头颈部鳞状细胞癌与微生物关系的研究进展

Abstract

微生物是影响人类健康平衡的重要因素之一，它们与许多肿瘤的关系已经得到证实。然而微生物与头颈部鳞状细胞癌(head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC)之间的关系尚不清楚，微生物对HNSCC发病率和预后的影响不容忽视。因此本文系统而全面地综述了HNSCC与相关微生物微生态失调的流行病学研究，并探讨它们之间的关系。

全球每年至少新增65万例头颈部肿瘤的患者，并且每年有35万例患者因该类疾病而死亡。头颈部鳞状细胞癌(head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC)约占此类病例的90%，导致了患者生活质量的严重下降及高达66%的5年死亡率^[1]。迫切需要发现有效预防HNSCC的新方法，以补充在烟草、酒精和人类乳头瘤病毒方面努力^[2]。

人体含有大量微生物，主要分布在消化道、呼吸道、皮肤和生殖道^[3]。此外，人体微生物群也被称为隐形器官，携带的遗传信息是人类基因组的150多倍^[4]。这些微生物可以与宿主交换能量，传递信息，通过对宿主提供营养、免疫、生长刺激和生物拮抗，对人类健康起着至关重要的作用^[5]。

1. HNSCC与微生物的关系

1.1. 喉鳞状细胞癌与微生物的关系

喉鳞状细胞癌(laryngeal squamous cell cancer，LSCC)占所有头颈部癌症的1/3，总体5年生存率约为60.7%^[1]。其治疗主要包括手术、放疗、化疗和生物制剂^[6]。吸烟和饮酒大大增加了这类癌症的患病风险，然而其他因素的参与，如遗传学、营养学、生活方式和局部微生物生态学条件，仍不确定。

Hayes等^[7]研究了129例HNSCC患者的漱口水样本，发现棒状杆菌属、金氏菌属、奈瑟菌属、嗜生物菌属、嗜二氧化碳噬细胞菌、脱氮金氏菌和血链球菌属与喉癌的风险降低相关。与此同时，Gong等^[8]运用16Sr RNA基因测序对LSCC患者的癌组织样本和声带息肉患者的组织样本进行比较，结果发现链球菌、梭杆菌和普氏菌为喉部最占优势的三个属。同时发现LSCC患者喉部梭杆菌和普雷沃氏菌的相对丰度增加，而链球菌的相对丰度降低。此外，在LSCC患者转移的淋巴结组织中，梭杆菌呈高丰度，链球菌呈低丰度^[9]。在此基础上，Dong等^[10]进行补充研究，认为大肠志贺氏杆菌属和双歧杆菌属在肿瘤组织和肿瘤临近正常组织样本中的丰度低于对照样本。然而，上述研究均未考虑临床风险因素，因此Hsueh等^[11]最新研究对此方面进行补充，发现饮酒、吸烟指数与奇异菌属、普氏菌属和梭菌属的数量呈正相关。

由于肿瘤部位与肿瘤侵犯深度T分期密切相关，Wang等^[12]根据肿瘤部位将121份HNSCC样本分为口腔/口咽组与下咽/喉组，在下咽/喉组中，发现低T期患者放线菌属增加，微小微单胞菌属无显著变化，在口腔/口咽组中，发现低T期患者放线菌属更显著，而微小微单胞菌属下降。Chen等^[13]研究显示拟杆菌门、胃链球菌的水平与肿瘤T分期及肿瘤大小呈正相关，而梭杆菌、罗氏菌、微小微单胞菌属和放线菌与肿瘤的T分期呈负相关。

幽门螺杆菌群也分布在喉部黏膜生态位中，虽然差异无统计学意义，但幽门螺杆菌在喉癌患者中发现的频率高于对照组^[8]，与Gong等^[14]研究结果相似。幽门螺杆菌招募T淋巴细胞并诱导细胞因子和趋化因子的释放，通过进一步促进炎症反应破坏上皮屏障功能，影响特定群落的过度生长或消失。此外，幽门螺杆菌可以降低mutS同源物2和MLH1的表达^[15]。

未来的研究需要证明宿主癌症微环境是否支持微生物群落的改变，以及从分子机制的角度研究特定微生物群落的影响，从而对LSCC进行有效防治。

1.2. 口腔鳞状细胞癌与微生物的关系

口腔肿瘤是最常见的恶性肿瘤之一，主要病因是烟草和饮酒的协同效应^[16]。然而，越来越多的证据表明，口腔微生物群通过直接代谢致癌物和炎症效应在口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)中发挥作用。

由于对OSCC研究的结果较广泛，本综述只呈现差异有统计学意义的结果。Zhou等^[17]研究发现与来自同一患者的癌旁组织比较，OSCC中的放线菌门和蓝藻菌门丰度降低。Takahashi等^[18]对细菌群的研究显示，癌症组消化链球菌属、梭杆菌、拟普雷沃氏菌属和嗜二氧化碳嗜细胞菌的丰度增加，而罗氏菌和嗜血杆菌属的丰度减少。这些属从健康对照到癌前病变呈增加趋势，在OSCC中水平最高。此外，Perera等^[19]、Su等^[20]研究发现OSCC中梭杆菌富集而链球菌丢失，并认为链球菌属、梭杆菌属、消化链球菌属、弯曲杆菌属、肺炎链球菌属和具核梭杆菌属(菌株CTI-2)可能是癌症患者的潜在生物标志物。Peters等^[21]发现，口腔癌唾液样本中明显富含阴道菌群的共生物种，包括约氏乳杆菌(对照组唾液高710倍)和阴道乳杆菌(对照组唾液高52倍)，而这些物种在人类微生物组项目的正常唾液中并未发现。Sarkar等^[22]研究证明HPV-16与口腔癌发展显著相关，Guerrero-Preston等^[23]对口腔癌和口腔正常上皮、口腔HPV阳性患者的上皮唾液DNA中的微生物群落进行了横断面比较，发现肿瘤中乳酸菌、链球菌、葡萄球菌和微单胞菌显著富集，而嗜血杆菌、奈瑟菌、双菌科和放线杆菌在对照组中更丰富，同时在HPV阳性样本中发现了某些乳酸杆菌和威氏菌科，在HPV阴性肿瘤中发现大量的埃克氏菌、奈瑟氏菌和钩端毛菌。

Chen等^[13]研究显示口腔微生物群可能参与决定OSCC的分期。如OSCC患者在肿瘤发展从1期到4期的过程中梭菌增加，而放线菌门和拟杆菌门减少^[24]。Neuzillet等^[25]报道了具核梭杆菌与OSCC的T分期呈负相关，而在具核梭杆菌高丰度的肿瘤中，toll样受体4和m2-巨噬细胞的募集显著减少。此外，Sarkar等^[22]研究显示OSCC具核梭杆菌阳性患者的无复发和无转移生存期比阴性患者更长，且具核梭杆菌的丰度与3年生存率和无复发生存期呈正相关，与吸烟、肿瘤分期、复发率呈负相关。最近，Granato等^[26]证实，唾液中嗜麦芽寡养单胞菌、葡萄球菌、百足菌属、硒单胞菌、异氯杆菌和不动杆菌的丰度与OSCC患者的总生存率呈负相关，而韦荣球菌属丰度与临床肿瘤大小和临床分期呈负相关，高丰度提示了OSCC患者的预后较好。在针对HNSCC所有部位的研究中，奈瑟菌、嗜血杆菌和罗氏菌与癌症特异性生存率呈正相关^[23]。然而，Ganly等^[27]发现微生物与肿瘤分期或转移之间无关联。

此外，Wang等^[28]研究发现口腔微生物群的结构、多样性和功能的改变与OSCC的既定危险因素有关，特别是在完全脱落牙齿后，可能是由于严重的生态破坏和栖息地的丧失。一项队列研究发现原发肿瘤切除到肿瘤复发之间的持续时间与唾液链球菌反应性和血管链球菌反应性CD8 T细胞的频率呈正相关。因此，链球菌反应性CD8 T细胞反应可能有助于OSCC患者的抗肿瘤免疫^[29]。

目前面临受刺激或未受刺激的唾液、拭子或组织样本是否会是分析癌症患者口腔微生物群最可靠的方法，以后应对此进一步探索。口腔癌前病变的随访主要基于病变的临床表现，必要时进行手术活检，因此，获取唾液来跟踪微生物群的变化可以为临床医生提供一种简单、无创的方法来早期诊断OSCC。

1.3. 鼻咽鳞状细胞癌与微生物的关系

鼻咽肿瘤是鼻咽部上皮细胞中的肿瘤，在中国南部、东南亚和北非流行，多发生于40~60岁患者。由于鼻咽癌对放疗比较敏感，因此目前的主要治疗方式仍是放疗^[30]。EB病毒(Epstein-Barr，EBV)是一种伽马疱疹病毒，是第一个与癌症有关的人类病毒，被证明与鼻咽癌相关^[31]。

Debelius等^[32]通过对499例鼻咽癌患者进行16Sr RNA测序，发现鼻咽癌患者的总体微生物多样性低于健康对照组。他们还发现了一对颗粒状脂肪扩增子序列变异与鼻咽癌状态密切相关。此外，Ueda等^[33]研究发现EBV和A族乙型溶血性链球菌(group A streptococcus，GAS)存在同一个个体中较常见。与未被GAS定植的EBV携带者比较，被GAS定植的EBV携带者的唾液中脱落了更多的EBV颗粒。此外，在GAS定植的EBV携带者的组织中，主裂解调控EBV基因BZLF1的信使RNA水平比未定植的EBV携带者更频繁。通过加热失活的GAS模拟GAS定植，发现其通过toll样受体2触发诱导潜伏感染的淋巴母细胞系裂解EBV，纯化的GAS肽聚糖也是如此。因此，GAS的定植可能通过增加唾液中的EBV负荷来协助EBV，从而提高EBV扩散到其他宿主的可能性。

1.4. 下咽癌与微生物的关系

下咽癌的死亡率最高，预后最差，淋巴结转移和远处转移率最高。因此，需要进行研究来检测早期预防和诊断的特异性生物标志物。

Panda等^[34]研究发现口咽癌和下咽癌患者唾液中副嗜血杆菌、流感嗜血杆菌和普雷沃氏菌呈高丰度，而黏膜罗氏菌、双线杆菌、两异韦荣球菌、南科氏普雷沃氏菌、空气罗氏菌、黄褐二氧化碳嗜纤维菌、棒状奈瑟菌、黑氏普雷沃氏菌、有害月形单胞菌呈现低丰度。推测是微生物及其代谢物，通过上皮细胞诱导上皮细胞DNA损伤，并激活肿瘤细胞toll样受体直接影响肿瘤生长，此外，链球菌通过产生短链有机酸诱导肿瘤的酸性和缺氧微环境。

2. 微生物影响癌症机制

微生物群对癌症的影响已被充分研究，主要分为3种类型：①微生物通过毒素介导的基因突变引起癌症，尤其是大肠杆菌素、细胞致死性扩张毒素、直接脱氧核糖核酸酶、脆弱拟杆菌毒素、活性氧在结直肠癌、头颈部癌、泌尿系统癌中对基因突变的作用^[35-36]。这些微生物产生的毒力可以通过e-钙黏蛋白信号通路和b-连环蛋白信号传导通路促进癌症的发展，如来自核粘杆菌的黏附素FadA和来自沙门氏菌属的毒素AvrA^[37-38]。②微生物本身没有致癌作用，但是可以协同其他因素产生致癌作用，主要包括具有免疫调节功能的微生物群和其在癌症发展过程中产生的生物活性代谢物^[39]。虽然免疫系统很少引起早期病变，但是当炎症或者免疫监测功能失调时，微生物可以通过肿瘤间质反馈回路促进病情进展。如常见的p53突变只有在微生物产生没食子酸的情况下才能致癌^[39]，否则在肠道、体内和类器官中都具有保护作用。③微生物失调可以减弱抗癌代谢物的产生，如减少铁载体非核糖体肽、单萜生物的合成^[20]。

在HNSCC中，M2巨噬细胞水平的升高提示患者预后较差^[40]。然而，最新研究显示具核梭杆菌的丰度与M2-巨噬细胞募集及肿瘤侵犯深度呈负相关^[41]。此外，口腔微生物的失调通过抑制免疫反应、合成强效诱变剂(如乙醛)和介导慢性炎症来促进癌症的发展，例如牙周炎与口腔癌发病率的增加、生存率的降低相关，以及某些口腔潜在恶性病变(oral potential malignant disorders，OPMDs)与微生物的失调相关^[42]。与此同时Yang等^[43]研究发现较高水平的放线菌门与TP53的突变相关，而厚壁菌门与Wnt通路相关的关键驱动基因(FAT1、FZR1和AXIN1)的反复突变相关。然而，口腔微生物群在癌症中作用的研究结论并不一致，Li等^[44]也有研究显示口腔微生物群通过促进致癌物的灭活而产生抗肿瘤的作用，如某些细菌外膜的小囊泡有免疫调节作用而被建议作为癌症的新型治疗药物。因此进行功能水平的研究十分必要，Zielińska等^[45]研究发现唾液中高浓度的IL-17A、IL-17F和TNF-α与疾病进展显著相关，较低水平的IL-17A与口腔有氧细菌定植有关，然而，在口腔拭子有氧菌培养阳性的患者中观察到较高浓度的TNF-α。这些成分的变化有可能构成一种生物标志物，以帮助监测口腔从癌前病变到癌症的转变。

今后的研究方向是需要确定非细菌性微生物的功能以及和癌症之间的关系，特别是与已知细菌功能相关的。此外，还需要进一步促进学科之间的合作，利用DNA的提取、样本处理、生物信息数据的处理等技术探究定量微生物群对癌症的影响。

3. 微生物检测方法为宏基因组测序和16Sr RNA基因测序

微生物基因组测序的金标准是培养特异性菌株和提取DNA序列^[46]。获得高质量的微生物基因组DNA是在复杂微生物群落中进行宏基因组学研究的基础和困难，它结合了从微生物群落中直接提取DNA和每个微生物基因组序列的硅质重建。在宏基因组方法中，基因组重建分2个步骤进行：①将片段基因组序列组装成连续序列；②组装成谱系作为基因库，最先进的结合剂依赖于核苷酸组成信息，如四核苷酸频率、GC含量或序列覆盖物^[47]。

近年来，16Sr RNA基因测序等非培养方法因其独特的优势在微生物学领域得到了广泛的应用。16Sr RNA基因是原核生物核糖体RNA的一个亚基，存在于细菌中，但不存在于真菌和病毒中。16Sr RNA基因序列由保守区域和可变区域组成，其中保守区域揭示生物物种之间的关系，而可变区域反映生物特异性核酸序列^[48]。作为细菌分子鉴定的基础，16Sr RNA基因测序已被广泛用于HNSCC与微生物群落的关系的研究中。

4. 结论和展望

本文总结了几种主要的HNSCC微生物失调相关的流行病学研究，并讨论了它们之间的差异，表明与微生物相关的炎症变化是HNSCC的一个重要作用。同样，细菌的变化也可能是对恶性肿瘤引起的头颈部环境变化的反应。关于HNSCC与微生物相关的证据越来越多，但种族、饮食模式、生活习惯、地理环境等因素在这些研究中很少被考虑。比较同一患者的健康组织虽有价值，但来自健康患者相同解剖部位的对比数据也是必要的。因此，肿瘤内的样本部位、对照组的取材、样本的大小和样本在处理过程中是否被污染，这些都需要进一步考虑，也是将来需要深入研究的方向。

Funding Statement

山西医科大学博士启动基金资助项目(No：03201628)；山西省基础研究计划自然科学基金(No：20210302123250)；山西医科大学第一医院136专项经费科研项目