二甲双胍缓解小鼠放射性皮炎引起的病理性疼痛：基于抑制p38 MAPK/NF-κB信号通路

Abstract

目的

探讨二甲双胍(Met)对放射性皮炎病理性疼痛的治疗作用及其可能机制。

方法

将32只SPF级雄性ICR小鼠随机分为4组, 即正常对照组(Control组)、放射性皮炎模型组(Model组)、二甲双胍干预组(Met组)及阳性药物加巴喷丁组(GBP组), 8只/组。小鼠模型制备成功后, Met组小鼠采用腹腔注射方式给药, 每次剂量为200 mg/(kg?d), 连续给药16 d, GBP组加巴喷丁灌胃[100 mg/(kg?d)], 连续灌胃16 d, Control组及Model组小鼠腹腔内注射与二甲双胍组等体积生理盐水。末次给药后评估各组小鼠放射性皮炎分级情况; 分别于建模前及建模后第1、4、8、12、16天观察并记录各组小鼠建模侧(右侧)后足机械缩足反射阈值(MWT)和热缩足反射潜伏期(TWL); Western blot检测脊髓L₄~L₆节段p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)、核转录因子-κB p65(NF-κB p65)、磷酸化(p)-p38MAPK、磷酸化(p)-NF-κB p65蛋白表达。ELISA检测脊髓组织中白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平。

结果

与Control组相比, Model组、Met组及GBP组小鼠右后足表现出明显的放射性皮炎症状(P<0.05);与Model组及GBP组相比, Met组放射性皮炎症状减轻(P<0.05)。与Control组相比, Model组小鼠MWT和TWL降低(P<0.05);与Model组比较, Met组及GBP组MWT和TWL明显提高(P<0.05)。与Model组相比, Met组小鼠脊髓组织中p-p38MAPK及p-NF-κB p65蛋白表达降低(P<0.05), 其炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α水平也明显降低(P<0.05)。

结论

二甲双胍可缓解放射性皮炎小鼠的病理性疼痛症状, 且该作用可能是通过抑制p38MAPK/NF-κB信号通路的活化实现的。

放射性皮炎是放疗最常见的副作用之一，在接受放疗的患者中，多达95%患者可能会经历某种形式的放射性皮炎或放射线引起的皮肤损伤^[1]。在放射性皮炎的各个阶段，均可能出现不同程度的疼痛症状^{[2, 3]}。因其疼痛的发病机制复杂，放射性皮炎引起的病理性疼痛一直是治疗的难点之一。目前临床上以对症治疗为主，常用的药物包括阿片类镇痛药、局麻药、非甾体类抗炎药等，但疗效均不理想^[4]。

二甲双胍因其降糖效果良好且不良反应少，已成为临床上治疗2型糖尿病最广泛使用的降糖药之一^[5]。近年来，二甲双胍降糖以外的作用逐渐被重视，二甲双胍还具有多种药理特性，包括抗炎、抗癌、抗氧化、镇痛等作用^[6-11]。在接受放疗的小鼠脊髓组织中IL-1β、IL-6、TNF-α等炎症性细胞因子的表达增加^[7]。同时有文献报道，这些炎性细胞因子的释放又可诱导神经元和胶质细胞中p38MAPK的磷酸化^[12]。p38MAPK的磷酸化可促使NF-κB p65的核转位及下游信号通路的激活，导致病理性疼痛的发生^[10]。有研究表明，二甲双胍通过抑制脊髓p38 MAPK磷酸化、降低促炎细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表达，增强吗啡的镇痛效果^[13]。二甲双胍亦可抑制脊髓组织中IL-1β、IL-6等炎症因子的释放缓解坐骨神经结扎诱发的神经病理性疼痛^[5]。然而，目前尚未见二甲双胍对放射性皮炎引起的病理性疼痛作用效果的相关报道。二甲双胍能否通过抑制p38 MAPK磷酸化，下调NF-κB p65的核转位，进而降低相关炎症因子的表达而缓解放射性皮炎的病理性疼痛尚不明确。

本研究拟通过评价二甲双胍对放射性皮炎小鼠病理性疼痛的治疗作用，观察其对脊髓L₄~L₆节段中p38MAPK、NF-κB p65蛋白表达的影响，对脊髓L₄~L₆节段炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α水平的影响，探讨二甲双胍对放射性皮炎的镇痛的作用及其可能的机制，为临床研究提供参考。

1. 材料和方法

1.1. 材料

1.1.1. 主要仪器及试剂

照射仪器：瓦里安600C电子直线加速器（美国瓦里安），von Frey痛阈测试包（上海玉研科学仪器有限公司），辐射热测试仪（ⅡTC Life Science），BIO-RAD Powerpac HC电泳仪（BIO-RAD），二甲双胍（MCE），加巴喷丁（江苏恒瑞医药股份有限公司，国药准字H20030662，规格：0.1 g），水合氯醛（北京雷根生物技术有限公司），SDS-PAGE凝胶快速配制试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒、ECL发光法试剂盒、封闭液、IL-1β、IL-6、TNF-α ELISA检测试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司），兔单克隆抗体NF-κB p65、兔单克隆抗体p38MAPK、磷酸化兔单克隆抗体p-p38MAPK、磷酸化兔单克隆抗体p-NF-κB p65、鼠单克隆抗体GAPDH、辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔二抗及辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗鼠二抗（Abcam）。

1.1.2. 实验动物

6~8周龄健康雄性ICR小鼠，SPF级，32只，体质量18~22 g，由南京医科大学医药实验动物中心提供，动物许可证号：SYXK（苏）2015-0015，动物合格证书编号：NYD-L-2019-029。动物饲养于室温23±2 ℃、相对湿度（50±5）%，水、食自由摄取，适应性喂养1周，整个实验操作过程严格遵守《中华人民共和国实验动物管理条例》和《关于善待实验动物的指导性意见》的相关规定，并经连云港市东方医院伦理委员会批准（伦理审批号：2022-035-01）。

1.2. 方法

1.2.1. 分组处理及放射性皮炎模型的制备

将32只小鼠随机分为正常对照组（Control组）、放射性皮炎模型组（Model组）及二甲双胍干预组（Met组），阳性药物加巴喷丁组（GBP组），8只/组。除Control组外，其余小鼠采用直线加速器照射的方式于右后足皮肤处建立放射性皮炎模型。放射前对小鼠进行麻醉，将小鼠俯卧位固定于小鼠固定板上，右后足轻轻伸展，并用医用胶带粘贴。除右后足外，其余小鼠身体用铅盒覆盖，铅盒壁厚为2 cm，以保护全身免受辐射。采用直线加速器以6 mV X射线，源皮距100 cm处照射大鼠右后足皮肤，射野为2.5 cm×20 cm的矩形野，单次剂量为30 Gy，建立急性放射性皮炎模型^{[12, 13]}。对Met组小鼠每天8: 00进行腹腔内注射二甲双胍200 mg/(kg·d)^[11]，连续给药16 d。阳性药物组每天8: 00予以加巴喷丁100 mg/(kg·d)灌胃，连续灌胃16 d。对Control组及Mode组小鼠腹腔内注射与二甲双胍等体积生理盐水，持续16 d。

1.2.2. 小鼠放射性皮炎分级

参考人类急性放射反应评分标准（RTOG/EORTC），将小鼠放射性皮炎分为0~5级：0级为无变化；1级为出现点、片状红斑和干性脱皮；2级为出现明显面积红斑、少量湿性脱皮、轻度水肿；3级为中度以上水肿，大面积的湿性脱皮；4级为大面积皮肤溃疡、出血、坏死；5级为因放射性皮炎死亡。末次给药后，观察并记录小鼠的一般情况及皮肤改变情况。

1.2.3. 疼痛行为学测定

分别于建模前1 d（0 d）及建模后第1、4、8、12、16天，每天15: 00进行疼痛行为学检测，环境安静舒适，室温保持23±2 ℃，通风良好。检测前先将小鼠放置在检测室内适应30 min，依次测定MWT及TWL，间隔时间为1 h。所有检测由同一检测人员完成。

采用Von Frey法测定MWT: 在上述环境中将小鼠单独放置于带金属网底的透明玻璃罩内，待小鼠安静30 min后用不同标号的Von Frey丝垂直刺激右后足底。记录产生快速缩足、抬足、抖动或舔舐反应时所对应的Von Frey丝标号。每种标号的Von Frey丝均被测定至少出现3次阳性反应或3次无反应，每次刺激均间隔至少15 s。逐渐增加或降低刺激强度至同一标号Von Frey丝出现至少3次阳性反应，记录此时所用的Von Frey丝的标号作为MWT^{[5, 14]}。

TWL的测定：在上述环境中将小鼠单独放置于透明有机玻璃笼内，待小鼠适应30 min后用辐射热测试仪照射小鼠右后足足底，当产生快速缩足、扬足或舔足反应时立即停止照射，并记录下此时照射的持续时间，自动切断时间为30 s。重复测量5次，每次间隔5 min，将5次的持续照射时间取平均值作为TWL^{[5, 14]}。

1.2.4. 法检测L₄~L₆脊髓组织蛋白质表达

末次行为学检测结束后，深度麻醉小鼠，分离并取出小鼠L₄~L₆脊髓脊髓组织，加入预冷的蛋白裂解液、蛋白酶抑制剂及磷酸酶抑制剂，冰上剪碎脊髓后，超声进一步打碎，冰上静置30 min后，4 ℃ 15 000 r/min离心20 min后取其上清。样品的蛋白质浓度用BCA蛋白分析试剂盒进行检测。加入loading buffer，100 ℃煮样5 min。用SDS-PAGE电泳分离蛋白质样品，将蛋白质电转至PVDF膜上，封闭液室温封闭2 h。加入p38MAPK、NF-κB p65、pp38MAPK、p-NF-κB p65一抗（浓度均为1∶1000）4 ℃孵育过夜。一抗孵育之后，TBST缓冲液洗膜3次，每次15 min，加入二抗（兔抗，浓度1∶2000）室温孵育1 h，TBST缓冲液洗膜3次，15 min/次。GAPDH作为内参对照。目的蛋白与内参灰度值之比表示目的蛋白的表达水平。ECL化学发光试剂对蛋白质进行可视化处理，Image J软件分析蛋白条带，测定灰度值。

1.2.5. ELISA检测小鼠L₄~L₆脊髓组织中IL-1β、IL-6和TNF-α的含量

末次行为学检测结束后，给予过量水合氯醛深度麻醉小鼠，分离并取出小鼠L4~L6脊髓组织，用预冷的磷酸盐缓冲盐溶液（PBS；0.01 mol/L，pH=7.4）冲洗L₄~L₆脊髓组织，冰上剪碎后，超声进一步打碎，在4 ℃条件下2500 r/min离心15 min，取上清。采用酶联免疫法，使用ELISA试剂盒检测脊髓组织中TNF-α、IL-1β和IL-6的含量，具体操作按试剂盒说明书进行。

1.3. 统计学方法

采用SPSS 26.0软件进行统计学分析。行为学数据资料、免疫印迹数据资料以均数±标准差表示。多组间比较采用单因素方差分析，等级资料进行秩和检验，进一步用秩变换分析方法进行组间比较，P<0.05为差异具有统计学意义。

2. 结果

2.1. 各组小鼠放射性皮炎分级比较

Control组小鼠右后足皮肤及毛发未见异常。Model组及GBP组小鼠右后足大面积皮肤溃疡，渗出明显，部分足趾末端坏死脱落，皮肤反应在3~4级，以4级反应为主；Met组小鼠右后足皮肤出现片状红斑，部分出现轻度水肿，皮肤反应在1~3级，以1级为主（图 1）。各组小鼠放射性皮炎的总体分布差异具有统计学意义（χ²=44.00, P<0.001）；组间比较显示，Control组与Model组的差异有统计学意义（P<0.01），GBP组与Model组差异无统计学意义（P>0.05），Met与Model组及GBP组相比，差异均有统计学意义（P<0.01，表 1）。

图 1.

各组小鼠放射性皮炎分级比较

Grades of radiation dermatitis in mice of each group.

表 1.

各组小鼠放射性皮炎分级（例）

Grading of radiation dermatitis in mice of each group (sample, n=8)

Group	Radiation dermatitis grades
	Grade 0	Grade 1	Grade 2	Grade 3	Grade 4
**P<0.01 vs Control group; ##P<0.01 vs Model group; ◆◆P<0.01 vs Met group.
Control	8	0	0	0	0
Model	0	0	1	2	5	**
Met	0	5	2	1	0	**##
GBP	0	0	1	3	4	**◆◆

2.2. 各组小鼠右后足MWT和TWL比较

实验过程中，Control组每个时间检时间点的MWT和TWL均无显著变化。放射性皮炎模型制备成功后，Model组、Met组及GBP组小鼠的MWT和TWL均明显低于Control组（P<0.05）。Met组在建模后1 d与Model组比较MWT无明显差异（P>0.05），TWL有明显差异（P<0.01）。在治疗后4~16 d，Met组小鼠右后足MWT和TWL均明显高于Model组（P<0.01），Met组及GBP组相比，MWT和TWL差异无统计学意义（P>0.05，图 2）。

图 2.

各组小鼠右后足MWT和TWL比较

Comparison of mechanical withdrawal threshold (MWT) and thermal withdrawal threshold (TWL) of the right hind foot in each group (Mean±SE, n=8). *P<0.05, **P<0.01 vs Control group; ^##P<0.01 vs Model group.

2.3. 各组小鼠L₄~L₆段脊髓组织中p-p38MAPK和p-NF-κB p65蛋白表达的比较

Western blot结果显示，与Control组比较，Model组小鼠L₄~L₆段脊髓组织中p-p38MAPK及p-NF-κB p65蛋白表达明显增高（P<0.01）；经Met治疗16 d后，Met组小鼠L₄~L₆段脊髓组织中p-p38MAPK及p-NF-κB p65蛋白表达明显低于Model组（P<0.01）；GBP组与Met组相比，p-NF-κB p65蛋白表达增高（P<0.05），p-p38MAPK蛋白表达差异无统计学意义（P>0.05，图 3）。

图 3.

各组小鼠L₄~L₆段脊髓组中p-p38MAPK、p-NF-κB p65蛋白表达情况

Expression of p-p38MAPK and p-NF-κB p65 protein in L₄-L₆ spinal cord in each group (Mean±SD, n=4). A: Western blots of p-p38MAPK and p38MAPK. B: Relative expression level of p-p38MAPK. C: Western blots of p-NF-κB p65 and NF-κB p65. D: Relative expression level of p-NF-κB p65. **P<0.01 vs Control group; ^##P<0.01 vs Model group; ^◆P<0.05 vs Met group.

2.4. 各组小鼠L₄~L₆段脊髓组织中IL-1β、IL-6和TNF-α表达水平比较

与Control组相比，Model组小鼠L₄~L₆段脊髓组织中IL-1β、IL-6和TNF-α的表达水平明显升高（P<0.01）；经二甲双胍治疗16 d后，IL-1β、IL-6和TNF-α的表达水平均明显低于Model组（P<0.01)；GBP组与Met组相比，差异有统计学意义（P<0.01，图 4）。

图 4.

各组小鼠L₄~L₆段脊髓组织中IL-1β、IL-6和TNF-α表达水平比较

IL-1β (A), IL-6 (B) and TNF-α (C) expression levels in the L₄-L₆ spinal cord in each group (Mean±SD, n=4). **P<0.01 vs Control group; ^##P<0.01 vs Model group; ^◆◆P<0.01 vs Met group.

3. 讨论

现代放疗中使用的高能X射线会产生直接和间接电离事件，在杀伤癌细胞同时也会损伤正常组织，放射性皮炎是放射治疗最常见的副作用之一^[15]。研究发现，在放射治疗期间，会产生一些炎症性细胞因子的表达增加，这些细胞因子包括IL-1β、IL-6、TNF-α等^[16]。这些炎性细胞因子可引起神经元和胶质细胞中p38 MAPK的磷酸化，并促进神经性和炎性疼痛的发生^[17]。本实验结果表明，放射性皮炎模型组小鼠L₄~L₆脊髓组织中IL-1β、、IL-6和TNF-α水平显著高于正常对照组，模型组的p38MAPK磷酸化水平明显升高。同时，模型组小鼠MWT和TWL均明显降低，疼痛症状加重。结合上述研究提示，放射性皮炎引起的病理性疼痛可能与放射引起的IL-1β、IL-6和TNF-α表达增加及p38MAPK的磷酸化相关。

丝裂酶原活化蛋白激酶(MAPKs) 级联反应通路是重要的细胞内信号转导通路之一，p38MAPK是MAPK家族的成员之一, 参与多种生理过程的调节，近年来研究发现，与神经病理性疼痛有关的多条信号通路汇集于p38MAPK，其在痛觉信号传导方面发挥重要作用^[18]。p38MAPK可被一系列刺激因子激活, 如炎症细胞因子和生长因子等^{[19, 20]}。磷酸化激活的p38 MAPK又可进一步导致促炎因子如IL-1β、TNF-α等的产生^[21]。有研究报道，在链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠中，p38 MAPK信号通路的激活以及炎症因子的释放增多可加剧疼痛症状^{[21, 22]}。鞘内注射p38抑制剂SB203580可减轻神经痛模型中的疼痛症状^[17]。既往研究发现, p38 MAPK可以调节NF-κB的转录活性。p38MAPK的激活导致NF-κB p65的核转位和下游信号通路的激活，导致疼痛的发生^[23]。NF-κB是一种重要的核转录因子，由p50和p65两种不同的亚单位构成，平时存在于神经元细胞和神经胶质细胞内，处于非活性状态，受多种因素刺激活化后，NF-κB p65可发生磷酸化，转位入核，参与调节多种靶基因，激活其下游的炎症因子信号通路，参与神经病理性疼痛的发生与维持。研究显示CCI模型中背根神经节内的NF-κB表达增加，而抑制小胶质细胞内的NF-κB的表达，则可减轻坐骨神经慢性压迫性损伤导致的疼痛^[23]。鞘内注射NF-κB抑制剂脯氨酸二硫氨甲酸酯能够显著缓解脊神经结扎诱导的神经病理性疼痛^[24]。NF-κB活化后，增强了TNF-α和IL-1β的转录，TNF-α和IL-1β释放增多，进而再次激活NF-κB，NF-κB活化后又可使IL-6合成和释放增多，产生恶性循环，加剧痛觉敏化^[25]。促炎性细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α与神经病理性疼痛关系密切，是与疼痛敏化最为密切的炎症因子。有研究表明，神经损伤后，活化的星形胶质细胞和小胶质细胞释放IL-1β、IL-6和TNF-α等，诱导神经病理性疼痛的发生^[26]。本实验结果显示，放射后16 d模型组小鼠L₄~L₆脊髓组织中p-p38MAPK和p-NF-κB p65蛋白水平升高，伴随着造模小鼠右后足疼痛症状加重，结合上述报道，提示本研究中放射性皮炎所引起的病理性疼痛可能与p38 MAPK/NF-κB信号通路的活化密切相关。且促炎性细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的释放增多参与了疼痛的产生及维持。

二甲双胍是临床中广泛应用的口服双胍类降糖药物，具有良好的降糖效果。有研究报道，二甲双胍还具有神经保护和抗炎作用，可减轻神经性病理性疼痛和痛觉过敏^[27]。二甲双胍可抑制脊髓p38 MAPK磷酸化上调、NF-κB核转位和促炎细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表达，增强吗啡的镇痛效果^[28]。本研究中，经放射的小鼠给予二甲双胍治疗后，治疗组小鼠L₄~L₆脊髓组织中p-p38MAPK和p-NF-κB p65蛋白表达水平均显著低于放射性皮炎模型组，IL-1β、IL-6和TNF-α促炎细胞因子水平亦明显低于模型组，同时MWT和TWL均明显降低，疼痛症状减轻。提示二甲双胍发挥镇痛作用，可能是通过抑制p38 MAPK/NF-κB信号通路活化及减少IL-1β、IL-6和TNF-α的表达实现的。

综上所述，二甲双胍可缓解小鼠放射性皮炎引起的病理性疼痛，且该作用可能是通过抑制p38 MAPK/NF-κB信号通路活化，降低促炎细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α的水平实现的。这为临床治疗放射性皮炎引起的病理性疼痛提供了新思路。

Funding Statement

连云港市科技计划（社会发展）项目（SF2122）