Abstract
目的
探究降浊合剂影响肥胖大鼠糖脂代谢的机制。
方法
30只健康雄性SD大鼠随机分为正常对照组、模型对照组、降浊合剂组,每组各10只,其中正常对照组给予普通饲料喂养,模型对照组给予高脂饲料喂养,降浊合剂组在给予高脂饲料喂养的同时给予50 g/kg降浊合剂浓缩液灌胃。各组干预8周后,采用全自动生化分析仪检测各组大鼠血糖、总胆固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平;采用定量逆转录PCR法检测各组大鼠白色、棕色脂肪中PR结构域蛋白16(PRDM16)、解偶联蛋白1(UCP1)信使RNA表达;采用蛋白质印迹法检测各组大鼠白色、棕色脂肪中PRDM16以及各组大鼠白色脂肪中Toll样受体4(TLR4)、磷酸化核因子抑制蛋白(IκBα)和核因子κB(NF-κB)蛋白表达水平;采用免疫组织化学法检测各组大鼠白色、棕色脂肪中UCP1蛋白表达水平。
结果
与正常对照组比较,模型对照组白色脂肪质量(P<0.01)、白色脂肪系数(P<0.05)和Lee’s系数(P<0.01)均显著升高;血糖、总胆固醇、三酰甘油、LDL-C含量均升高,其中三酰甘油含量升高明显(P<0.05);白色脂肪和棕色脂肪PRDM16、UCP1的信使RNA和蛋白表达水平均明显降低(均P<0.05)。与模型对照组比较,降浊合剂组的白色脂肪质量、白色脂肪系数和Lee’s系数均明显降低(均P<0.01);血糖、总胆固醇、三酰甘油、LDL-C含量均有所降低,其中三酰甘油含量明显降低(P<0.01);棕色脂肪和白色脂肪中PRDM16、UCP1的信使RNA和蛋白的表达水平上升。此外,与正常对照组比较,模型对照组白色脂肪中TLR4、磷酸化IκBα和NF-κB-p65蛋白表达水平明显升高(P<0.01),而降浊合剂组上述蛋白的表达水平相对于模型对照组显著下降(均P<0.05)。
结论
降浊合剂可以通过调节SD大鼠体内TLR4/IκBα/NF-κB信号通路缓解高脂饮食诱导的体脂增加、生化指标异常表达及促进关键转录因子UCP1和PRDM16在白色、棕色脂肪中的表达,进而抑制肥胖大鼠的体脂形成,降低体重,缓解肥胖。
Keywords: 降浊合剂, 肥胖, 脂代谢, 糖代谢, PR结构域蛋白16, 解偶联蛋白1, SD大鼠
Abstract
Objective
To explore the mechanism of Chinese medicine Jiangzhuo mixture regulating glucose and lipid metabolism in obese rats.
Methods
Thirty healthy male SD rats were randomly divided into normal control group, model control group, and Jiangzhuo mixture treatment group, with 10 rats in each group. The rats in the normal control group were fed with normal diet, the obesity model was induced by feeding high-fat diet in the model control group and the Jiangzhuo mixture treatment group, the rats in the treatment group were given with Jiangzhuo mixture 50 g/kg by gavage. After 8 weeks of intervention, the blood glucose (GLU), total cholesterol (TC), triglyceride (TG), low-density lipoprotein cholesterol (LDL-C) and high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C) levels were measured in the three groups. Quantitative reverse transcription PCR were used to detect the expression levels of PR domain containing 16 (PRDM16) and uncoupling protein 1 (UCP1) in white and brown adipose tissues of the rats in each group; Western blotting was used to detect the expression of PRDM16 in the white and brown adipose tissue of rats, and Toll-like receptor 4 (TLR4), nuclear factor-κB (NF-κB) and inhibitor of NF-κB alpha (IκBα) in the white adipose tissue; immunohistochemistry was used to detect the expression of UCP1 protein in white and brown adipose tissues.
Results
Compared with the normal control group, the white fat weight (P<0.01), white fat coefficient (P<0.05) and Lee’s coefficient (P<0.01) were significantly increased in the model control group; the contents of GLU, TC, TG and LDL-C were all increased, and the content of TG was significantly increased (P<0.05) in the model control group. The mRNA and protein expression levels of PRDM16 and UCP1 in white fat and brown fat were significantly decreased (P<0.05) in the model control group. Compared with the model control group, the white fat weight and white fat coefficient and Lee’s coefficient were significantly reduced in the Jiangzhuo mixture treatment group (all P<0.01), the levels of GLU, TC, TG, and LDL-C in the the treatment group were all reduced, and the content of TG was reduced more obviously (P<0.01); expression levels of PRDM16 and UCP1 mRNA and protein were increased in brown and white adipose tissue. Compared with the normal control group, the expression levels of TLR4, phospho-IκBα and NF-κB-p65 proteins in white adipose tissue of the model control group were significantly increased (all P<0.01), while the expression levels of these proteins in the treatment group were significantly lower than those in the model control group (all P<0.05).
Conclusion
Jiangzhuo mixture can alleviate high-fat diet-induced increase in body fat, abnormal expression of biochemical indexes and promote the expression of key proteins including UCP1 and PRDM16 in white and brown adipose tissues by regulating TLR4/IκBα/NF-κB signaling pathway.
Keywords: Jiangzhuo mixture, Obese, Lipid metabolism, Saccharometabolism, PR domain containing 16, Uncoupling protein 1, SD rats
肥胖是指体内脂肪堆积过剩造成体重过度增长,可能导致胰岛素抵抗、糖尿病、心血管疾病和某些癌症的发生,是影响健康的第五大危险因素[1-3]。目前,肥胖症的治疗及相关并发症的预防缺乏有效的方法,迫切需要开发新的、更安全、更有效的治疗肥胖的药物。
随着中医药研究的不断深入,中药制剂在改善肥胖、调节肝脏脂肪代谢方面的优势日益突出。如在自发型肥胖型糖尿病大鼠非酒精性脂肪性肝病中,中药材辣木叶醇的提取物可通过调节生化指标改善大鼠肥胖和肝脏质量[4];中药汤剂温胆汤可改善胰岛素抵抗肥胖大鼠的糖脂代谢并抑制炎症因子水平,还可通过调节关键转录因子改善肥胖大鼠的临床症状[5-6]。降浊合剂是由浙江中医药大学附属宁波市中医院主任中医师王晖根据多年临床用药经验创立的中药复方,具有补气升清降浊的作用,可有效改善患者的糖脂代谢及肠道菌群紊乱状态,在治疗气虚痰浊型糖耐量异常疾病和气虚痰浊型2型糖尿病中具有较好的疗效[7-9]。此外,降浊合剂还可影响谷氨酸钠肥胖大鼠糖脂代谢,降低谷氨酸钠肥胖大鼠的胆固醇、游离脂肪酸、血胰岛素水平[10]。肥胖可以导致胰岛素抵抗,而胰岛素抵抗与糖脂代谢关系密切。研究发现,电针通过抑制TLR4/IκBα/NF-κB通路可以改善肥胖胰岛素抵抗大鼠的胰岛素敏感性[11]。为此,在前期研究基础上,本研究进一步探究降浊合剂对肥胖大鼠糖脂代谢的影响,以及这种影响与TLR4/IκBα/NF-κB通路的相关性,以期探索降浊合剂治疗肥胖症的机制。
1. 材料与方法
1.1. 实验动物、药物、试剂及仪器
30只清洁级雄性SD大鼠,体重(120±10)g,由浙江省实验动物中心提供[生产许可证号:SYXK(浙)2016-0022],饲养于浙江省中医药研究院实验动物中心,温度(22±2)℃,湿度50%~60%,12 h昼夜节律饲养,实验动物使用许可证号:SYXK(浙)2019-0010。普通饲料为实验动物标准饲料,由浙江省中医药研究院实验动物中心提供。动物实验研究方案通过浙江百越生物技术有限公司伦理委员会审查(ZJBYLA-IACUC-20200302)。
降浊合剂组方含生黄芪30 g、丹参30 g、生苍术15 g、生薏苡仁30 g、生麦芽30 g、生扁豆30 g、绞股蓝30 g、生鸡内金15 g、生葛根30 g、生山楂30 g、荷叶15 g,浓缩至生药浓度5 g/mL,由浙江中医药大学附属宁波市中医院提供。
TRIzol(批号119704)为美国Ambion公司产品;异丙醇(批号2015122801)为成都市科龙化工试剂厂产品;三氯甲烷(批号20180109)为杭州高晶精细化工有限公司产品;无水乙醇(批号2018051801)为成都市科隆化学品有限公司产品;逆转录试剂盒(批号AK22355A)、荧光定量PCR试剂盒(批号AK31128A)为日本TaKaRa公司产品;PRDM16、UCP1引物为生工生物工程(上海)股份有限公司产品;PRDM16兔多克隆抗体(批号16k7094)为美国Affinity公司产品;GAPDH兔多克隆抗体(批号P1020)为杭州戴格生物技术有限公司产品;UCP1抗体兔多克隆抗体(批号00084987)为美国Proteintech公司产品;全蛋白提取试剂盒(批号KGP2100)为江苏凯基生物技术股份有限公司产品;BCA蛋白浓度测定试剂盒(批号080719191118)、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(批号P0012A)和TBST(批号ST673)为上海碧云天生物技术有限公司产品;全自动蛋白定量分析试剂盒(12-230ku)(批号34360)为美国Protein Simple公司产品。
离心机(Centrifuge 5810R)为德国Eppendorf公司产品;全自动生化分析仪(AU5831)为美国Beckman公司产品;StepOnePlus实时荧光定量PCR仪为美国Applied Biosystems公司产品;正置荧光显微镜(ECLIPSE 80i)为日本Nikon公司产品;WES全自动蛋白定量分析仪为美国Protein Simple公司产品;组织脱水机(TP1020-1)、石蜡包埋机(EG1150)、石蜡切片机(RM2235)为德国Leica公司产品;增强化学发光试剂(4AW011-200)为北京四正柏生物科技有限公司产品;偏氟乙烯膜(IPSN07852)为美国Millipore公司产品。
1.2. 肥胖大鼠模型的建立及分组处理
30只大鼠被随机分为正常对照组、模型对照组和降浊合剂组,每组各10只。其中正常对照组大鼠给予足量普通饲料10 mL/kg灌胃,自由饮食饮水,共8周;模型对照组大鼠给予足量高脂饲料(食用化猪油15.0%、蔗糖20.0%、胆固醇1.2%、胆盐0.2%、普通饲料63.6%)10 mL/kg灌胃,自由饮食饮水,共8周;降浊合剂组大鼠给予足量高脂饲料(同模型对照组)10 mL/kg加降浊合剂浓缩液50 g/kg灌胃[10],自由饮食饮水,共8周。然后禁食24 h进行后续实验。
1.3. 生化分析仪检测血糖、血脂指标水平
采用3%戊巴比妥钠(40 mg/kg)对空腹大鼠进行腹腔注射麻醉,随后主动脉取血5 mL,3220×g离心后采用全自动生化分析仪检测各组大鼠血糖、总胆固醇、三酰甘油、LDL-C和HDL-C水平。
1.4. 计算脂肪质量系数、Lee’s指数
采用3%戊巴比妥钠(40 mg/kg)对空腹大鼠进行腹腔注射麻醉后,后颈椎脱位处死大鼠,使用小剪刀纵切皮肤暴露腹股沟脂肪,剥离淋巴结,剪下白色脂肪,然后剪开肩胛骨下皮肤看到呈对称的棕色脂肪,去除表面的白色脂肪后剪下棕色脂肪。分别称取腹部白色脂肪、肩胛部棕色脂肪组织,计算脂肪质量系数:脂肪质量系数=脂肪质量/体重×100%。根据大鼠体长,计算Lee’s指数:Lee’s指数=×103/体长(cm)。完成后,切取不同部位脂肪约1/4置于10% 中性福尔马林溶液中保存备用。另取不同部位脂肪,液氮速冻后保存于-80 ℃中,用于基因和蛋白表达检测。
1.5. 定量逆转录PCR法检测脂肪中PRDM16、UCP1的mRNA表达
取上述冻存的白色、棕色脂肪组织80~100 mg,液氮研磨后采用TRIzol法提取总RNA,按照试剂盒说明进行定量逆转录PCR检测。逆转录反应条件:37 ℃ 15 min,85 ℃ 5 s,4 ℃保存。定量PCR反应条件:95 ℃ 30 s,95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,40个循环;熔解曲线95 ℃ 15 s,60 ℃ 60 s,95 ℃ 15 s。PRDM16上游引物5-CAAGGACTGCGAGCGGATGTTC-3,下游引物5-TCTGGTGGCGGATGAGGTTGG-3;UCP1上游引物5-CAGAGGTGGTGAAGGTCAGAATGC-3,下游引物5-GAGTCGTCCCTTTCCACAGTGTTG-3;内参基因EF-1α上游引物5-CGAGCCACCATACAGTCAGA-3,下游引物5-CCATTCCAACCAGAAATTGG-3。采用2-∆∆Ct法进行分析。
1.6. 蛋白质印迹法检测脂肪中PRDM16、TLR4、磷酸化IκBα和NF-κB的蛋白表达
取上述各组大鼠白色、棕色脂肪组织,液氮研磨,用全蛋白提取试剂盒提取总蛋白,BCA试剂盒测定蛋白浓度,按照全自动蛋白定量分析试剂盒的操作说明检测PRDM16蛋白表达,在反应板内依次加入蛋白样品3 μL/孔,抗体稀释液10 μL/孔,兔抗鼠PRDM16抗体(一抗,1∶20稀释)10 μL/孔,兔抗鼠GAPDH抗体(内参,1∶100稀释),兔抗鼠β-肌动蛋白抗体(内参,1∶100稀释)10 μL/孔,辣根过氧化物酶标记山羊抗兔免疫球蛋白G抗体(二抗)10 μL/孔,发光液15 μL/孔,清洗缓冲液500 μL/孔,采用全自动蛋白定量分析仪检测并采用Compass软件分析峰面积,蛋白相对表达水平用目标蛋白峰面积/内参蛋白峰面积比值表示。TLR4、磷酸化IκBα和NF-κB的蛋白表达检测具体步骤如下:使用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质(20 μg),并转移到聚偏氟乙烯膜上,5%脱脂奶粉进行封闭。分别加入TLR4抗体(一抗,1∶1000稀释)、磷酸化IκBα抗体(一抗,1∶1000稀释)、NF-κB-p65抗体(一抗,1∶1000稀释)和β-肌动蛋白抗体(内参,1∶1000稀释)在4 ℃下孵育过夜反应,用0.1 mol/L TBST冲洗三次。再用辣根过氧化物酶标记山羊抗兔免疫球蛋白G抗体(二抗)在室温下孵育2 h。最后,使用增强化学发光试剂检测特异性蛋白信号。使用Image J软件对特定蛋白信号的灰度值进行检测和归一化。
1.7. 免疫组织化学法检测脂肪组织中UCP1的蛋白表达
将脂肪组织在10%中性福尔马林溶液中浸泡3~4 h,固定后分别采用75%乙醇、85%乙醇、95%乙醇、无水乙醇、二甲苯溶液进行脱水,常规浸蜡包埋,按照所需切面用单面刀片将蜡块切成梯状,并用蜡铲将蜡块底部固定于载蜡器,采用旋转切片机进行4 μm连续切片,二甲苯脱蜡,滴加3%的过氧化氢后室温封闭静置10 min,滴加酸碱度为6.0的0.01 mol/L枸橼酸盐缓冲液冲洗,将石蜡切片置于烤箱中微波修复20 min,5%牛血清白蛋白封闭1 h,UCP1一抗(1∶50稀释)于4 ℃冰箱孵育,二抗室温孵育30 min,常规二氨基联苯胺显色、苏木素复染、脱水、封片,采用NIS-Elements D 3.2图像分析系统,放大200倍镜下随机选取5个视野,通过分析染色强度(棕褐色)来确定阳性区域,计算阳性染色部位的面积占总视野面积的百分比,判定UCP1的表达情况。
1.8. 统计学方法
采用SPSS 17.0软件进行统计分析。正态分布的计量数据用均数±标准差(±s)描述,多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用最小显著差数法,P<0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1. 降浊合剂对肥胖鼠血糖和血脂指标的影响
与正常对照组比较,模型对照组三酰甘油水平升高(P<0.05);与模型对照组比较,降浊合剂组三酰甘油水平降低(P<0.05),见表1。结果提示,降浊合剂可以改善肥胖鼠高脂饮食导致的血脂异常。
表1.
三组血糖和血脂指标比较
组 别 | n | 血 糖 | 总胆固醇 | 三酰甘油 | LDL-C | HDL-C |
---|---|---|---|---|---|---|
正常对照组 | 10 | 6.18±0.79 | 1.41±0.26 | 0.75±0.22 | 0.55±0.06 | 0.90±0.16 |
模型对照组 | 10 | 6.78±0.49 | 1.61±0.33 | 1.11±0.31* | 0.59±0.09 | 0.80±0.19 |
降浊合剂组 | 10 | 6.17±1.07 | 1.37±0.36 | 0.73±0.27# | 0.57±0.07 | 0.81±0.18 |
与正常对照组比较,*P<0.05;与模型对照组比较,#P<0.05. LDL-C:低密度脂蛋白胆固醇;HDL-C:高密度脂蛋白胆固醇.
±s,mmol/L
2.2. 降浊合剂对肥胖鼠脂肪质量的影响
8周后,与正常对照组比较,模型对照组的白色脂肪质量和白色脂肪系数均增加(均P<0.05),Lee’s指数上升(P<0.01);与模型对照组比较,降浊合剂组的白色脂肪质量和白色脂肪系数均明显减少(均P<0.01),Lee’s指数下降(P<0.01),见表2。结果提示,降浊合剂能够减少肥胖鼠高脂饮食导致的体脂增加。
表2.
三组体脂系数比较
组 别 | n | 白色脂肪质量(g) | 白色脂肪质量系数 | 棕色脂肪质量(g) | 棕色脂肪质量系数 | Lee’s指数 |
---|---|---|---|---|---|---|
正常对照组 | 10 | 12.55±3.22 | 2.43±0.56 | 0.54±0.14 | 0.11±0.03 | 295.69±7.76 |
模型对照组 | 10 | 16.91±2.84** | 2.97±0.55* | 0.53±0.13 | 0.09±0.02 | 305.69±9.07** |
降浊合剂组 | 10 | 11.02±2.31## | 2.14±0.45## | 0.55±0.05 | 0.11±0.01 | 295.33±5.23## |
与正常对照组比较,*P<0.05,**P<0.01;与模型对照组比较,##P<0.01.
±s
2.3. 降浊合剂对肥胖鼠脂肪中PRDM16、UCP1的mRNA和蛋白表达的影响
与正常对照组比较,模型对照组白色脂肪和棕色脂肪中PRDM16、UCP1的mRNA表达均减少(均P<0.05);与模型对照组比较,降浊合剂组棕色脂肪中PRDM16的mRNA表达均增加(P<0.05),白色脂肪中PRDM16,棕色脂肪和白色脂肪中UCP1的mRNA表达也有增加趋势,但差异无统计学意义(均P>0.05)。见表3。提示降浊合剂可以提高棕色脂肪和白色脂肪中PRDM16、UCP1的mRNA表达水平。
表3.
三组白色和棕色脂肪中PRDM16、UCP1 mRNA表达比较
组 别 | n | PRDM16 | UCP1 | ||
---|---|---|---|---|---|
棕色脂肪 | 白色脂肪 | 棕色脂肪 | 白色脂肪 | ||
正常对照组 | 10 | 1.00±0.11 | 1.00±0.11 | 1.00±0.12 | 1.00±0.12 |
模型对照组 | 10 | 0.54±0.12** | 0.63±0.15* | 0.67±0.17* | 0.63±0.15* |
降浊合剂组 | 10 | 0.82±0.03# | 0.79±0.20 | 0.83±0.08 | 0.67±0.12 |
与正常对照组比较,*P<0.05,**P<0.01;与模型对照组比较,#P<0.05. PRDM:PR结构域蛋白;UCP:解偶联蛋白.
±s
白色和棕色脂肪中PRDM16蛋白表达量模型对照组[(0.15±0.02)和(0.26±0.02)]比正常对照组[(0.25±0.17)和(0.61±0.05)]均减少(均P<0.01),降浊合剂组[(0.20±0.02)和(0.51±0.03)]比模型对照组均增加(均P<0.05),见图1。白色和棕色脂肪中UCP1蛋白阳性染色部位的面积占总视野面积的百分比模型对照组[(10.84±1.51)%和(51.74±4.03)%]比正常对照组[(15.06±1.97)%和(83.20±6.38)%]均减少(均P<0.01);降浊合剂组[(14.72±1.38)%和(76.12±6.23)%]比模型对照组均增加(均P<0.05),见图2。提示降浊合剂能够明显增加白色脂肪和棕色脂肪中RDM16蛋白表达量;增加UCP1蛋白阳性面积,减小脂肪细胞。
图1. 三组白色和棕色脂肪组织中PRDM16蛋白表达电泳图.
PRDM:PR结构域蛋白;GAPDH:甘油醛-3-磷酸脱氢酶.
图2. 三组白色和棕色脂肪组织中UCP1蛋白免疫组织化学染色结果.
棕褐色为UCP1阳性表达. 正常对照组白色脂肪细胞、棕色脂肪细胞均呈空泡状,近似圆形. 与正常对照组比较,模型对照组脂肪细胞较大,UCP1阳性面积减小;与模型对照组比较,降浊合剂组脂肪细胞减小,UCP1阳性面积增加. 标尺=100 μm. UCP:解偶联蛋白.
2.4. 降浊合剂对模型鼠白色脂肪组织TLR4/IκBα/NF-κB信号通路的影响
TLR4、磷酸化IκBα和NF-κB-p65蛋白表达模型对照组比正常对照组增加(均P<0.01),而降浊合剂组比模型对照组减少(均P<0.05),见图3、表4。结果提示,降浊合剂可以降低TLR4、磷酸化IκBα和NF-κB-p65蛋白表达水平,抑制TLR4/IκBα/NF-κB信号通路。
图3. 三组TLR4、磷酸化IκBα、NF-κB蛋白表达电泳图.
TLR:Toll样受体;NF-κB:核因子κB;IκBα:NF-κB抑制蛋白α.
表4.
三组TLR4、磷酸化IκBα、NF-κB蛋白表达水平比较
组 别 | n | TLR4 | 磷酸化IκBα | NF-κB-p65 |
---|---|---|---|---|
正常对照组 | 10 | 1.00±0.09 | 1.00±0.12 | 1.00±0.12 |
模型对照组 | 10 | 2.60±0.23** | 3.87±0.35** | 3.63±0.37** |
降浊合剂组 | 10 | 2.15±0.18# | 3.15±0.29# | 2.88±0.29# |
与正常对照组比较,**P<0.01;与模型对照组比较,#P<0.05. TLR:Toll样受体;NF-κB:核因子κB;IκBα:NF-κB抑制蛋白α.
±s
3. 讨论
近年研究发现,黄芪、绞股蓝、丹参、生苍术、山楂、荷叶等中药材可以增加哺乳动物能量消耗、减少脂肪积累[12-17]。本研究采用以上中药材制成降浊合剂,探究该组方对肥胖大鼠关键转录因子的影响。
研究先分析了降浊合剂对肥胖SD大鼠Lee’s指数和脂肪质量的影响。Lee’s指数是评价成年大鼠肥胖程度的有效指数[18]。本文资料显示,降浊合剂可以有效缓解高脂饮食诱导的SD大鼠Lee’s指数和白色脂肪质量系数升高,说明降浊合剂可以改善SD大鼠的肥胖。此外,当动物机体受到刺激时,生化指标作为血液成分可随着疾病的程度发生相应的变化[19]。本文资料显示,降浊合剂可以缓解高脂饮食导致的大鼠血糖、总胆固醇、三酰甘油、LDL-C含量升高,可能是因为降浊合剂能增加机体对脂肪的分解和代谢,从而减轻肥胖、降低血脂。因此,本文进一步研究了降浊合剂对肥胖大鼠棕色和白色脂肪含量的影响。
肥胖的特征是棕色和白色脂肪代谢含量失调,通常表现为白色脂肪增多而棕色脂肪细胞减少。目前,对抗肥胖的策略已经从防止脂肪积累转向通过激活棕色脂肪组织和白色脂肪组织的褐变来促进能量消耗[20]。棕色和白色脂肪细胞都属于产热脂肪,且均富含线粒体并表达UCP1[21]。UCP1可将电子传递链从能量生产中解耦,导致热能的释放。此外,有研究发现了新的棕色脂肪特异性标志物,如PRDM16,已被用于识别棕色脂肪刺激剂[22]。因此,控制UCP1和PRDM16的表达对治疗肥胖具有重要的临床意义。研究表明,丹参、苍术等制成的津力达中药颗粒在治疗高脂饮食的小鼠时可明显提高其棕色脂肪组织中UCP1蛋白的表达[23];黄芪散可通过促进UCP1和PRDM16表达缓解2型糖尿病模型大鼠伴随的肥胖症状[24]。此外,促进UCP1的表达可以使白色脂肪棕色化,进而增加能量消耗,减轻体重[25]。本文资料显示,降浊合剂能够明显促进白色、棕色脂肪中PRDM16、UCP1的表达,证实降浊合剂的组方成分在调节肥胖机体转录相关因子中具有良好的效力,但其具体作用机制还须进一步研究。
此外,肥胖患者的胰岛素抵抗现象及机体炎症反应具有一定联系[26],其中下丘脑起到重要的调控作用,下丘脑关键炎性介质TLR4在转导过程中可通过刺激IκBα发生磷酸化,并激活NF-κB来促进炎症反应,促进胰岛素抵抗,进一步加重肥胖。还有研究表明,在肥胖等慢性炎症中发挥重要作用的IL-6通过激活信号转导和转录激活因子3信号途径调控白色脂肪棕色化,进而维持脂肪代谢平衡[27]。为了从更深层次探究降浊合剂对肥胖SD大鼠体脂、生化指标以及肥胖相关基因的影响,本研究检测了白色脂肪中TLR4、磷酸化IκBα、NF-κB蛋白表达水平。结果显示,在用降浊合剂治疗后,SD大鼠的TLR4、磷酸化IκBα、NF-κB蛋白表达水平明显得到抑制,推测降浊合剂可以通过调节SD大鼠体内TLR4/IκBα/NF-κB信号通路缓解高脂饮食诱导的体脂增加、生化指标异常表达及促进关键转录因子UCP1和PRDM16在白色、棕色脂肪中的表达。
综上所述,本研究结果证实降浊合剂可以调节与肥胖相关的关键信号通路TLR4/IκBα/NF-κB,调节肥胖相关指标的表达以及降低脂肪组织的产生,从而降低肥胖大鼠的体重、体脂,改善肥胖的临床特征。
Acknowledgments
研究得到宁波市科技计划项目(2019A610359)、宁波市医疗卫生品牌学科建设项目(PPXK2018-07)支持
Acknowledgments
The work was supported by the Science and Technology Project of Ningbo City (2019A610359) and Medical and Health Brand Discipline Construction Project of Ningbo City (PPXK2018-07)
[缩略语]
Toll样受体(Toll-like receptor,TLR);核因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB);NF-κB抑制蛋白α(inhibitor of NF-κB alpha,IκBα);聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR);PR结构域蛋白(PR domain,PRDM);解偶联蛋白(uncoupling protein,UCP);甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH);二喹啉甲酸法(bicinchoninic acid assay,BCA);含0.1%吐温-20的Tris缓冲液(Tris buffered saline with 0.1% Tween 20,TBST);低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C);高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein cholesterol, HDL-C);信使RNA(messenger RNA,mRNA);延伸因子-1α(elongation factor 1-alpha,EF-1α)
利益冲突声明
所有作者均声明不存在利益冲突
Conflict of Interests
The authors declare that there is no conflict of interests
参考文献(References)
- 1.WANG L, HUI S S. Diagnostic accuracy of different body weight and height-based definitions of childhood obesity in identifying overfat among Chinese children and adolescents: a cross-sectional study[J]. BMC Public Health, 2015, 15: 802. 10.1186/s12889-015-2152-0 [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 2.CONDE S, XU X, GUO H, et al. Mendelian rando-misation analysis of clustered causal effects of body mass on cardiometabolic biomarkers[J]. BMC Bioin-formatics, 2018, 19(Suppl 7): 195. 10.1186/s12859-018-2178-2 [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 3.刘阳, 张赛, 董高芳, 等. 高强度间歇训练通过支配内脏脂肪的交感神经活动促进白色脂肪组织棕色化[J]. 中国体育科技, 2020, 56(2): 15-23. 10.16470/j.csst.2019226 [DOI] [Google Scholar]; LIU Yang, ZHANG Sai, DONG Gaofang, et al. High-intensity interval training promotes white adipose tissue browning through sympathetic activity that innervates visceral fat[J]. China Sport Science and Technology, 2020, 56(2): 15-23. (in Chinese) 10.16470/j.csst.2019226. 10.16470/j.csst.2019226 [DOI] [Google Scholar]
- 4.董笑克, 刘铜华, 常青, 等. 辣木叶醇提物对自发型肥胖型糖尿病大鼠非酒精性脂肪性肝病的影响[J]. 环球中医药, 2019, 12(8): 1149-1153. 10.3969/j.issn.1674-1749.2019.08.003 [DOI] [Google Scholar]; DONG Xiaoke, LIU Tonghua, CHANG Qing, et al. Effects of ethanol Moringa Oleifera leaves extract on nonalcoholic fatty liver disease in ZDF rats[J]. Global Traditional Chinese Medicine, 2019, 12(8): 1149-1153. (in Chinese) 10.3969/j.issn.1674-1749.2019.08.003. 10.3969/j.issn.1674-1749.2019.08.003 [DOI] [Google Scholar]
- 5.喻松仁, 白洋, 王河宝, 等. 温胆汤对肥胖大鼠血清瘦素及下丘脑STAT3和SOCS3表达的影响[J]. 中医杂志, 2019, 60(3): 57-61. [Google Scholar]; YU Songren, BAI Yang, WANG Hebao, et al. Effect of Wendan Decoction on serum leptin and expression of STAT3 and SOCS3 in hypothalamus of obese rat[J]. Journal of Traditional Chinese Medicine, 2019, 60(3): 57-61. (in Chinese) [Google Scholar]
- 6.罗思聪, 郭永宁, 蔡海荣, 等. 疏肝温胆汤对胰岛素抵抗肥胖大鼠糖脂代谢和炎症因子的影响[J]. 广州中医药大学学报, 2021, 38(4): 6. 10.13359/j.cnki.gzxbtcm.2021.04.022 [DOI] [Google Scholar]; LUO Sicong, GUO Yongning, CAI Hairong, et al. Effects of liver-soothing and gallbladder-inducing decoction on glucose and lipid metabolism and inflam-matory factors in insulin resistant obese rats[J]. Journal of Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine, 2021, 38(4): 6. (in Chinese) 10.13359/j.cnki.gzxbtcm.2021.04.022. 10.13359/j.cnki.gzxbtcm.2021.04.022 [DOI] [Google Scholar]
- 7.王晖, 周建扬, 陈霞波, 等. 降浊合剂治疗气虚痰浊型2型糖尿病66例临床研究[J]. 中医杂志, 2007, 48(9): 803-805. 10.3321/j.issn:1001-1668.2007.09.013 [DOI] [Google Scholar]; WANG Hui, ZHOU Jianyang, CHEN Xiabo, et al. Clinical observation on 66 cases of diabetes Ⅱ with Qi deficinecy and phlegm-turbid syndrome treated by Jiangzhuo mixture[J]. Journal of Traditional Chinese Medicine, 2007, 48(9): 803-805. (in Chinese) 10.3321/j.issn:1001-1668.2007.09.013. 10.3321/j.issn:1001-1668.2007.09.013 [DOI] [Google Scholar]
- 8.黄利兵, 陈霞波, 齐方洲, 等. 基于数据挖掘法的王晖教授治疗糖尿病用药规律研究[J]. 浙江中医学院学报, 2018, 42(1): 55-59, 63. [Google Scholar]; HUANG Libing, CHEN Xiabo, QI Fangzhou, et al. The research based on association rule and entropy clustering algorithm of the principle of herbs used by professor WANG Hui in treating diabetes[J]. Journal of Zhejiang Chinese Medical University, 2018, 42(1): 55-59, 63. (in Chinese) [Google Scholar]
- 9.杜含光, 陈霞波, 顾颖杰, 等. 降浊合剂治疗气虚痰浊型糖耐量异常患者的疗效及对肠道菌群的影响[J]. 中华中医药杂志, 2020, 35(6): 3227-3231. [Google Scholar]; DU Hanguang, CHEN Xiabo, GU Yingjie, et al. The-rapeutic effect of Jiangzhuo Mixture on Qi deficiency and phlegm turbidity type patients with impaired glucose tolerance and its effect on intestinal flora[J]. China Journal of Traditional Chinese Medicine and Pharmacy, 2020, 35(6): 3227-3231. (in Chinese) [Google Scholar]
- 10.周开, 龚文波, 周建扬, 等. 降浊合剂对MSG肥胖大鼠糖脂代谢的影响[J]. 中国中西医结合杂志, 2008, 28(11): 4. 10.3321/j.issn:1003-5370.2008.11.016 [DOI] [PubMed] [Google Scholar]; ZHOU Kai, GONG Wenbo, ZHOU Jianyang, et al. Influence of Jiangzhuo Mixture on glucose and lipid metabolism in MSG obese-induced rats[J]. Chinese Journal of Integrated Traditional and Western Medicine, 2008, 28(11): 4. (in Chinese) 10.3321/j.issn:1003-5370.2008.11.016. 10.3321/j.issn:1003-5370.2008.11.016 [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 11.武欢, 陈丽, 张照庆, 等. 电针对肥胖胰岛素抵抗大鼠下丘脑TLR4/IκBα/NF-κB信号通路的影响[J]. 针刺研究, 2021, 46(1): 33-38. 10.13702/j.1000-0607.200324 [DOI] [PubMed] [Google Scholar]; WU Huan, CHEN Li, ZHANG Zhaoqing, et al. Effect of electroacupuncture on insulin sensitivity and TLR4/IκBα/NF-κB signaling in hypothalamus of obese rats with insulin resistance[J]. Acupuncture Research, 2021, 46(1): 33-38. (in Chinese) 10.13702/j.1000-0607.200324. 10.13702/j.1000-0607.200324 [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 12.李俊涛. 黄芪补气止虚汗[J]. 农村新技术, 2019, 461(1): 68-69. 10.3969/j.issn.1002-3542.2019.01.05130296447 [DOI] [Google Scholar]; LI Juntao. Astragalus supplementing Qi to prevent deficiency sweating[J]. Rural New Technology, 2019, 461(1): 68-69. (in Chinese) 10.3969/j.issn.1002-3542.2019.01.051. 10.3969/j.issn.1002-3542.2019.01.051 [DOI] [Google Scholar]
- 13.张欣怡, 夏明明. 绞股蓝化学成分的降血脂机制研究进展[J]. 光明中医, 2020, 35(8): 161-164. 10.3969/j.issn.1003-8914.2020.08.062 [DOI] [Google Scholar]; ZHANG Xinyi, XIA Mingming. Research progress on the mechanism of reducing blood lipids by the chemical constituents of Gynostemma pentaphyllum (Thunb.)[J]. Guangming Journal of Chinese Medicine, 2020, 35(8): 161-164. (in Chinese) 10.3969/j.issn.1003-8914.2020.08.062. 10.3969/j.issn.1003-8914.2020.08.062 [DOI] [Google Scholar]
- 14.吕任尧, 郑曙琴. 基于数据挖掘和网络药理学的肥胖用药规律及潜在作用分析[J]. 天津中医药大学学报, 2020, 39(1): 103-110. 10.11656/j.issn.1673-9043.2020.01.22 [DOI] [Google Scholar]; Renyao LYU, ZHENG Shuqin. A study of the medication rule for obesity and its potential role based on data mining and network pharmacology[J]. Journal of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, 2020, 39(1): 103-110. (in Chinese) 10.11656/j.issn.1673-9043.2020.01.22. 10.11656/j.issn.1673-9043.2020.01.22 [DOI] [Google Scholar]
- 15.饶诗宇, 刘硕, 陶倩, 等. 薏苡仁复方对高脂饮食诱导肥胖小鼠的作用及其机制研究[J]. 中草药, 2020, 661(2): 122-130. 10.7501/j.issn.0253-2670.2020.02.016 [DOI] [Google Scholar]; RAO Shiyu, LIU Shuo, TAO Qian, et al. Beneficial effects of Coicis Semen formula on high-fat diet-induced obesity in mice[J]. Chinese Traditional and Herbal Drugs, 2020, 661(2): 122-130. (in Chinese) 10.7501/j.issn.0253-2670.2020.02.016. 10.7501/j.issn.0253-2670.2020.02.016 [DOI] [Google Scholar]
- 16.赵莉, 黎隐豪, 肖成汉, 等. 含糖饮料与儿童肥胖的关系及其防控政策研究进展[J]. 中国学校卫生, 2020, 41(3): 468-470. 10.16835/j.cnki.1000-9817.2020.03.043 [DOI] [Google Scholar]; ZHAO Li, LI Yinhao, XIAO Chenghan, et al. Research progress on the relationship between sugary drinks and childhood obesity and its prevention and control policies[J]. Chinese Journal of School Health, 2020, 41(3): 468-470. (in Chinese) 10.16835/j.cnki.1000-9817.2020.03.043. 10.16835/j.cnki.1000-9817.2020.03.043 [DOI] [Google Scholar]
- 17.李文静, 胡红波, 朱少芳, 等. 葛根素在肥胖型多囊卵巢综合征治疗过程中的抗氧化应激作用[J]. 中国妇幼保健, 2017, 32(17): 4111-4116. 10.7620/zgfybj.j.issn.1001-4411.2017.17.32 [DOI] [Google Scholar]; LI Wenjing, HU Hongbo, ZHU Shaofang, et al. Anti-oxidative stress effect of puerarin in the course of the treatment for obese polycystic ovary syndrome[J]. Maternal and Child Health Care of China, 2017, 32(17): 4111-4116. (in Chinese) 10.7620/zgfybj.j.issn.1001-4411.2017.17.32. 10.7620/zgfybj.j.issn.1001-4411.2017.17.32 [DOI] [Google Scholar]
- 18.宋燕娟, 陈瑞, 梁凤霞, 等. 电针对高脂饮食诱导的肥胖大鼠下丘脑沉默信息调节因子1, 叉头状转录因子O1及阿黑皮素原的影响[J]. 针刺研究, 2020, 45(1): 27-32. [Google Scholar]; SONG Yanjuan, CHEN Rui, LIANG Fengxia, et al. Effect of eletroacupuncture on silent information regulartor 1, fork head transcription factor O1 and proopiomelanocortin in the hypothalamus of rats with obesity induced by high-fat diet[J]. Acupuncture Research, 2020, 45(1): 27-32. (in Chinese) [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 19.XIE J, KALWAR Q, YAN P, et al. Effect of concentrate supplementation on the expression profile of miRNA in the ovaries of yak during non-breeding season[J]. Animals (Basel), 2020, 10(9): 1640. 10.3390/ani10091640 [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 20.CHANG Z Y, LIU H M, LEU Y L, et al. Modulation of Gut microbiota combined with upregulation of intestinal tight junction explains anti-inflammatory effect of corylin on colitis-associated cancer in mice[J]. Int J Mol Sci, 2022, 23(5): 2667. 10.3390/ijms23052667 [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 21.SUBASH-BABU P, MOHAMMED ALOWAIDH H, AL-HARBI L N, et al. Ocimum basilicum L. methanol extract enhances mitochondrial efficiency and decreases adipokine levels in maturing adipocytes which regulate macrophage systemic inflammation[J]. Molecules, 2022, 27(4): 1388. 10.3390/molecules27041388 [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 22.QI R, QIU X, ZHANG Y, et al. Comparison of lncRNA expression profiles during myogenic differentiation and adipogenic transdifferentiation of myoblasts[J]. Int J Mol Sci, 2019, 20(15): 3725. 10.3390/ijms20153725 [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 23.张慧, 周鸿儒, 郝媛媛, 等. 中药津力达颗粒通过提高棕色脂肪活性改善高脂饮食喂养小鼠的代谢紊乱[J]. 中国药理学与毒理学杂志, 2019, 33(9): 118. [Google Scholar]; ZHANG Hui, ZHOU Hongru, HAO Yuanyuan, et al. Chinese medicine Jinlida granules can improve metabolic disorders of mice fed high fat diet by increasing brown fat activity[J]. Chinese Journal of Pharmacology and Toxicology, 2019, 33(9): 118. (in Chinese) [Google Scholar]
- 24.王芳, 曾煦欣, 徐彬, 等. 黄芪散对T2DM大鼠体脂系数和脂肪组织MCP-1、UCP-1、PRDM16、Cidea mRNA表达的影响[J]. 中华中医药学刊, 2018, 36(10): 2345-2348. [Google Scholar]; WANG Fang, ZENG Xuxin, XU Bin, et al. Effects of Huangqi powder on fat of rats fed with glucocorticoid and high fat diet[J]. Chinese Archives of Traditional Chinese Medicine, 2018, 36(10): 2345-2348. (in Chinese) [Google Scholar]
- 25.刘春燕, 张建彬, 薛冲, 等. JAK2/STAT3信号通路在低温暴露诱导白色/棕色脂肪组织转化中的作用机制[J]. 空军军医大学学报, 2022, 43(7): 673-678. 10.3390/biom12070927 [DOI] [Google Scholar]; LIU Chunyan, ZHANG Jianbin, XUE Chong, et al. Mechanism of JAK2/STAT3 signaling pathway in the transformation of white/brown adipose tissue induced by cold stress exposure[J]. Journal of Air Force Medical University, 2022, 43(7): 673-678. (in Chinese) 10.3390/biom12070927. 10.3390/biom12070927 [DOI] [Google Scholar]
- 26.JAIS A, BRÜNING J C. Hypothalamic inflammation in obesity and metabolic disease[J]. J Clin Invest, 2017, 127(1): 24-32. 10.1172/jci88878 [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 27.董梅. IL-6对白色脂肪棕色化的作用机制研究[D]. 泰安: 山东农业大学, 2021. [Google Scholar]; DONG Mei. Function and mechanism of IL-6 in browning of white fat[D]. Tai’an: Shandong Agricultural University, 2021. (in Chinese) [Google Scholar]