显著减少（P<0.01），而circRNA-SCAF8抑制组较RNA对照组miR-93-5p表达量显著增加（P<0.01），提示抑制circRNA-SCAF8可促进miR-93-5p的合成。

2.3. 过表达miR-93-5p对细胞焦亡、焦亡相关蛋白和circRNA-SCAF8表达的影响

CCK-8法和流式细胞术检测结果显示，miR-93-5p过表达组细胞存活率显著高于RNA对照组（P<0.01），细胞焦亡率显著低于RNA对照组（P<0.01），见表4和图4。Hoechst 33342/碘化丙啶双荧光染色结果显示，miR-93-5p过表达组焦亡细胞在视野中的比例较RNA对照组下降，见图5。提示过表达miR-93-5p可减少HUVEC焦亡。

表4.

miR-93-5p过表达组与各对照组的细胞存活率和细胞焦亡率比较

组 别 n 细胞存活率 细胞焦亡率
正常对照组 3 95.3±3.5 2.57±1.12
高糖对照组 3 78.1±2.9** 13.63±0.97**
RNA对照组 3 75.9±1.4 14.25±0.83
miR-93-5p过表达组 3 87.5±3.8## 9.60±0.73##
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与正常对照组比较，** P<0.01；与RNA对照组比较，## P<0.01. miR：微RNA.

x¯±s ，%

图4. miR-93-5p过表达组与各对照组流式细胞检测结果.

图4

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miR：微RNA.

图5. miR-93-5p过表达组与各对照组Hoechst 33342/碘化丙啶荧光染色图.

图5

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蓝色荧光信号为活细胞，红色荧光信号为焦亡细胞. 标尺=1000 μm. miR：微RNA.

蛋白质印迹法和ELISA检测结果显示，miR-93-5p过表达组TXNIP、NLRP-3、caspase-1、GSDMD、ASC、IL-18和IL-1β等焦亡相关因子的表达量显著低于RNA对照组（P<0.05），见图6、表5。结果提示，过表达miR-93-5p可降低TXNIP等焦亡相关因子的表达。

图6. miR-93-5p过表达组与各对照组焦亡相关因子表达电泳图.

图6

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miR：微RNA；NLRP：NOD样受体家族蛋白；TXNLP：硫氧还蛋白相互作用蛋白；caspase：胱天蛋白酶； GSDMD：Gasdermin D蛋白；ASC：凋亡相关斑点样蛋白；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脱氢酶.

表5.

miR-93-5p过表达组与各对照组焦亡相关因子表达比较

组 别 NLRP-3 caspase-1 TXNLP GSDMD ASC IL-18（pg/mL） IL-1β（pg/mL）
正常对照组 0.33±0.04 0.07±0.02 0.21±0.05 0.12±0.03 0.28±0.04 11.9±4.1 9.3±2.9
高糖对照组 0.69±0.09** 0.26±0.03** 0.63±0.07** 0.33±0.04* 0.62±0.05** 43.0±8.9** 62.2±10.9**
RNA对照组 0.66±0.09 0.27±0.05 0.65±0.07 0.34±0.05 0.71±0.09 41.1±5.6 59.3±11.0
miR-93-5p过表达组 0.51±0.04# 0.13±0.03# 0.40±0.04## 0.16±0.04## 0.39±0.05# 23.8±4.1# 21.3±5.1##
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与正常对照组比较，* P<0.05，** P<0.01；与RNA对照组比较，# P<0.05，## P<0.01. NLRP：NOD样受体家族蛋白；caspase：胱天蛋白酶； TXNLP：硫氧还蛋白相互作用蛋白；GSDMD：Gasdermin D蛋白；ASC：凋亡相关斑点样蛋白；miR：微RNA.

x¯±s ，n=3

qRT-PCR结果显示，正常对照组、高糖对照组、RNA对照组和miR-93-5p过表达组circRNA-SCAF8的表达量分别为1.00±0.00、1.51±0.36、1.56±0.18和1.22±0.26，其中高糖对照组较正常对照组circRNA-SCAF8表达量显著增加（P<0.05），而miR-93-5p过表达组较RNA对照组circRNA-SCAF8的表达量有减少趋势，提示过表达miR-93-5p可抑制上游circRNA-SCAF8的表达。

2.4. miR-93-5p与上下游分子的靶向调控关系

miR-93-5p过表达分子+circRNA 3 ´ UTR野生型组与miR-93-5p过表达分子+circRNA 3 ´ UTR突变型组比较，野生型组荧光值显著低于突变型组（分别为0.69±0.06和1.34±0.12，P<0.01），说明miR-93-5p通过与circRNA-SCAF8的3 ´ UTR区结合下调了circRNA-SCAF8表达，证明circRNA-SCAF8是miR-93-5p的靶基因。同时，FISH结果显示，circRNA-SCAF8和miR-93-5p均位于细胞质中，证明其在细胞中高度关联的空间关系（图7）。

图7. circRNA-SCAF8和miR-93-5p空间位置关系荧光图.

图7

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A：高糖环境下miR-93-5p和circRNA-SCAF8在细胞中的相对位置；B：正常环境下miR-93-5p和circRNA-SCAF8在细胞中的相对位置. 蓝色荧光信号为细胞核，红色荧光信号为miR-93-5p，绿色荧光信号为circRNA-SCAF8. 标尺=1000 μm. DAPI：4´，6-二脒基-2-苯基吲哚；miR：微RNA；circRNA：环状RNA；SCAF：SR相关CTD相关因子.

miR-93-5p过表达分子+TXNIP 3 ´ UTR野生型组与miR-93-5p过表达分子+TXNIP 3 ´ UTR突变型组比较，野生型组荧光值显著低于突变型组（分别为0.58±0.04和1.33±0.04，P<0.01），说明miR-93-5p通过与TXNIP的3 ´ UTR区结合下调了TXNIP表达，证明TXNIP是miR-93-5p的下游分子。同时，qRT-PCR结果显示，miR-93-5p过表达组的TXNIP相对表达量为2.48±0.11，显著低于RNA对照组（4.06±0.99，P<0.01）；miR-93-5p抑制组的TXNIP相对表达量为2.03±0.64，显著高于RNA对照组（1.00±0.00，P<0.05），证明miR-93-5p可以调控TXNIP基因表达。

3. 讨论

细胞焦亡又称细胞炎性坏死，表现为细胞不断胀大直至细胞膜破裂，释放大量促炎性细胞因子进而激活强烈的炎症反应，是一种近期发现的细胞程序性死亡方式［9-10］。细胞焦亡依赖于caspase-1亚族和GSDMD蛋白诱导，NF-κB、NLRP-3、ASC、IL-1β和IL-18等多种效应分子参与，其中GSDMD的切割、IL-1β和IL-18前体的切割成熟和释放是关键信号［11-14］。细胞焦亡广泛参与感染性疾病、神经系统相关疾病和动脉粥样硬化性疾病等的发生发展，是机体重要的天然免疫反应。

糖尿病血管并发症是糖尿病患者最常见的死亡原因。其中高血糖环境诱发血管内皮功能障碍是血管并发症的病理基础，但血管内皮细胞的病变通路尚未完全证实［29-32］。近期研究报道，细胞焦亡可能参与高糖环境导致血管内皮细胞病变，涉及circRNA和竞争性内源RNA等多种分子参与调控［33-35］。

circRNA是一类特殊的内源性环状非编码RNA，广泛存在于各种生物体中。随着circRNA富集和测序技术的进步，检测到的circRNA数不断增加［35］。在数千种circRNA中，仅有很少一部分已知具有特定生物学功能，几乎所有研究都集中在其与miRNA的相互作用上。近年的研究提出了“竞争性内源RNA”假说，该假说认为circRNA分子富含miRNA结合位点，在细胞中可起到调节miRNA的作用，减少了miRNA的表达，可解除miRNA对其靶基因的抑制作用。这一作用机制已被用来阐述包括神经系统、泌尿生殖系统、循环系统在内的多种疾病机制［36］。

已有证明，circRNA-SCAF8与糖尿病和癌症的细胞通路有关［20-21，37］。本研究试图确定circRNA-SCAF8是否在高糖水平影响细胞焦亡的过程中发挥作用。研究显示，circRNA可以通过在竞争性内源RNA网络中充当富集体来影响miRNA表达［38］。例如，circITCH作为miR-330-5p的富集体，可以上调SIRT6、存活蛋白和SERCA2a表达，从而缓解阿霉素诱导的心肌细胞功能障碍［39］。本研究也假设circRNA-SCAF8是miR-93-5p的富集体，实验结果支持该假设。在两者表达相关性方面，当circRNA-SCAF8受抑制时，miR-93-5p的表达增加；而当circRNA-SCAF8在高糖环境中过表达时，miR-93-5p的表达减少。同时双荧光素酶实验进一步证实了两者在翻译表达过程中的关联性。通过FISH发现了两者在细胞质中有高度相关的空间位置。因此认为circRNA-SCAF8作为上游分子调控miR-93-5p的表达。miR-93-5p已知参与了癌症、动脉硬化、糖尿病、骨疾病等相关致病通路的调节［22-26］。因此，本研究通过合成miRNA过表达分子使其过表达，并检测其下游分子，发现TXNIP与其有着高度关联性，TXNIP与miR-93-5p的表达呈强负相关。最后，通过设计反向实验，分别使用circRNA抑制分子和miRNA抑制剂来抑制circRNA-SCAF8和miR-93-5p的表达，检测TXNIP的表达量，进一步验证了circRNA-SCAF8/miR-93-5p/TXNIP轴的因果性和连贯性。

TXNIP是α-抑制素蛋白家族的成员，通过与硫氧还蛋白结合而抑制其抗氧化功能，诱发内质网和线粒体应激，最终可导致炎症或细胞凋亡，在糖尿病、癌症和心血管疾病等多种疾病的发生、发展过程中起重要的调控作用［40］。近期报道称TXNIP亦可介导焦亡过程［41-42］。本文资料显示，TXNIP的表达与circRNA-SCAF8、miR-93-5p高度关联，cirRNA-SCAF8上调与miR-93-5p下调都可使TXNIP显著升高，而TXNIP升高会造成血管上皮细胞整体存活率下降、细胞凋亡率上升，与TXNIP在其他细胞中的作用相似［4，7，27］。

综上所述，本研究通过细胞实验初步证实circRNA-SCAF8在高糖环境下通过miR-93-5p/TXNIP通路促进焦亡，提示该信号通路可能可以作为糖尿病血管疾病的治疗靶点。

Acknowledgments

研究得到浙江省医药卫生科技计划（2020RC008）、国家自然科学基金（81970694，82002926，82271336）、浙江省自然科学基金（LQ21H070001，Y23H020027）、衢州市重点科技攻关项目（2022K49）支持

Acknowledgments

This paper was supported by the Medical Science and Technology Project of Zhejiang Province (2020RC008), National Natural Science Foundation of China (81970694, 82002926, 82271336), Natural Science Foundation of Zhejiang Province (LQ21H070001,Y23H020027), Key Science and Technology Project of Quzhou City (2022K49)

［缩略语］

胱天蛋白酶（cysteine aspartic acid specific protease，caspase）；NOD样受体家族蛋白（NOD like receptor protein，NLRP）；凋亡相关斑点样蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD，ASC）；Gasdermin D蛋白（Gasdermin D，GSDMD）；环状RNA（circular RNA，circRNA）；SR相关CTD相关因子（SR-related CTD associated factor，SCAF）；微RNA（microRNA，miRNA，miR）；信使RNA（me-ssenger RNA，mRNA）；硫氧还蛋白相互作用蛋白（thioredoxin interacting proteins，TXNIP）；人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cell，HUVEC）；细胞计数试剂盒（cell counting kit，CCK）；异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）；放射免疫沉淀法（radioimmunoprecipitation assay，RIPA）；荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization,FISH）；辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）；酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）；甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）；小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）；定量逆转录聚合酶链反应（quantitative reverse transcription polymerase chain reaction，qRT-PCR）；磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline,PBS）；T细胞激活性低分泌因子（reduced upon activation，normal T cell expressed and secreted factor，RANTES）；沉默信息调节因子（silence information regulator，SIRT）；肌质网/内质网钙ATP酶（sarcoplasmic/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase，SERCA）

利益冲突声明

所有作者均声明不存在利益冲突

Conflict of Interests

The authors declare that there is no conflict of interests

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