淫羊藿素通过调控铁死亡增加鼻咽癌细胞的放射敏感性

Abstract

Objective

To explore the radiosensitizing effect of icaritin on nasopharyngeal carcinoma (NPC) cells and the underlying mechanism.

Methods

MTT assay and clonal formation assay were used to evaluate the effect of icaritin on proliferation of human NPC HONE1 and HNE1 cells. The effects of icaritin treatment, γ-ray radiation, or both on production of reactive oxygen species (ROS), cell cycle distribution and apoptosis of the NPC cells were assessed using flow cytometry. The expressions of DNA damage markers γ-H2AX, cycle-related proteins CDC25C, p-CDC25C and cyclin B1, and ferroptosis markers ACSL4 and GXP4 were detected using Western blotting. A nude mouse model bearing subcutaneous HONE1 cell xenograft was used to observe the effect of icaritin and radiation on tumor growth.

Results

Icaritin dose-dependently inhibited the viability of the NPC cells and enhanced the inhibitory effect of radiation on cell proliferation. Flow cytometry and Western blotting showed that icaritin treatment prior to radiation significantly promoted ROS production and γ-H2AX expression in the NPC cells (P<0.001). Compared with radiation exposure alone, the combined treatment caused cell cycle arrest in G2 phase, down-regulated CDC25C and cyclin B1 expression, and up-regulated p-CDC25C expression in the cells (P<0.01), resulting also in increased cell apoptosis, enhanced expression of ferroptosis protein ACSL4 and lowered expression of GXP4 (P<0.001). In the tumor-bearing mice, icaritin treatment, compared with radiation alone, significantly reduced the tumor growth rate and decreased tumor weight (P<0.001).

Conclusion

Icaritin can enhance radiosensitivity of NPC cells both in vitro and in nude mice possibly by enhancing ROS production to promote iron death of the cells.

鼻咽癌是发生于鼻咽内壁的一种恶性肿瘤，根据2020年全球肿瘤统计结果发现，新增病例为133 354例，新增死亡病例为80 008例^[1]。鼻咽癌具有明显的地域分布性，中国是全球鼻咽癌发病率最高的地区，主要分布于我国南方^{[2, 3]}。由于鼻咽部位于颅底下方，附近富集着主要的血管和神经，手术切除常用于晚期和转移性鼻咽癌，早期鼻咽癌通常以放疗为主要治疗手段之一^[4]。但患者对放射的不敏感或抵抗，通常是导致鼻咽癌复发或转移的主要原因^[5]。因此需要提高患者对放射的敏感性，以达到最好的治疗效果。

研究证明照射条件下，肿瘤细胞活性氧增多^[6]，DNA损伤加强^{[7, 8]}，从而导致细胞死亡。细胞死亡的方式受多种途径的调节，铁死亡也是其中一种^[9]。研究表明，铁死亡发生与照射后活性氧的增多密不可分。同样在鼻咽癌中发现，照射后导致细胞内活性氧稳态失衡，诱导细胞发生铁死亡，增强鼻咽癌的放射敏感性^[10]。以促进鼻咽癌细胞发生铁死亡为放射增敏的一种方式已经成为了研究热点^{[11, 12]}。

淫羊藿素是存在于中国药材淫羊藿中的主要活性成分^[13]，具有广泛的药理作用，如抗炎、免疫调节和抗肿瘤等^{[14, 15]}。多项研究证明，淫羊藿素对乳腺癌^[16]、卵巢癌^[17]、肺癌^{[18, 19]}等恶性肿瘤的生长具有抑制作用，并且淫羊藿素软胶囊已经在临床上应用于治疗晚期肝癌。本课题组先前研究发现淫羊藿素可以通过增强鼻咽癌细胞活性氧而抑制鼻咽癌的生长^[20]，而淫羊藿素在鼻咽癌中对放射的影响尚未有相关研究。因此本研究猜测淫羊藿素与放射联合后是否会进一步加强鼻咽癌细胞的活性氧，加深细胞DNA损伤，促使细胞发生铁死亡来提高放疗效果。本研究将选用鼻咽癌HONE1和HNE1两种细胞系，从体内和体外两方面探究淫羊藿素对鼻咽癌的放射增敏作用。

1. 材料和方法

1.1. 细胞培养

人鼻咽癌细胞HONE1和HNE1购自上海中乔新舟，用含有10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素双抗的DMEM培养基和RPMI 1640培养基进行细胞培养，并放于37 ℃，5% CO₂的环境中。

1.2. 主要试剂与仪器

淫羊藿素（纯度：99.8%，Sigma-Aldrich）。γ-H2AX，CDC25C，p-CDC25C，Cyclin B1抗体（Cell Signaling Technology），ACSL4，GXP4抗体（Proteintech），β-actin抗体（ZSGB-BIO）。DMEM培养基和RPMI 1640培养基（Gibco），胎牛血清（BI）。MTT试剂和细胞活性氧检测试剂盒（北京碧云天）。细胞周期检测试剂盒和Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡试剂盒（凯基生物）。细胞培养皿（Nest）电泳仪，细胞培养箱（Thermo）。转印槽多功能凝胶成像仪（Bio-Rad）。酶标仪（TECAN）。¹³⁷Csγ射线照射源（Best Theratronics），剂量率为为0.89 Gy/ min。

1.3. 实验动物

雄性BALB/c Nude 6周小鼠24只，无特定病原体级，购自北京华阜康生物科技股份有限公司。放于无特定病原体级环境中饲养，温度18~25 ℃，给予完全充足的水和饲料。所有动物实验均获得中国医学科学院放射医学研究所动物伦理委员会的批准，伦理审查编号为IRM-DWLL-2022235。

1.4. MTT法

取处于对数生长期的HONE1和HNE1消化后，接种在96孔板中，每孔细胞数为3000个，培养24 h后，加入不同浓度的淫羊藿素。培养48 h后，加入MTT，加入DMSO并振荡，通过酶标仪进行吸光值测定。淫羊藿素用细胞级DMSO溶解，实验浓度设定为0、1、3、10、30和100 μmol/L。

1.5. MTT法检测测平板克隆实验

将HONE1和HNE1细胞以200/孔细胞数接种在96孔板中，给予5、10和20 μmol/L的淫羊藿素，2 h后进行照射，照射剂量分别选用2、4、6和8 Gy。照射后1周加入DMSO并振荡，通过酶标仪测定吸光值A。并通过计算各组细胞的存活分数（SF）来表示各组细胞的放射敏感性，即SF=（An Gy-A空白组）/（A0 Gy-A空白组）。

1.6. 平板克隆实验

将HONE1和HNE1以500/孔细胞数接种在12孔板中，24 h后进行上述给药和照射剂量处理。照射后24 h换液，之后2 d换一次液，1周后通过结晶紫染色观察细胞集落，拍照并统计集落数量。SF=（PE处理组/PE对照组）×100%。

1.7. 流式检测细胞凋亡

将处于对数生长期的HONE1细胞和HNE1以2× 10⁵/孔接种于小皿中，培养24 h后进行分组，分为空白组、加药组、照射组和联合组。加药组和联合组给予10 μmol/L淫羊藿素，照射组和联合组进行6 Gy照射。照射后48 h进行消化离心，用PBS清洗两次后加入500 μL Binding Buffer、5 μLAnnexinⅤ-FITC和5 μL PI混匀，用过滤网过滤一次，室温避光反应15 min上机检测。

1.8. 流式检测细胞周期

处理细胞48 h后收集，加入70%冰乙醇进行重悬，-20 ℃过夜。离心，并用PBS润洗，向细胞沉淀加入450 μL RNase A和50 μL PI进行重悬。室温避光反应30 min后，筛网过滤，上机检测。

1.9. 流式检测活性氧

处理细胞24 h后，加入用无血清的培养基稀释的DCFH-DA探针，使其最终浓度为10 μmol/L。孵育20 min后，用无血清的培养基清洗3次。消化细胞，PBS润洗，再重悬使细胞密度为1×10⁶/mL，上机检测。

1.10. 蛋白印迹实验

处理细胞后48 h，收集细胞，向沉淀中加入RIPA裂解液，超声破碎，收集上清液，通过BCA试剂盒进行蛋白定量。加入上样缓冲液，95 ℃金属浴变性。通过电泳分离蛋白，通过半干转仪器将蛋白转移到PVDF膜。牛奶封闭后孵育相应的一抗（γ- H2AX，CDC25C，pCDC25C，Cyclin B1，ACSL4，GXP4或β-actin），4 ℃过夜，次日孵育相应二抗，加入ECL显色液成像，显影后结果通过Image J软件进行定量分析。

1.11. 裸鼠荷瘤

每只裸鼠的右侧臀部注射5×10⁶个HONE1细胞，待细胞吸收后，每日用游标卡尺对肿瘤组织进行长和宽的测量，并根据公式计算肿瘤体积的大小，体积公式为肿瘤体积（mm³）= 1/2×长度×宽度²。当肿瘤组织体积在100 mm³左右后，进行分组，分为空白组（Control）、给药组（Icaritin）、照射组（IR）和联合组（IR+Icaritin），6只/ 组。给药组和联合组给予50 mg/（kg·d）淫羊藿素，空白组和照射组给予溶剂玉米油。照射组和联合组一共照射5次，2 Gy/次，共10 Gy。最后一次照射后第5天进行处死取材，对心、肝、脾、肺、肾和肿瘤组织进行称重，并且将肿瘤组织拍照。

1.12. 统计学分析

所有实验均重复至少3次，采用SPSS 23.0统计学软件进行数据的统计分析，数据以均数±标准差表示，多组样本之间比较采取单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。通过Graph Pad Prism 6.0软件作图。

2. 结果

2.1. 淫羊藿素对鼻咽癌细胞增殖能力的影响

用不同浓度（0、1、3、10、30和100 μmol/L）的淫羊藿素处理HONE1和HNE1细胞48 h后，通过MTT法检测细胞活力，发现淫羊藿素以浓度依赖性的方式抑制了HONE1和HNE1细胞活力（图 1）。淫羊藿素在HONE和HNE1细胞中的IC₅₀分别为9.87、8.65 μmol/L，后续实验选择给予1/2 IC₅₀、IC₅₀和2 IC₅₀即5、10和20 μmol/L的淫羊藿素。

图 1.

淫羊藿素对鼻咽癌细胞细胞活力的影响

Effect of icaritin on viability of nasopharyngeal carcinoma cells. A: Molecular structure of icaritin. B: Effects of icaritin at different concentrations on viability of HONE1 and HNE1 cells (n=3).

2.2. 淫羊藿素与放射联合对鼻咽癌细胞克隆形成的影响

HONE1和HNE1细胞随着照射剂量的增加，细胞存活分数明显下降（图 2A）。在给予不同浓度的淫羊藿素后，与相同照射剂量的空白组相比，给药后以浓度依赖性的方式显著降低了HONE1和HNE1细胞的细胞存活分数。采用平板克隆实验观察在照射0、2、4、6和8 Gy后，给予不同浓度的淫羊藿素作用HONE1和HNE1细胞对其细胞克隆数的影响。结果显示，淫羊藿素浓度的增加会导致HONE1和HNE1细胞的细胞克隆数明显减少，并且随着照射剂量的增加，对两种细胞的集落形成能力的抑制作用越明显（图 2B）。在HNE1细胞中，6 Gy照射条件下给予10 μmol/L淫羊藿素时，细胞团已经不再明显。根据以上实验结果，后续实验将选择10 μmol/L淫羊藿素和6 Gy照射剂量。

图 2.

淫羊藿素联合放射加强对鼻咽癌细胞的抑制作用

Inhibitory effect of icaritin combined with radiation at different doses on nasopharyngeal carcinoma cells assessed by MTT assay (A) and plate clone formation assay (B).

2.3. 淫羊藿素与照射联合对鼻咽癌细胞活性氧的影响

流式细胞术观察淫羊藿素与照射联合后对HONE1和HNE1细胞活性氧的影响，结果显示，淫羊藿素处理组和单独照射组都会导致活性氧的增加（图 3A）。二者联合后，与单独照射组相比，鼻咽癌细胞中活性氧显著增多（P<0.001）。通过Western blot实验观察不同处理条件下γ-H2AX的表达变化，发现与单纯照射组相比，联合组γ-H2AX的表达显著上调（P<0.001，图 3B）。

图 3.

淫羊藿素联合照射增加鼻咽癌细胞活性氧

Icaritin combined with radiation increases reactive oxygen species (ROS) in nasopharyngeal carcinoma cells. A: Changes in ROS levels. B: Expression of DNAdamage marker γ-H2AX protein. ^***P<0.001 vs IR group.

2.4. 淫羊藿素与照射联合对鼻咽癌细胞周期的影响

通过流式细胞术检测不同处理条件下HONE1和HNE1细胞的周期分布情况，结果显示，照射会导致鼻咽癌细胞发生G2期阻滞，再给予淫羊藿素后，发现二者联合会导致G2期细胞比例显著上调（P<0.01，P<0.001）。通过Western blot实验观察，不同处理组的G2期阻滞的标志蛋白CDC25C、p-CDC25C和Cyclin B1的表达情况，发现与单独照射组相比，联合组的CDC25C和Cyclin B1表达显著减少，p-CDC25C表达显著增多（P<0.01，P<0.001，图 4）。

图 4.

淫羊藿素和照射联合导致鼻咽癌细胞发生G2期阻滞

Icaritin combined with radiation causes cell cycle arrest in G2 phase of nasopharyngeal carcinoma cells. A: Effects of icaritin combined with radiation on cell cycle distribution in nasopharyngeal carcinoma cells. B: Expression of cell cycle arrest marker proteins CDC25C, pCDC25C and cyclin B1. ^**P<0.01, ^***P<0.001 vs IR group.

2.5. 淫羊藿素联合照射对鼻咽癌细胞凋亡的影响

通过流式细胞术发现HONE1和HNE1细胞在经过6 Gy照射后，会发生一定程度的细胞凋亡，在加入淫羊藿素后，二者联合，鼻咽癌细胞凋亡的比例显著增加（P<0.01，P<0.001，图 5A）。通过Western blot实验观察铁死亡相关蛋白ACSL4和GPX4以及线粒体途径凋亡蛋白Bax和Bcl-2蛋白表情情况，发现联合组与单独照射组相比，ACSL4蛋白表达显著增加，GPX4蛋白则显著减少（P<0.001），而Bax蛋白没有出现显著性增加，Bcl-2蛋白没有出现显著性减少（图 5B）。

图 5.

淫羊藿素和照射联合促进鼻咽癌细胞发生凋亡

Icaritin combined with radiation promotes apoptosis of nasopharyngeal carcinoma cells. A: Effects of icaritin combined with radiation on apoptosis of nasopharyngeal carcinoma cells. B: Expression ofACSL4, GPX4, Bax and Bcl-2 proteins. ^**P<0.01, ^***P<0.001 vs the IR group.

2.6. 淫羊藿素对鼻咽癌在体内的放射增敏作用

构建裸鼠移植瘤模型（图 6A），记录肿瘤体积，观察到空白组的肿瘤组织生长速度最快，照射组肿瘤组织生长速度相对较慢，联合组相比于单独照射组显著性的抑制肿瘤组织的生长，同时发现联合组的肿瘤组织重量低于单独照射组（P<0.01，P<0.001，图 6B~D）。在给药期间，联合组与照射组相比，体质量没有出现显著性变化，4组裸鼠脏器比统计没有出现显著性差异，甚至在脾脏中，给药后对照射造成的影响有一定的保护作用（图 6E~F）。

图 6.

淫羊藿素和照射联合对裸鼠肿瘤组织生长的抑制作用

Icaritin enhances the inhibitory effect of radiation on tumor growth in nude mice. A: Timeline of treatment of the nude mice. B: Gross observation of the tumor tissues. C: Trends of changes of tumor volume. D: Tumor weight in the 3 groups. E: Curves of body weight changes of the mice in each group. F: Viscera index of the vital organs in each group. n=6. ^**P<0.01, ^***P<0.001 vs the IR group.

3. 讨论

放射是鼻咽癌公认的常见治疗手段但鼻咽癌细胞自身的基因的突变、某些信号通路的异常激活和肿瘤微环境的改变等情况的发生都会导致鼻咽癌发生放射抵抗^{[21, 22]}，致使鼻咽癌复发。因此，合适的放射增敏剂可提高鼻咽癌放疗的效果，为患者提供更多治愈的可能^[23]。

随着研究范围的扩大，中药配伍、中药材的单体以及活性成分在放射方面的应用也日益增多。如黄杞叶提取物可以明显改善放射导致的小鼠造血系统的损伤^[24]和肠损伤^[25]，同时对结肠癌细胞具有放射增敏的作用；黄芪多糖减少了放射诱导肺损伤模型小鼠体内的炎症因子IL-1β、TNF-α和IL-10的产生，减少肺组织纤维化的产生，并且对肺癌的裸鼠模型的肿瘤组织的增长没有抑制作用^[26]。多种中药以及单体也广泛应用于各种肿瘤的放射增敏中。血府逐瘀汤与照射联合后，食管癌裸鼠模型的肿瘤质量相比单独给药或者单独照射均有显著减少，肿瘤组织中HIF-1α、VEGFA、VEGFR2蛋白水平显著下调，说明血府逐瘀汤对食管癌皮下移植瘤具有放射增敏的作用^[27]。吴茱萸碱可以增强照射促进5- 8F和6-10B两种鼻咽癌细胞的细胞凋亡，使细胞阻滞在G2/M期，增加ROS，减少放射导致p-STAT3表达的增多^[28]。

我们的前期研究证明淫羊藿素可通过增强鼻咽癌细胞活性氧促使鼻咽癌发生周期阻滞和细胞衰老达到抑制肿瘤生长的作用^[22]，然而该研究并未详细探讨淫羊藿素与放射联合对鼻咽癌的影响。并且淫羊藿素作为放射增敏剂仅在乳腺癌中进行了讨论^[29]，在鼻咽癌中未见相关研究。因此本研究将在细胞和动物水平上，证明淫羊藿素与放射联合后对鼻咽癌的抑制作用，并且对机制进行初步探索。

本研究首先探索了淫羊藿素对鼻咽癌的细胞毒性，通过MTT实验发现淫羊藿素在10 μmol/L左右就可达到半数抑制浓度。通过平板克隆实验表明在不同剂量照射下，淫羊藿素与照射联合组比单纯照射组表现出更优秀的抑制鼻咽癌细胞增殖的能力。照射与活性氧增多紧密相关^[6]，并且前期研究中证明淫羊藿素会导致鼻咽癌细胞ROS增多，因此我们通过流式细胞术观察不同条件下对鼻咽癌细胞活性氧的影响，发现联合组显著增加鼻咽癌细胞的活性氧。当肿瘤细胞受到照射后，会导致细胞DNA链断裂，抑制肿瘤细胞增殖^[7]，Western blot实验结果显示，联合组的γ-H2AX表达显著性增加，表明DNA损伤增加。肿瘤细胞中活性氧水平升高以及DNA损伤都会导致细胞周期停滞^[30]，通过流式细胞术观察到在照射后，HONE1和HNE1细胞发生明显的G2期阻滞，在给予淫羊藿素后，二者联合增强了G2期的阻滞，说明这可能是淫羊藿素促进鼻咽癌放射增敏的方式之一。细胞凋亡是抗肿瘤的重要作用机制，对放射越敏感的肿瘤，细胞凋亡比例越大。通过流式细胞术发现淫羊藿素和照射联合组的细胞凋亡比例显著高于照射组。活性氧增多会导致肿瘤细胞发生内源性凋亡或者铁死亡^[31]，通过Western blot实验检测了线粒体凋亡的标志蛋白以及铁死亡的标志蛋白，发现联合后是通过促进鼻咽癌细胞发生铁死亡而达到促凋亡作用。

在体内构建的鼻咽癌裸鼠移植瘤模型中，观察到淫羊藿素联合放射对鼻咽癌的治疗作用。结果表明，单独给予淫羊藿素或者单独照射都可以减慢肿瘤组织的生长，但淫羊藿素和照射联合后，比单一效果好，表现出显著抑制肿瘤组织的增长作用。并且淫羊藿素对裸鼠的主要脏器没有明显的毒性，甚至淫羊藿素可能对放射导致器官损伤具有一定的保护作用。

综上所述，本研究发现在鼻咽癌中，淫羊藿素与放射联合可能是通过增加细胞周期阻滞以及增强细胞活性氧促使细胞发生铁死亡来发挥放射增敏的作用；并且通过裸鼠荷瘤模型证明了淫羊藿素可作为潜在的放射增敏剂发挥抗鼻咽癌作用。然而，淫羊藿素对活性氧的调控情况以及具体的分子机制等还需要进一步探索。

Biography

胡桐，在读硕士研究生，E-mail: hhutong1996@163.com

Funding Statement

国家自然科学基金（82202950）；中国医学科学院医学与健康科技创新工程国家医学健康科技战略平台与体系建设专项项目资助（2022-I2M-2-003）；中央高校基本科研业务费专项资金（3332022063）

Supported by National Natural Science Foundation of China (82202950)