Abstract
目的
探讨Ras相关蛋白7A（RAB7A）在胃癌组织中的表达对预后的影响及其作用机制。
方法
基于癌症公共数据库和本院接受胃癌根治术的104例患者，分析RAB7A在胃癌及癌旁组织中表达的差异以及其与患者临床病理学参数和预后的关系；采用生物信息学富集分析预测RAB7A影响胃癌侵袭途径的作用和机制；通过慢病毒转染获得过表达和低表达RAB7A的胃癌细胞系（MGC803），采用免疫印迹、划痕及Transwell实验探究RAB7A对ECM降解的影响以及RAB7A对胃癌细胞迁移、侵袭的作用和机制。
结果
癌症公共数据库分析显示胃癌组织中RAB7A的表达高于正常对照组，且负面影响患者生存期（P＜0.01）。本院患者数据显示，胃癌组织中RAB7A的表达高于癌旁组织（P＜0.01），且与外周血胚抗原、糖类抗原19-9水平正相关（P＜0.001）。单因素结合Cox多因素分析显示，RAB7A高表达是影响胃癌5年生存率的独立危险因素（HR：2.882；95% CI：1.459~5.693）；ROC曲线分析显示，以RAB7A相对表达量2.625为截断值，其预测患者术后5年死亡的敏感性为84.62%，特异性为71.15%。生物信息学富集分析显示，RAB7A参与了胃癌组织ECM降解和PI3K/AKT信号激活；体外实验证实，过表达RAB7A可激活胃癌细胞PI3K/AKT信号（P＜0.01），增强基质金属蛋白酶（MMP-2和MMP-9）表达（P＜0.01），以及胃癌细胞迁移和侵袭能力（P＜0.01）。
结论
RAB7A在胃癌组织中高表达并影响患者预后，其作用和激活胃癌PI3K/AKT信号并促进ECM降解和肿瘤侵袭有关。
Keywords: 胃癌, RAB7A, 预后, 侵袭, PI3K/AKT
Abstract
Objective
To explore the expression level of Ras-related protein 7A (RAB7A) in gastric cancer and its prognostic implications.
Methods
Based on data from public databases and a cohort of 104 patients undergoing radical gastrectomy for gastric cancer in our hospital, we analyzed RAB7A expression level in gastric cancer and adjacent tissues and its association with clinicopathological parameters and prognosis of the patients. Bioinformatic analysis was performed to predict the pathways of RAB7A to affect gastric cancer invasion. In gastric cancer MGC803 cells with lentivirus-mediated interference or overexpression of RAB7A, the changes in extracellular matrix (ECM) degradation and cell migration and invasion were analyzed using immunoblotting, wound healing assay and Transwell experiments.
Results
The data from public cancer databases and clinical samples showed a significantly higher expression of RAB7A in gastric cancer tissues than in normal or adjacent tissues (P<0.01) with a close correlation with a poorer patient survival (P<0.01) and a positive correlation with serum carcinoembryonic antigen and carbohydrate antigen 19-9 levels (P<0.001). Univariate and multivariate Cox regression analyses suggested that a high RAB7A expression was an independent risk factor affecting the 5-year survival rate of gastric cancer patients (HR: 2.882; 95% CI: 1.459-5.693). ROC curve analysis showed that at the cut-off value of 2.625, RAB7A expression level had a sensitivity of 84.62% and a specificity of 71.15% for predicting postoperative 5-year mortality of the patients. Bioinformatic analysis suggested that RAB7A was involved in ECM degradation and activation of PI3K/AKT signaling in gastric cancer. MGC803 cells with RAB7A overexpression showed activation of the PI3K/AKT signaling pathway (P<0.01) with enhanced expressions of MMP-2 and MMP-9 (P<0.01) and cell migration and invasion capacities (P<0.01).
Conclusion
RAB7A is highly expressed in gastric cancer tissues and affects the patients' prognosis possibly by activating the PI3K/AKT signaling pathway and enhancing ECM degradation to promote tumor invasion.
Keywords: gastric cancer, Ras-related protein 7A, prognosis, invasion, PI3K/AKT
胃癌是消化系统常见的恶性肿瘤之一[1]，具有高度侵袭性和转移性、预后差等特点，社会危害性巨大[2]。虽然放化疗联合手术治疗已大范围应用于胃癌[3]，但患者术后5年生存率仍然保持在较低水平，而术后复发是造成该困境的主要原因[2, 4]。肿瘤细胞的迁移、侵袭等恶性行为是影响胃癌复发转移的关键因素[5, 6]，且受到一系列分子信号的精密调控[7]，深入发掘该领域有望为胃癌的临床靶向治疗提供新策略。Ras相关蛋白7A（RAB7A）是Ras蛋白家族的一种小型GTP酶，主要存在于晚期内体，控制细胞的转运和迁移[8, 9]。已有研究证明，RAB7A在乳腺癌中高表达并能促进癌细胞的增殖和迁移[10]；RAB7A在胰腺癌组织中呈现过表达，是影响患者预后的独立风险因素[11]。因此，探究RAB7A在肿瘤组织中的表达情况，有望为疾病进展和患者预后评估提供一定的参考。鉴于RAB7A在胃癌中的表达及对患者预后的影响尚未见报道，本研究基于癌症公共数据库和本机构的生物标本库系统，分析RAB7A在胃癌及正常组织中的表达差异及其与临床病理参数和患者预后的关系。通过生物信息学富集预测分析RAB7A的相关功能和作用机制，并结合体外实验进行验证，以期进一步丰富RAB7A的生物学功能，为探究胃癌转移机制的揭示和临床诊疗革新提供新的线索。
1. 资料和方法
1.1. 分析RAB7A在胃癌中的表达及其与患者预后、肿瘤进展的关系
1.1.1. 癌症公共数据库在线分析
采用在线资源GEPIA、UALCAN及Kaplan-Meier Plotter分析来自TCGA的肿瘤样本数据[12]。GEPIA用于分析包括胃癌在内的泛癌谱中RAB7A基因在肿瘤和正常组织之间的差异表达情况。UALCAN用于分析胃癌样本中RAB7A基因表达水平，包括肿瘤不同阶段、不同分级、淋巴结转移水平等相关过程的基因表达情况。Kaplan-Meier Plotter基于mRNA水平的基因探针（211961_s_at，JetSet best probe set），评估RAB7A基因表达对胃癌患者总生存期（OS）、进展后生存期（PPS）的影响[13]。通过cBioPortal数据库获取胃癌中RAB7A的相关性基因，并使用Metascape数据库进行基因本体注释（GO）富集分析及京都基因和基因组百科全书（KEGG）信号通路富集分析[14]。
1.1.2. 研究对象和分组
纳入分析2013年1月~2017年10月于本院收治的胃癌患者临床资料。纳入标准：年龄40~85岁；原发性胃癌；成功施行R0切除；临床资料完整；支持后续回访工作。排除标准：合并远处转移；合并其他恶性肿瘤；合并严重肝肾功能障碍及心脑血管疾病；术前接受过放、化疗或其他分子靶向治疗；患者术后死于胃癌以外的其他因素。共纳入104例胃癌患者临床资料，以患者癌组织中RAB7A相对表达量的中位数为界，将其分为RAB7A高表达组（n=52）和低表达组（n=52）；以患者癌组织中RAB7A相对表达量为截断值，评估胃癌患者术后5年生存率。
1.1.3. 临床病例资料和标本采集
使用本院长期保存的电子病案系统和生物标本库系统收集临床数据和临床标本。患者的临床数据包括：（1）一般临床资料：性别、年龄、肿瘤临床分期、组织学分级、肿瘤大小、T及N分期、手术病理诊断、术前外周血肿瘤标志物癌胚抗原（CEA）、糖类抗原19-9（CA19-9）水平等。（2）生存资料：患者术后5年生存情况（电话随访，随访时间截止到2022年10月），确定其是否发生肿瘤相关性死亡（如有死亡，记录死亡时间）。临床标本采集包括：手术标本病理蜡块：从病理科调取胃癌及对应的癌旁组织蜡块，用于免疫组化的检测；冰冻标本组织：调取《肿瘤生物标本库》中20例胃癌及对应的癌旁组织冰冻标本，用于RAB7A转录水平的检测。本研究已通过蚌埠医学院伦理委员会审批（伦科批字[2022]第183号）。
1.1.4. 免疫组织化学检测
将手术标本病理蜡块制成5 μm厚度的切片，60 ℃烤片2 h，经二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化、抗原修复、封闭后，滴加一抗（RAB7A，1∶500；武汉三鹰）4 ℃孵育过夜，洗去未结合抗体后孵育二抗（北京中杉金桥生物技术有限公司），经DAB显色液显色及苏木精复染细胞核后，进行脱水、透明、封片并采集图片。采用Image J软件计算目的蛋白的积分光密度（IOD）值。
1.1.5. RT-qPCR检测
使用TRIzol（Invitrogen）法对胃癌及癌旁冰冻标本组织中总RNA进行提取，利用反转录试剂盒（Takara）和荧光定量PCR试剂盒（Takara）分别进行反转录和定量分析，内参基因为GAPDH，通过2-△△CT法计算RAB7A的mRNA相对表达量。使用引物均由上海生工公司合成，引物序列如下：GAPDH上游：5'-TGACCTCAACTACATGGTCTACA-3'，下游：5'-CTTCCCATTCTCGGCCTTG-3'；RAB7A上游：5'-GT-GTTGCTGAAGGTTATCATCCT-3'、下游：5'-GCTCC-TA TTGTGGCTTTGTACTG-3'。
1.2. 体外研究调控RAB7A表达对胃癌细胞迁移、侵袭的作用和机制
1.2.1. 胃癌细胞中RAB7A的表达调控和分组
取生长对数期的MGC803细胞接种于完全培养基（含有10%胎牛血清的RPMI 1640）中，待细胞生长至80%以上，进行慢病毒转染。分为3组：低表达组（KD）、过表达组（OE）和对照组（NC）。培养12 h后，更换新鲜的完全培养基，72 h后使用含有嘌呤霉素（1 μg/mL）的完全培养基筛选稳定表达的细胞株，通过免疫印迹实验和RT-qPCR验证慢病毒转染效果。
1.2.2. 免疫印迹检测
采用RIPA裂解液（含有蛋白酶和磷酸化酶抑制剂）提取MGC803细胞的总蛋白，使用BCA试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）检测蛋白质浓度，经SDS-PAGE电泳后放置于转膜仪进行转膜，再用含5%脱脂牛奶TBST封闭2 h，孵育一抗（RAB7A、MMP-2、MMP-9、p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT或GAPDH，1:1000，Abcam），然后孵育二抗（Abcam）。采用多功能凝胶成像系统（BioRad）采集图片，以内参蛋白GAPDH为基准，使用Image J软件计算目的蛋白的相对表达量。
1.2.3. RT-qPCR检测
使用TRIzol（Invitrogen）法分别提取KD组、OE组、NC组MGC803细胞的总RNA，其余步骤及引物同1.1.5。
1.2.4. 细胞迁移、侵袭分析
（1）细胞划痕实验：根据实验分组，加入5×105/孔细胞于6孔板中，待细胞均匀铺满孔板后，用200 μL无菌枪头在孔内垂直划痕，再用PBS洗去刮下的悬浮细胞，并加入无血清培养基培养。于0、24 h在显微镜下观察各孔并拍照，应用Image J软件测量并记录划痕面积[15]。迁移率：指迁移前划痕面积与迁移后划痕面积之差占迁移前划痕面积的百分比[16]。（2）Transwell实验：根据实验分组，将含10%血清培养基加入Transwell小室下室，细胞重悬并稀释后（5×104）接种于上室（8 μm孔径，Corning），培养后经固定（4%多聚甲醛溶液）、染色（1%结晶紫染液），镜下拍照记录迁移细胞数量。进行侵袭实验时，将稀释后的Matrigel基质胶包被于小室底部膜的上室面，再接种细胞，其余步骤与迁移实验相同[17]。
1.3. 统计学分析
采用SPSS 26.0软件对数据进行统计学分析，计量资料以均数±标准差表示，两组间比较采用t检验。计数资料以n（%）表示，组间比较采用χ2检验，多组间比较采用单因素方差分析。相关性分析采用Spearman检验，生存分析采用Kaplan-Meier（K-M）曲线，Log-rank χ2用于组间生存率的比较，受试者工作曲线（ROC）用于分析RAB7A对胃癌术后5年肿瘤致死的诊断价值，影响胃癌术后5年生存率的多因素分析采用Cox比例风险回归模型（Enter法）。所有统计检验均为双侧，P＜0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1. 公共数据库分析RAB7A在胃癌中的表达及与患者肿瘤进展、生存期的关系
TCGA数据库GEPIA分析显示，RAB7A在胃癌组织中的表达高于正常组织（P＜0.01，图 1A、B）。通过UALCAN在线分析发现，在不同肿瘤阶段、分级、淋巴结转移程度的胃癌组织中，RAB7A表达均高于正常对照组（P＜0.01，图 1C~E）。Kaplan-Meier Plotter在线分析发现，高表达组胃癌患者OS、PPS短于低表达组（P＜0.01，图 1F、G）。
图 1.
公共数据库分析RAB7A在胃癌中高表达且与患者肿瘤进展、生存期相关
Analysis of public databases showing a high RAB7A expression in gastric cancer in relation with tumor progression and patient survival. A, B: Expression level of RAB7A gene in pan-cancer tissues and gastric cancer tissues in GEPIA database (Red points: upregulated gene expression; green points: downregulated gene expression; red box represents T; green box represents N); C-E: Expression level of RAB7A gene in tumor specimens in different cancer stages with different tumor grades and status of lymph node metastasis in UALCAN database. F, G: Analysis of the relationship between RAB7A expression levels and overall survival (OS) and post-progression survival (PPS) using Kaplan- Meier Plotter. T: tumor samples; N: normal samples; STAD: stomach adenocarcinoma; ACC: adrenocortical carcinoma; BLCA: bladder urothelial carcinoma; BRCA: breast invasive carcinoma; CESC: cervical squamous cell carcinoma and endocervical adenocarcinoma; CHOL: cholangiocarcinoma; COAD: colon adenocarcinoma; DLBC: lymphoid neoplasm diffuse large b-cell lymphoma; ESCA: esophageal carcinoma; GBM: glioblastoma multiforme; HNSC: head and neck squamous cell carcinoma; KICH: kidney chromophobe; KIRC: kidney renal clear cell carcinoma; KIRP: kidney renal papillary cell carcinoma; LAML: acute myeloid leukemia; LGG: brain lower grade glioma; LIHC: liver hepatocellular carcinoma; LUAD: lung adenocarcinoma; LUSC: lung squamous cell carcinoma; MESO: mesothelioma; OV: ovarian serous cystadenocarcinoma; PAAD: pancreatic adenocarcinoma; PCPG: pheochromocytoma and paraganglioma; PRAD: prostate adenocarcinoma; READ: rectum adenocarcinoma; SARC: sarcoma; SKCM: skin cutaneous melanoma; TGCT: testicular germ cell tumors; THCA: thyroid carcinoma; THYM: thymoma; UCEC: uterine corpus endometrial carcinoma; UCS: uterine carcinosarcoma; UVM: uveal melanoma; **P<0.01 vs normal; ***P<0.001 vs normal; #P<0.05 vs Grade1.
2.2. 临床病例分析RAB7A在胃癌组织中的表达
免疫组化结果显示，与癌旁组织相比，RAB7A在胃癌组织中的表达明显增高，且主要表达于癌细胞胞质（P＜0.01，图 2A、B）。RT-qPCR检测结果显示，胃癌组织中RAB7A的转录水平高于癌旁组织（P＜0.01，图 2C）。
图 2.
胃癌及癌旁组织中RAB7A的表达情况
RAB7A expression in clinical samples of gastric cancer and adjacent tissues. A: RAB7A expression in gastric cancer and adjacent tissues detected by immunohistochem-istry. B: Analysis of relative IOD value of RAB7A. C: Analysis of relative RAB7A mRNA expression. **P<0.01 vs cancer group.
2.3. RAB7A的表达与外周血CEA、CA19-9水平的相关性
胃癌组织中RAB7A相对表达量与外周血肿瘤标志物（CEA及CA19-9）水平呈正相关关系[CEA（r= 0.688，P＜0.001），CA19-9（r=0.563，P＜0.001），图 3]。
图 3.
胃癌组织中RAB7A与外周血CEA及CA19-9之间的相关性分析
Correlation of RAB7A with CEA (A) and CA19-9 levels (B) in peripheral blood of gastric cancer patients.
2.4. RAB7A的表达与临床病理参数的关系
以胃癌组织中RAB7A相对表达量中位值（IOD= 2.715）为界，IOD≥2.715的患者分为高表达组（n=52），IOD＜2.715的患者分为低表达组（n=52）。结果显示高表达组中T3-4期、N2-3期、CEA≥5 μg/L、CA19-9≥37 kU/L的患者占比均高于低表达组（P＜0.05，表 1）。
表 1.
胃癌组织中RAB7A表达量与临床病理参数间的关系
Relationship between RAB7A expression in gastric cancer tissues and clinicopathological parameters of the patients
| Clinicopathological parameters | n | RAB7A | χ2 | P | |
| Low expression (n=52) | High expression (n=52) | ||||
| Gender | 0.502 | 0.478 | |||
| Female | 23 | 13(56.52%) | 10(43.48%) | ||
| Male | 81 | 39(48.15%) | 42(51.85%) | ||
| Age (year) | 0.399 | 0.527 | |||
| ＜60 | 33 | 18(54.55%) | 15(45.45%) | ||
| ≥60 | 71 | 34(47.89%) | 37(52.11%) | ||
| Tumor size (cm) | 0.962 | 0.327 | |||
| ＜5 | 51 | 23(45.10%) | 28(54.90%) | ||
| ≥5 | 53 | 29(54.72%) | 24(45.28%) | ||
| Histological grading | 1.943 | 0.163 | |||
| G1-G2 | 61 | 27(44.26%) | 34(55.74%) | ||
| G3-G4 | 43 | 25(58.14%) | 18(41.86%) | ||
| T Stage | 9.979 | 0.002 | |||
| T1-T2 | 58 | 37(63.79%) | 21(36.21%) | ||
| T3-T4 | 46 | 15(32.61%) | 31(67.39%) | ||
| N Stage | 5.547 | 0.019 | |||
| N0-N1 | 50 | 31(62.00%) | 19(38.00%) | ||
| N2-N3 | 54 | 21(38.89%) | 33(61.11%) | ||
| CEA (μg/L) | 5.613 | 0.018 | |||
| ＜5 | 46 | 29(63.04%) | 17(36.96%) | ||
| ≥5 | 58 | 23(39.66%) | 35(60.34%) | ||
| CA19-9 (kU/L) | 7.385 | 0.007 | |||
| ＜37 | 78 | 45(57.69%) | 33(42.31%) | ||
| ≥37 | 26 | 7(26.92%) | 19(73.08%) | ||
2.5. RAB7A的表达对胃癌患者术后5年生存率的影响
通过K-M生存分析显示，与RAB7A低表达组相比，高表达组患者术后5年生存率显著降低（Log-rank χ2=29.100，P＜0.001，图 4）。
图 4.
K-M生存曲线分析RAB7A表达量对胃癌患者术后5年生存率的影响
Kaplan-Meier survival analysis of the effect of RAB7A expression on 5-year survival rate of gastric cancer patients after gastrectomy.
2.6. 影响胃癌患者术后5年生存率的单因素及Cox多因素分析
单因素结合Cox多因素分析显示，影响胃癌患者术后5年生存率的独立危险因素包括RAB7A高表达、T3-4期、N2-3期、CEA≥5 μg/L及CA19-9≥37 kU/L（P＜0.05，表 2）。
表 2.
单因素及Cox多因素分析胃癌患者术后5年生存率的影响因素
Univariate and Cox multivariate analyses of the factors affecting 5-year survival rate of gastric cancer patients
| Factor | Univariate analysis | Multivariate analysis | ||||
| Log-rank χ2 | P | HR | 95% CI | P | ||
| Gender (female vs male) | 0.821 | 0.365 | - | - | - | |
| Age (≥60 year vs ＜60 year) | 0.590 | 0.442 | - | - | - | |
| Tumor size (≥5 cm vs ＜5 cm) | 0.184 | 0.668 | - | - | - | |
| RAB7A expression (high vs low) | 29.100 | ＜0.001 | 2.882 | 1.459-5.693 | 0.002 | |
| G Stage (G3-G4 vs G1-G2) | 1.516 | 0.218 | - | - | - | |
| T Stage (T3-T4 vs T1-T2) | 18.637 | ＜0.001 | 1.878 | 1.031-3.422 | 0.040 | |
| N Stage (N2-N3 vs N0-N1) | 6.899 | ＜0.001 | 2.077 | 1.158-3.724 | 0.014 | |
| CEA (≥5 μg/L vs ＜5 μg/L) | 23.681 | ＜0.001 | 2.905 | 1.397-6.042 | 0.004 | |
| CA19-9 (≥37 kU/L vs ＜37 kU/L) | 34.774 | ＜0.001 | 2.314 | 1.226-4.366 | 0.010 | |
2.7. RAB7A表达对评估胃癌患者术后5年生存率的预测价值
以RAB7A相对表达量2.625为截断值（约登指数为55.77%），预测患者术后5年死亡的敏感性为84.62%，特异性为71.15%，曲线下面积为0.798（P＜0.001，图 5）。
图 5.
ROC曲线分析RAB7A的表达对胃癌患者术后5年生存情况的预测价值
ROC curve analysis of the predictive value of RAB7A expression for 5-year survival rate of gastric cancer patients after gastrectomy.
2.8. GO和KEGG富集预测分析RAB7A的作用途径和机制
GO富集预测分析发现，RAB7A的生物学功能与调控细胞外基质（ECM）有关（P＜0.05，图 6A）。KEGG富集分析发现，RAB7A参与PI3K/AKT信号通路的调控（P＜0.05，图 6B）。
图 6.
RAB7A功能和作用机制的预测分析
Functions and mechanisms of action of RAB7A. A: GO enrichment analysis. B: KEGG enrichment analysis.
2.9. RAB7A影响ECM降解
通过慢病毒转染，获得RAB7A过表达和低表达的MGC803细胞系（P＜0.05，图 7A~C）。免疫印迹实验显示，过表达RAB7A促进MMP-2、MMP-9的表达（P＜0.01），低表达则抑制MMP-2、MMP-9的表达（P＜0.05，图 7D、E）。
图 7.
RAB7A影响ECM降解
RAB7A expression level affects ECM degradation. A, B: RAB7A protein expression in MGC803 cells analyzed by Western blotting. C: RT-qPCR analysis of RAB7A mRNA expression in MGC803 cells. D, E: MMP-2 and MMP-9 protein expression in MGC803 cells. *P<0.05, **P<0.01 vs NC group, n=4, KD: Knockdown; OE: Overexpression.
2.10. RAB7A影响MGC803细胞迁移和侵袭
细胞划痕结果显示，与NC组相比，KD组迁移率较低，而OE组较高（P＜0.01，图 8A、B）；Transwell实验发现，KD组迁移、侵袭的细胞数量较NC组减少，而OE组增加（P＜0.05，图 8C、D）。
图 8.
RAB7A对MGC803细胞迁移、侵袭的影响
Effect of RAB7A expression level on migration and invasion of MGC803 cells. A: Wound healing assay of MGC803 cells with RAB7A knockdown or overexpression. B: Quantitative analysis of the cell migration rate. C: Cell migration and invasion ability of the cells analyzed with Transwell assay. D: Quantitative analysis of the cell migration and invasion ability of the cells. *P<0.05, **P<0.01 vs NC group, n=4, KD: Knockdown; OE: Overexpression.
2.11. RAB7A激活PI3K/AKT信号通路
免疫印迹结果显示，在MGC803细胞中，RAB7A过表达促进PI3K、AKT的磷酸化（P＜0.01）；而RAB7A低表达抑制PI3K、AKT的磷酸化（P＜0.01，图 9）。
图 9.
RAB7A激活PI3K/AKT信号通路
High RAB7A expression activates the PI3K/AKT signaling pathway. A, B: Western blotting for detecting p-PI3K and p-AKT protein expressions in MGC803 cells. **P<0.01 vs NC group, n=4, KD: Knockdown; OE: Overexpression.
3. 讨论
本研究基于癌症公共数据库和我院生物标本库系统分析发现，RAB7A在胃癌组织中高表达，且影响患者临床进展和远期预后；进一步的体外研究证实，RAB7A可能通过激活PI3K/AKT信号通路降解ECM进而促进胃癌细胞的迁移和侵袭。既往研究表明，RAB7A在乳腺癌、胰腺癌等肿瘤组织中表达升高，并参与了肿瘤细胞的恶性进展[18, 19]，而本研究结合生物信息学和临床病例分析发现，RAB7A在胃癌组织中同样高表达。通过对纳入患者的临床病理参数进行分析发现，RAB7A高表达组患者T3-4期、N2-3期、CEA≥5 μg/L及CA19-9 ≥37 kU/L的比例显著高于低表达组，提示RAB7A高表达与胃癌临床进展密切相关。外周血肿瘤标志物是临床上常用于反映肿瘤进展和患者预后的重要指标[20, 21]，而本研究发现胃癌组织中RAB7A表达水平与外周血CEA、CA19-9水平呈正相关关系，提示RAB7A对胃癌恶性进展具有一定的辅助评估价值。本研究利用K-M生存曲线评估RAB7A对胃癌患者术后5年生存率的影响，结果显示RAB7A高表达组患者术后5年生存率显著低于低表达组；且进一步的单因素及Cox多因素分析证明RAB7A高表达是影响胃癌患者术后5年生存率的独立风险因素。最后，我们尝试分析RAB7A在胃癌临床诊疗中的实际应用价值，ROC曲线分析显示以RAB7A相对表达量2.625为截断值，预测患者术后5年死亡的敏感性为84.62%，特异性为71.15%，准确度为0.798，提示胃癌组织中RAB7A表达水平对患者手术预后评估具有一定的预判价值。
以上数据表明RAB7A高表达能够影响胃癌患者的临床进展和远期预后，然而其具体的作用途径尚不明确。ECM降解在肿瘤细胞的浸润和转移等生物学过程中发挥重要作用[22, 23]，本研究利用GO富集分析发现，RAB7A的功能与ECM的调控有关，进一步的划痕和Transwell实验证明过表达RAB7A能够促进胃癌细胞的迁移和侵袭，低表达则抑制。
为了阐明RAB7A作用于胃癌细胞的机制，我们通过KEGG富集分析发现RAB7A与PI3K/AKT信号有关。有研究显示，PI3K/AKT可促进MMP的表达[24, 25]，而MMP-2[26]和MMP-9[27]的过表达可导致ECM降解，使肿瘤细胞更易穿过基底膜，从而促进其迁移和侵袭[28, 29]。本研究通过体外实验分析发现，过表达RAB7A能够激活PI3K/AKT信号通路，增强MMP-2、MMP-9蛋白的表达，而低表达RAB7A则会减少MMP-2、MMP-9蛋白的表达。鉴于RAB7A作用于胃癌细胞的分子机制尚不清楚，我们的实验结果证明RAB7A部分通过激活PI3K/AKT途径促进胃癌细胞的迁移和侵袭。
本研究发现RAB7A在胃癌中高表达并影响患者远期预后，这为胃癌患者临床预后的评估提供了新的参考。通过泛癌基因数据分析发现RAB7A在胃癌、胰腺癌、黑色素瘤等中呈现高表达，这对于其他肿瘤的研究具有一定参考价值。此外，我们发现RAB7A部分通过PI3K/AKT信号促进胃癌细胞的迁移、侵袭，这也提升了对RAB7A生物学功能的认识。
由于生物信息学数据库更新不及时，且本研究纳入的临床样本量有限，本文所得结果仍需更多样本量加以验证。此外，我们只对PI3K/AKT信号通路进行了初步验证，尚不能排除RAB7A通过其他途径影响胃癌转移的可能。
综上所述，RAB7A在胃癌组织中高表达与患者预后不良相关，其部分通过PI3K/AKT信号途径降解ECM进而促进胃癌细胞的迁移和侵袭。因此，RAB7A有望为胃癌的分子靶向治疗提供新的方向。
Biography
张敏，在读硕士研究生，E-mail: zmzmin@126.com
Funding Statement
安徽省高校协同创新项目（GXXT-2020-020）；癌症转化医学安徽省重点实验室开放课题（KFDX202202）
Contributor Information
张 敏 (Min ZHANG), Email: zmzmin@126.com.
胡 建国 (Jianguo HU), Email: jghu9200@bbmc.edu.cn.
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