促进前交叉韧带重建术后移植肌腱愈合的生物活性策略研究进展

Abstract

目的

对促进前交叉韧带重建术（anterior cruciate ligament reconstruction，ACLR）术后移植肌腱愈合的生物活性策略进行综述，以期为提升ACLR疗效提供参考。

方法

广泛查阅国内外促进ACLR术后移植肌腱愈合的生物活性策略相关文献，并进行归纳和总结。

结果

目前，与ACLR术后移植肌腱愈合相关的生物活性材料主要有以下几类：生长因子、细胞、可降解植入物/组织衍生物。通过构建模拟原生前交叉韧带（anterior cruciate ligament，ACL）生长所需基质、环境及调控因素的复杂界面，在不同层面调控移植肌腱植入后的生长，从而促进移植肌腱愈合。尽管多数研究中ACLR疗效已得到了显著提升，但大部分仍局限于早期动物实验阶段，离真正临床推广仍有较远距离。此外，受限于当下制备技术，对界面的仿生仍多停留于微米、毫米级，并且偏向于形态学仿生，在信号机制通路上的研究依旧不足。

结论

随着对ACL解剖学、发育学研究的深入及制备技术的改进，促进ACLR术后移植肌腱愈合的生物活性策略研究有望得到进一步提升。

据统计，全球每年有超过40万人因前交叉韧带（anterior cruciate ligament，ACL）损伤需要接受治疗^[1]。研究表明，大多数ACL损伤是由非接触性运动损伤造成^[2]。ACL损伤可破坏膝关节前向稳定性，进而导致半月板损伤、关节退变加速^[3]，保守治疗通常无效，需要进行修复重建手术等更为积极的策略来恢复韧带功能，以重建膝关节稳定性^[4]。在我国，每年有约10万人需要通过ACL重建术（ACL reconstruction，ACLR）恢复膝关节运动功能，手术体量仅次于美国，已列居全球第二^[5]。目前，尚无研究能够完全阐明ACLR的最佳时机^[6]。

随着微创技术的发展以及微创理念深入人心，在关节镜下通过移植肌腱替代撕裂ACL的ACLR成为最主流术式^[7]。然而行ACLR需要考虑的因素极为复杂，单束或双束重建、移植肌腱选择、移植肌腱固定方式、骨隧道定位等都是长期争论的焦点^[8]。因此，部分研究不再局限于临床术式或康复手段来促进ACLR术后愈合，转而进入生物医学领域深耕以改善术后效果。目前，与ACLR术后移植肌腱愈合相关的生物活性材料主要可归为以下几类：生长因子、细胞、可降解植入物/组织衍生物^[9]。相关生物材料策略的开发往往更注重于ACLR术后愈合进程关键机制的靶点及信号通路调控^[10]。

基于此，本文将对促进ACLR术后移植肌腱愈合的生物活性策略及其信号通路和分子机制的相关研究进展作一综述，以期为提升ACLR疗效提供参考。

1. 原生ACL形成及ACLR术后愈合

1.1. 原生ACL形成的生理进程

大量研究表明，原生ACL主要成分是水，在干燥情况下，超过70%的组成成分为胶原纤维蛋白^[11]。低血管性、低神经性、低细胞性是其自我再生能力弱的主要原因^[12]。在原生ACL形成过程中，细胞和分子生物学机制发挥着重要作用。研究表明EGF和TGF-β等信号通路可以促进原生ACL的发育^[13-14]。EGF通过促进细胞增殖和分化促进ACL形成；而TGF-β则可以促进肌腱细胞的增殖和分化，从而进一步促进ACL的发育。此外，其他信号通路如Wnt和BMP等也与ACL的发育相关^[15]。

另一个影响原生ACL形成的因素是基因表达调节。在原生ACL发育过程中，基因调节对于维持组织结构和机能至关重要。如Sox9通过调节胶原蛋白和蛋白聚糖等基质成分的合成和分解，影响ACL的结构和机能^[16]。具体来说，Sox9能够激活基质合成相关基因的表达，如Ⅰ型胶原、Ⅻ型胶原、ⅩⅢ 型胶原、蛋白聚糖、弹性蛋白和凝血酶原等^[17]。另外，Sox9还能抑制基质降解相关基因的表达，如基质金属蛋白酶13和ADAMTS-5等^[18]。这些调节作用能够促进原生ACL细胞增殖和分化，同时维持基质的稳定性和机能。

除了信号通路和基因调节，细胞增殖和分化也对原生ACL的形成起着关键作用。在原生ACL的发育过程中，成纤维细胞和干细胞可以分化为肌腱细胞，从而促进原生ACL的形成^[19]。此外，细胞外基质（extracellular matrix，ECM）在原生ACL形成中也起着重要作用。一些研究表明，ECM的刚度和构成也与原生ACL的发育和损伤有关^[20]。

1.2. ACLR术后移植肌腱愈合的生理进程

研究表明，ACL的愈合过程和ACL发育之间存在密切关系^[21-22]。ACLR术后移植肌腱的愈合过程主要包括炎症反应、细胞增殖和分化、基质合成和重塑等阶段^[23]。组织内炎症细胞、成纤维细胞、软骨细胞等被激活，开始进行增殖、分化和迁移，形成新的基质组织^[17]。这一过程与ACL发育时的细胞增殖、分化和基质合成过程有相似之处，表明ACLR术后移植肌腱的愈合过程是在ACL发育过程的基础上进行的。此外，愈合过程中的细胞和基质合成过程与ACL发育时的细胞和基质合成过程也有一定关联。例如，愈合过程中的成纤维细胞和软骨细胞能够合成和分泌胶原蛋白、蛋白聚糖等ACL组织的主要成分，这些成分在ACL发育过程中也同样由ACL细胞合成和分泌^[24]。因此，愈合过程中的细胞和基质合成过程可以看作是ACL发育过程的一种延续和补充。

需要注意的是，移植肌腱愈合过程和ACL发育过程并非完全相同，某些方面存在的差异可能造成ACLR术后愈合不良。首先，移植肌腱中的细胞类型（如脂肪细胞、骨细胞等）和基质成分可能与原生ACL组织存在差异，对移植肌腱的基质合成和愈合过程可能产生一定影响^[25–27]。其次，ACLR术后移植肌腱需要与ACL残端愈合，并在ACL残端附近采用锚钉或其他方式固定，这些固定方式可能会对移植肌腱和ACL残端之间的力学特性产生影响^[28]。例如，在移植肌腱和ACL残端之间形成的结合界面可能存在不连续和不规则结构，这些结构可能会影响移植肌腱和ACL残端之间的力学传递及负荷分配^[29]。再者，移植肌腱和原生ACL组织之间的愈合过程可能存在一些特殊的调节机制和信号通路。例如，ACLR术后移植肌腱和ACL残端之间的愈合过程也可能受到炎症反应的影响^[30]，炎症反应通过激活炎症细胞、介导细胞因子、调节基质合成等方式促进愈合过程，但过度的炎症反应也可能导致组织损伤和瘢痕形成^[31]。

2. 生长因子促进ACLR术后移植肌腱愈合的策略

有望应用于ACLR的生长因子种类繁多，如BMP、EGF、TGF-β、VEGF、粒细胞集落刺激因子、bFGF、肝细胞生长因子、护骨素、富血小板血浆（platelet-rich plasma，PRP）、血小板衍生生长因子BB（platelet-derived growth factor BB, PDGF-BB）、Runt相关转录因子2、纤维蛋白凝块以及自体条件性血清等^[9，32-33]。生长因子对于愈合过程中的细胞募集、增殖、分化以及ECM合成至关重要。然而，生长因子需要合适载体才能发挥更好作用。

一般来说，不同生长因子之间的功能、靶点、最佳作用时机并不相同。研究表明^[34]，多种生长因子递送相较单一生长因子递送能够产生更佳修复效果。此外，生长因子的调控需要一定时间持续有效的刺激。故而构建生长因子促进ACLR术后愈合的策略需要考虑到生长因子的组合形式、递送载体、释放体系等。在这种情况下，生长因子常与水凝胶、纤维蛋白胶、纳米颗粒、纳米纤维等组合成体系的形式进行作用，以适应组织再生所需要的地形线索。Phillips等^[35]将表达Runt相关转录因子2的逆转录病毒载体偶联到胶原支架上，与成纤维细胞共培养并成功上调其成骨基因表达。Madhurakkat Perikamana等^[36]通过聚多巴胺将PDGF-BB以化学键和的形式结合到纳米纤维上，诱导脂肪来源干细胞成肌腱分化，从而实现移植肌腱-骨组织复杂界面的仿生。Wang等^[37]通过制备高分子聚合物支架并在其上接枝生长转化因子7（growth and differentiation factor 7，GDF-7）实现持续诱导组织再生，促进肩袖组织再生。

因此，研究者需依据组织再生所需的地形线索进行合理设计，尽可能实现多种生长因子有合理的空间分布，这对于组织再生尤其是复杂界面再生至关重要。Chen等^[38]通过胶原蛋白结合肽结合BMP-2、TGF-β₃或GDF-7，并将其特异性地接枝至“书形”脱细胞附着点基质，从而制备具有地形线索的仿生支架。Zhu等^[39]将TGF-β、IGF-1、甲状旁腺激素进行整合，从而制备具有矿化及抗炎效应的生长因子新体系。

为了实现生长因子在ACLR中的有效递送，需要考虑到生长因子的稳定性、释放动力学、剂量效应、协同作用等因素。一种常用方法是将生长因子与载体材料结合，形成复合支架或凝胶，以保护生长因子免受降解，延缓其释放速率，增加局部浓度，提高生物活性。载体材料可以是天然或合成的高分子材料，也可以是无机或金属材料，甚至可以是细胞或基因载体。载体材料应具有良好的生物相容性、力学性能、降解性能、孔隙结构等特性，以适应ACLR的需求^[40]。目前已有许多研究报道了不同类型载体材料与生长因子组合的应用。Lyu等^[41]报道了一种利用微流控芯片产生生长因子梯度的方法，将BMP-2和TGF-β分别包裹在聚乳酸和明胶微球中，然后与去细胞化肌腱支架复合形成三层结构，用于肌腱-骨界面的愈合。该方法能够引导BMSCs和肌腱干细胞在不同区域分化为骨细胞、软骨细胞和肌腱细胞，并重建移植肌腱-骨组织的梯度结构。

除了生长因子与载体材料的组合外，还有一些其他策略也被用于ACLR中。基因治疗是一种利用基因载体将生长因子的基因转染到目标细胞或组织中，从而实现持续和高效生长因子表达的方法。基因治疗可以避免生长因子外源性递送带来的不稳定性、高成本、剂量控制等问题，同时也可以利用细胞自身调控机制，实现生长因子的时空特异性表达^[42]。Murray 等^[43]将BMP-2的逆转录病毒载体注射到ACL切断处，并使用桥接增强支架填充切口，从而实现了ACL自身修复，并在体内实验中表现出与ACLR相当的效果。

综上，生长因子是一类能够刺激细胞增殖、分化和迁移的蛋白质，对于组织修复和再生有重要作用。ACLR中应用生长因子可以促进移植物与骨隧道早期愈合，加快新生血管形成，提高移植物抗张强度和刚度，减少移植物萎缩和退化；还可改善关节软骨、半月板和滑膜修复，抑制炎症反应，延缓或防止术后退行性关节炎发生。但生长因子通常具有较低稳定性和较短半衰期，容易受到环境因素和蛋白酶影响而失活或降解；且生长因子往往难以有效到达目标细胞或组织，导致使用剂量大但生物利用度低。

3. 细胞促进ACLR术后移植肌腱愈合的策略

近年来，随着对干细胞研究的深入，大量研究表明干细胞的自我更新及多向分化潜能可应用于组织再生，并显示出广阔应用前景。目前已报道的应用于ACLR的干细胞有BMSCs、滑膜来源MSCs（synovial MSCs，SMSTs）及ACL来源MSCs（ACL MSCs，AMSCs）^[44]。

3.1. BMSCs

BMSCs作为多能MSCs，在其增殖过程中具有分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞的潜力。BMSCs可以通过旁分泌作用促进移植肌腱血管化、成熟和功能恢复。Yu等^[45]通过BMSCs来源外泌体（BMSCs-exosomes，BMSCs-exos）的旁分泌信号传导作用促进肌腱干/祖细胞的增殖和迁移。BMSCs还可以通过直接分化作用参与移植肌腱的重建和修复，增加其力学强度和弹性^[46]。Lim等^[47]的研究显示，与空白腘绳肌腱相比，通过BMSCs修饰腘绳肌腱行ACLR在止点处显示出更为成熟的纤维软骨分化。此外有研究表明，BMSCs可以通过免疫调节作用抑制炎症反应和免疫排斥反应，减少移植肌腱的退化和坏死。Shi等^48]的研究显示BMSCs-exos可以通过增加移植肌腱-骨组织愈合过程中M2型巨噬细胞极化来促进纤维软骨形成，从而改善生物力学性能。单纯BMSCs的潜力似乎存在局限性，而使用基因转染技术有望增强BMSCs分化能力和骨再生能力。Dong等^[49]通过载荷BMP-2慢病毒转染BMSCs，从而提升了移植肌腱-骨组织结合处的骨整合能力，进而提升手术疗效。Li等^[50]通过PDGF-BB转染BMSCs，加速移植肌腱重塑，促进血管生成和胶原沉积，进而提升ACLR疗效。

3.2. SMSTs

SMSTs可能来自骨髓、血液、滑膜细胞、血管周细胞或胚胎关节间区等不同组织。在ACLR相关研究中，Ju等^[51]在大鼠模型上使用骨-髌骨-骨肌腱重建ACL，将SMSTs植入移植肌腱和骨隧道的界面处，结果显示SMSTs能够加速移植肌腱-骨组织界面的早期重塑，表明SMSTs可能通过分化为成纤维细胞和分泌促进胶原纤维合成的细胞因子来促进移植肌腱-骨组织愈合。

尽管SMSTs显示出优异的应用潜能，但不同来源的SMSTs功能特征差异较大。Mochizuki等^[52]的研究表明与来自皮下脂肪的SMSTs相比，来自纤维滑膜和脂肪滑膜的SMSTs表达更高水平的STRO-1（MSCs蛋白质标志物的基因）和CD106，而CD10水平较低。Mizuno等^[53]将滑膜分为3个区域，并比较了从3个区域分离的SMSTs在增殖、表面标记物表达、软骨分化、钙化和脂肪分化方面的差异，发现外周血管区域的SMSTs具有最高增殖和软骨分化潜能，而表面和基质区域的SMSTs则具有相似但较低的潜能。目前尚无研究报道SMSTs的细胞特异表面标志物或转录因子，以区分不同来源SMSTs之间的分化潜能，距SMSTs临床应用仍有较大突破空间。

3.3. AMSCs

AMSCs来源于ACL并具有促进移植肌腱修复和再生的能力。Steinert等^[54]发现从损伤ACL中迁移的细胞具有MSCs的特征，能够分化为多种组织细胞，并且在体外能够形成类似韧带的结构；此外还发现ACL中本身就存在大量MSCs，它们可能参与韧带的生理功能和修复过程。Matsumoto等^[55]的研究表明，ACL中存在CD34和CD146表达阳性血管细胞，它们具有多向分化潜能，并且在ACL损伤后被招募到断裂部位参与ACL的自身修复。然而部分研究显示，AMSCs的愈合潜力可能与患者年龄及伤后时间相关。Nakano等^[56]的研究将不与年龄患者的ACL来源CD39⁺ 细胞注入大鼠ACLR模型中，发现年轻患者来源的细胞具有更佳骨整合能力。而Inokuchi等^[57]的研究表明，从受伤时间>3个月及<3个月的患者分别收集ACL衍生的CD34⁺干细胞，发现受伤时间<3个月患者ACL衍生的CD34⁺ 干细胞具有更高的肌腱-骨愈合潜力。此外，同BMSCs相关研究相似，部分研究对AMSCs进行修饰以拓展其促进组织再生能力。Kawakami等^[58]通过BMP-2转染AMSCs后，以细胞片形式应用于大鼠ACLR，能加速及改善移植肌腱成熟及骨整合。

3.4. 小结

干细胞具有自我更新和多向分化能力，并且来源广泛，获取方式相对简单和安全，在组织再生领域具有广阔应用前景。通过旁分泌作用、直接分化作用和免疫调节作用等作用机制，干细胞能够增强移植肌腱的血管化、成熟和功能恢复。通过基因转染技术或与其他生物材料的结合等，能进一步提高干细胞分化能力和再生能力，是促进ACLR疗效的潜在优势对象。

4. 可降解植入物促进ACLR术后移植肌腱愈合的策略

近年来，界面组织工程技术飞速发展，其深入探究了软组织重建修复机制，为借助先进生物材料打造仿生支架模拟原生组织结构再生所需微环境，最终实现原位再生类似天然组织结构并获得相应生物学特性提供了可能^[59]。选择安全可靠、具有一定机械强度的材料打造基底支架，并对其进行修饰，利用不同生物材料的特性，在不同层次调控移植肌腱与骨隧道之间的梯度分化以及移植肌腱中央实质部的韧带化，是构建积极影响ACLR远期疗效的潜在有效手段。理想的可应用于支架构建的生物活性材料应满足生物力学及生物相容性相应要求。胶原、丝素蛋白、壳聚糖、海藻酸钠、透明质酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物 ［poly（lactic-co-glycolic acid），PLGA）］、聚（脱氨基酪氨酰酪氨酸十二烷基酯）［poly（desaminotyrosyl-tyrosine dodecyl dodecanedioate），P（DTD DD）］、聚乙醇酸（polyglycolic acid，PGA）、 聚二氧嘧啶酮（polydioxanone，PDS）、聚左乳酸（poly L-lactic acid，PLLA）等材料相继被研究报道^[56，60]。

由于原生ACL基质的主要成分是Ⅰ型胶原^[61]，多种胶原基质物被尝试用于支架构建。胶原支架的力学性能不及原生组织，并且随时间推移其力学强度明显下降^[62]。故交联剂如甲醛、羧二亚胺等被相继开发用于延缓支架降解，但交联剂可能存在生理毒性^[63]。基于此，胶原-血小板复合材料、双相胶原复合材料、胶原蛋白-丝素蛋白复合材料等被开发，在保有胶原支架原有特性的同时，进一步提升支架的生物力学性能^[64-66]。

另一种天然聚合物丝素蛋白^[67]可从家蚕丝获取；家蚕丝主要由丝素蛋白及丝胶组成，其表面的丝胶会引起机体免疫反应，需通过加工去除^[68]。丝素蛋白在保持天然聚合物优异的生物相容性和降解性能同时，还拥有优秀的机械性能^[69]。然而其细胞募集性能较差。基于此，最常见的改性策略是通过化学改性方式调整丝素蛋白的物理化学性质或者引入活性基团，从而产生新的材料性能^[70]。具体而言，可以利用点击化学^[71]、双酪氨酸交联^[72]、超分子交联^[73]等方法，对丝素蛋白的羟基、羧基、氨基和硫醇基等不同官能团进行修饰^[68]。在生物材料与组织工程领域，除了上述改性策略，还可通过增材定制方式制备具有复杂结构的支架，满足组织的特异性需求^[74-75]。也有研究通过对蚕丝改性，实现药物可控的输出及释放^[73]。上述方案在赋能蚕丝以更优生物学性能同时，为复杂界面组织工程支架的构建提供了灵感及广泛的备选基础。

合成材料方面，PLGA、P（DTD DD）、PGA、PDS、PLLA等材料被相继开发并应用于骨骼、肌腱及韧带组织工程。这些材料都具有优异的机械性能、生物可降解性、易于加工，但通常降解产物呈酸性，容易引发炎症反应，需要进一步加工修饰改善性能^[76]。

鉴于移植肌腱到骨组织的分级组成和结构，研究者通常倾向于通过双相/多相支架、梯度矿化支架的形式来构建复杂分层界面，使得界面异型细胞群和基质的阶段特异性变化成为可能，并表现出分级的机械性能。Sun等^[77]制备了PLGA-聚已内酯的共静电纺双纳米支架，还将胶原蛋白和纳米羟基磷灰石分别掺入其中，以提高生物相容性。Kim等^[78]开发了一种具有不同成分的4层胶原蛋白支架，包括肌腱层（胶原蛋白）、纤维软骨层（胶原蛋白和硫酸软骨素）、矿化纤维软骨层（胶原蛋白和低度矿化透明质酸）和骨层（胶原蛋白和高度矿化透明质酸）；Lausch等^[79]使用in-well矿化系统制造了多相胶原支架，以提升移植肌腱-骨组织愈合；Chen等^[80]通过静电纺丝装置制备了纳米纤维丝膜，然后将丝膜垂直放置在10×模拟体液中，从底部产生空间层面从下到上的矿化梯度，成功制造了梯度矿化电纺丝附着点支架。

综上，可降解植入物可以提供额外的稳定性，保护移植肌腱，促进其愈合和成熟，是促进ACLR术后移植肌腱愈合的重要策略。可降解植入物能够以模拟原生ACL复杂界面的结构、基质等形式或者载药递送生物活性物质的形式增加生物诱导性，促进细胞迁移、增殖和分化，抑制炎症反应和纤维化等。尽管制备技术不断进步，能够有效模仿原生ACL微环境，但目前大多数研究仍停留于微观尺度的模仿，在纳米尺度上的突破仍存在巨大挑战。

5. 应用于ACLR的动物实验模型和临床初步尝试

动物模型是临床前研究的最主要研究对象，旨在证明生物材料进入临床试验前的可行性、安全性和有效性。通常小鼠、大鼠、兔、犬、山羊、猪等均可用于建立ACLR模型。其中，小鼠、大鼠因成本较低和易获取性受到研究者青睐，广泛应用于ACLR愈合相关机制通路的探索。兔在生物材料研究中的应用也较为广泛，然而有研究表明，兔膝关节功能位呈屈曲位，与大型动物特别是人体存在差别^[81]。山羊和猪是更为优势的动物模型^[82]，一般需要扎实的前期研究基础。

然而，动物模型往往只能模拟人ACLR的病理变化、生物力学特性或功能恢复等部分方面，不能全面反映人ACLR的复杂性和多样性，且往往缺乏标准化的建立方法、评价指标和实验设计，导致不同研究之间难以比较和整合。再者，动物模型往往受到种间差异、个体差异、实验条件和技术水平等因素的影响，导致实验结果难以推广到人体研究。

尽管如此，部分研究已经开始尝试将生物材料应用于人体研究中，并取得了一定进展。Alentorn-Geli等^[83]的研究尝试了脂肪源再生干细胞（adipose-derived regenerative cells，ADRCs）在ACLR的应用，并表明其有可能促进组织再生以改善移植肌腱愈合过程，然而并未发现与未接受ADRCs治疗的患者在临床结果方面存在显著差异。Jang等^[44]则尝试通过同种异体人脐带血来源MSCs改善组织再生，但需要进一步研究来验证其有效性。Yang等^[84]一项关于PRP应用于ACLR的回顾性研究表明，PRP能及早改善膝关节功能；然而Gong等^[85]的研究则表明PRP对减少骨隧道增宽或改善膝关节功能并无显著作用。Mutsuzaki等^[86]通过钙磷杂化肌腱移植物增强移植物与骨隧道的整合来促进ACLR术后移植肌腱愈合。Wang等^[87]通过体外冲击波治疗刺激血流和细胞增殖来促进ACLR术后移植肌腱愈合，结果显示该方法减少了骨隧道扩大，但需要进一步研究确定其有效性。

6. 总结及展望

关节镜下ACLR术后效果不佳，部分患者存在需要翻修的问题。临床上报道了多种改良术式，但因证据质量良莠不齐、临床试验方案设计差异性大、不同人种之间存在解剖变异等，目前尚无公认的最佳临床术式。近年来，随着对ACL微观结构的进一步了解以及生物医学领域相关技术的突飞猛进，大量研究旨在通过组织工程技术促进ACLR术后疗效。尽管部分研究已显著提升了疗效，然而大部分研究仍局限于早期动物实验阶段，离真正临床推广应用仍有较远距离。此外，受限于当下制备技术，对界面的仿生仍多停留于微米、毫米级，并且偏向于形态学仿生，在信号机制通路上的研究依旧不足。未来随着ACL解剖学、发育学相关报道的深入以及制备技术的改进，该领域在促进ACLR方面有望得到进一步提升。

利益冲突　在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突；经费支持没有影响文章观点和报道

作者贡献声明　蔡武峰：文献检索，原文撰写；李棋：文章撰写，质量控制；李箭：文章撰写及审校

Funding Statement

四川省科技厅重点研发项目（2023YFG0221）

Sichuan Provincial Science and Technology Department Project (2023YFG0221)