乳酸乳球菌介导的细粒棘球绦虫重组LL-Eg95疫苗的构建、鉴定及表达

Abstract

目的

构建乳酸乳球菌（Lactococcus lactis, LL）为载体的细粒棘球绦虫（Echinococcus granulosus, Eg）重组LL-Eg95（rLL-Eg95）疫苗，并研究其表达效率。

方法

以pCD-Eg95为模板扩增Eg95基因，采用XbaⅠ和HindⅢ双酶切后插入pMG36e，构建重组质粒pMG36e-Eg95，转化大肠埃希菌BL21（DE3）感受态细胞，抽提质粒进行双酶切鉴定；电穿孔转化乳酸乳球菌MG1363株，构建细粒棘球绦虫重组LL-Eg95疫苗，抽提质粒进行PCR鉴定。

结果

重组质粒用双酶切鉴定可切出预期大小的片段，以具有罗红霉素抗性的重组LL中抽提的质粒为模板进行PCR可扩增出471 bp的Eg95基因；SDS-PAGE显示重组LL可表达相对分子质量为16.5×10³的Eg95蛋白，表达蛋白约占菌体总蛋白的17%；免疫印迹表明表达蛋白可被细粒棘球蚴感染的鼠血清识别。

结论

成功构建了细粒棘球绦虫重组LL-Eg95疫苗，表达的Eg95具有特异的抗原性。

细粒棘球绦虫（Echinococcus granulosus, Eg）的续绦期幼虫，俗称细粒棘球蚴（hydatid cyst），可在寄生的中间宿主或转续宿主体内导致囊型棘球蚴病（cystic echinococcosis, CE），又称细粒棘球蚴病（echinococcosis granulosus）或囊型包虫病（cystic hydatid disease），这是一种国家卫健委重点防治的寄生虫病。对于已发CE病例的首选治疗方法仍是外科手术，早期小棘球蚴或难做手术的病例可采用化疗药物或中药进行治疗，但存在一定的毒副作用，可能需要探索新的治疗途径^[1]。现有研究证实将Eg95的重组蛋白或DNA疫苗接种小鼠，Eg原头节攻击后可产生一定的保护力，表明它是有效的疫苗候选分子^[2-3]。

已有研究^[4]表明病毒载体介导的Eg疫苗包括牛痘病毒疫苗（rMVA-Eg95）、羊口疮病毒疫苗（rORFV-Eg95）、山羊痘病毒疫苗（rGPV-Eg95）和狂犬病毒疫苗（rRABV-Eg95）等，细菌载体介导Eg疫苗包括鼠伤寒沙门氏菌疫苗（rSt-Eg95/Eg95-Ferr）、卡介苗疫苗（rBCG-Eg95）、根癌农杆菌疫苗（rAt-Eg95-EgA31）和两歧双歧杆菌菌苗（rBb-Eg95-EgA31）等。病毒载体的自身蛋白及其双链RNA具有免疫佐剂效应，但人群普遍具有抗病毒抗体影响其免疫效果；重组沙门氏菌苗的表达产物与天然蛋白存在差异，表达水平较低；重组BCG疫苗表达外源基因需特殊载体等；转基因植物疫苗很少被公众认可和接受；重组Bb疫苗长期低剂量口服有可能产生免疫耐受现象。因此，还需要研制新型载体疫苗。乳酸乳球菌（Lactococcus lactis, LL）具有加速食品酸化、增加食物营养及改善食物品质等作用，将LL作为疫苗载体具有操作简便、转化效率高和重复性好等优点^[5]。本研究在早期制备的重组质粒pCD-Eg95基础上^[6]，将该质粒采用电转染技术转化LL，制备重组LL-Eg95疫苗，这将为CE的免疫预防提供新途径。

1. 材料与方法

1.1. 材料

1.1.1. 菌株和质粒

遵义医科大学周必英教授提供乳酸乳球菌MG1363株和BL21(pMG36e)菌株，本所构建和保存了BL21(pCD-Eg95)重组菌株。

1.1.2. 主要试剂

上海生工提供高效感受态细胞制备试剂盒、质粒提取试剂盒、高保真即用PCR扩增试剂盒、N, N-亚甲基双丙烯酰胺、丙烯酰胺、联苯二胺和考马斯亮蓝；Fermentas公司提供DNA marker；北京鼎国兴盛生物技术公司提供蛋白marker；北京鼎今生物科技公司提供辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗鼠抗体；本所自制细粒棘球蚴感染的鼠血清、LB培养基和MRS培养基。

1.2. 方法

1.2.1. 引物设计与合成

根据GenBank上登录的细粒棘球绦虫Eg95的cDNA序列及pMG36e载体的特点自行设计1对引物，P1为Eg95上游引物，引物序列为：5'-GCTCTAGAATGGCATTCCAGTTATGTCTC-3'，P2为Eg95下游引物，引物序列为5'-GCAAGCTTTCACATTACAGTGCTTTCCTTCTTGC-3'；在上、下游引物的5′端分别引入XbaⅠ和HindⅢ酶切位点（下划线部分）和2个保护性碱基（GC）。引物委托上海生工公司制备。

1.2.2. Eg95抗原基因的扩增

1.2.2.1. pCD-Eg95质粒的扩增

将保存的BL21（pCD-Eg95）重组菌用接种环挑取后，划线接种至含50 μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基，在CO₂培养箱培养48～72 h；用接种环挑选上述筛选培养基上的单个菌落，加入含50 μg/mL氨苄青霉素的LB培养液中，用细菌振荡器在37 ℃和200 r/min转速下培养48～72 h后，通过质粒抽提试剂盒抽提目标质粒。

1.2.2.2. Eg95抗原基因的PCR扩增及鉴定

以质粒pCD-Eg95为模板，PCR扩增Eg95抗原基因。扩增体系如下：PCR master 25 μL，P1、P2引物各2 μL，重组质粒模板2 μL，去离子水19 μL加入PCR反应管中，再加入25μL石蜡油进行密封；扩增条件如下：在94 ℃进行预变性2 min，94 ℃变性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸2 min，共进行30个循环，最后在72 ℃进行延伸10 min；吸取3 μL PCR产物，通过12 g/L琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。

1.2.3. pMG36e载体的提取

将保存的BL21（pMG36e）菌株用接种环挑取后，划线接种至含5 μg/mL罗红霉素的LB固体培养基上，37 ℃孵育48～72 h；挑选单个菌落至含5 μg/mL罗红霉素的LB培养液中，37 ℃ 250 r/min振摇培养48～72 h，按照UNIQ-10柱式质粒小量抽提试剂盒的说明书抽提质粒pMG36e。

1.2.4. 重组质粒pMG36e-Eg95的构建及鉴定

1.2.4.1. 目的基因和载体的酶切

Eg95的PCR产物和载体pMG36e分别用XbaⅠ和HindⅢ进行双酶切。酶切体系各60 μL：9.4 μL灭菌去离子水，6 μL 10×Tango Buffer，42 μL PCR产物或载体，1.3 μL XbaⅠ，1.3 μL HindⅢ。在离心转速5000 r/min条件下离心15 s，置37 ℃水浴2 h。

1.2.4.2. 酶切产物的纯化

按照UNIQ-l0柱式PCR产物纯化试剂盒的说明书进行操作。

1.2.4.3. 连接

按照酶切后载体与目的基因约1∶5的摩尔比及T₄ DNA连接酶的说明建立20 μL连接体系：加入4 μL目的基因、12 μL载体大片段、2 μL 10×T₄ Buffer、2 μL T₄ DNA连接酶。在离心转速5000 r/min条件下离心15 s，4 ℃过夜后置70 ℃ 10 min灭活T₄ DNA连接酶。

1.2.4.4. 连接产物转化BL21感受态细菌

将连接产物转化BL21感受态细菌，用细菌振荡器在37 ℃和1500 r/min转速下培养1 h，随即接种在含5 μg/mL罗红霉素的LB固体培养基上，37 ℃孵育48～72 h。

1.2.4.5. 重组质粒pMG36e-Eg95的酶切鉴定

挑取上述筛选培养基上单个菌落至含5 μg/mL罗红霉素的LB培养液中，用细菌振荡器在37 ℃和200 r/min转速下培养48～72 h后，用质粒抽提试剂盒提取重组质粒pMG36e-Eg95。然后用1.2.4.1中的酶切体系进行XbaⅠ和HindⅢ双酶切鉴定。

1.2.5. 乳酸乳球菌MG1363株感受态的制备

将保存的乳酸乳球菌MG1363株用接种环挑取后，划线接种在MRS固体培养基上，37 ℃孵育48～72 h；挑选单个菌落加至100 mL MRS液体培养基（含0.5 mol/L蔗糖）中，37 ℃厌氧培养24～72 h，冰浴2.5 h。4 ℃在离心转速5000 r/min条件下离心10 min，弃上清；加入50 mL预冷的10%甘油，4 ℃在离心转速3000 r/min条件下离心10 min，弃上清；加入25 mL预冷的10%甘油，4 ℃在离心转速2000 r/min条件下离心10 min，弃上清；加入10 mL预冷的10%甘油，4 ℃在离心转速1500 r/min条件下离心10 min，弃上清；加入1.5 mL预冷的10%甘油，混匀，此细菌可用于电转化。

1.2.6. rLL-Eg95疫苗的构建与鉴定

将直径1 cm的电穿孔杯冰浴10 min，加入20 μL重组质粒pMG36e-Eg95和80 μL乳酸乳球菌MG1363株感受态，混匀后静置10 min，放入电穿孔仪的槽中，设置电压0.5～2.5 kV，时间常数5 ms和转化次数1～10次进行摸索；电击后在电穿孔杯加入1 mL MRS培养基，用细菌振荡器在37 ℃和150 r/min转速下培养2 h，用接种环挑取菌液，划线接种至含5 μg/mL罗红霉素的平板上，在CO₂培养箱培养48～72 h；用接种环挑选单个菌落，加入MRS培养基（含0.5 mol/L蔗糖和5 μg/mL罗红霉素）进行增菌培养48～72 h，用质粒抽提试剂盒提取目标载体，以提取的质粒为模板采用PCR进行鉴定；PCR扩增体系和反应条件同1.2.2.2。

1.2.7. rLL-Eg95疫苗的表达与鉴定

1.2.7.1. rLL-Eg95疫苗的表达

用接种环挑取经过鉴定的重组rLL菌，将其接种至MRS选择培养基（含0.5 mol/L蔗糖和5 μg/mL罗红霉素），用细菌振荡器在37 ℃和200 r/min转速下进行振荡培养，分别于培养后1、2、3、4和5 d收集1 mL菌液，在离心转速5000 r/min条件下离心2 min，采集菌体沉淀。将菌体沉淀进行煮沸裂解，将全菌体进行100 g/L的SDS-PAGE电泳，凝胶通过凝胶成像仪进行扫描和分析。

1.2.7.2. rLL-Eg95疫苗的免疫印迹

将rLL-Eg95疫苗和空载体LL（pMG36e）疫苗分别进行SDS-PAGE电泳，然后，通过半干法将凝胶蛋白转移至硝酸纤维膜，在150 mA恒流条件下转膜2 h。转膜后封闭2 h，磷酸盐缓冲液洗涤3次；加入1∶100稀释的细粒棘球蚴感染的鼠血清100 μL孵育2 h，磷酸盐缓冲液洗涤3次；再加入1∶1000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG抗体100 μL孵育2 h，磷酸盐缓冲液洗涤3次；用底物联苯二胺进行显色，然后成像。

2. 结果

2.1. 重组质粒pMG36e-Eg95的双酶切鉴定

重组质粒与空载体分别进行双酶切后，酶切产物采用12 g/L琼脂糖电泳进行检测（图1），重组质粒出现大小约3600 bp的载体条带和471 bp的Eg95基因条带，而空载体无471 bp的条带。

图 1.

Double restriction endonuclease identification of pMG36e-Eg95

重组质粒pMG36e-Eg95的双酶切鉴定

M: DNA marker; 1 and 2: pMG36e vector; 3 and 4: endonuclease products of pMG36e-Eg95.

2.2. rLL-Eg95疫苗的PCR鉴定

将抽提的目标质粒作为底物进行PCR克隆，琼脂糖凝胶电泳图像见图2，克隆出大小约471 bp的目的基因片段，与Eg95基因相符。

图 2.

PCR identification of the rLL-Eg95 vaccine

rLL-Eg95疫苗的PCR鉴定

M: DNA marker; 1-6: PCR products of pMG36e-Eg95.

2.3. rLL-Eg95疫苗的SDS-PAGE分析

rLL-Eg95疫苗培养0～5 d后，SDS-PAGE检测表达产物，结果如图3，出现相对分子质量为16.5×10³的蛋白条带，培养2～3 d时表达量较高，表达蛋白约占菌体总蛋白的17%，未培养的重组LL未见目的蛋白的表达。

图 3.

SDS-PAGE analysis of the Eg95 protein expressed in the rLL-Eg95 vaccine

rLL-Eg95疫苗表达产物的SDS-PAGE分析

M: protein marker; 1: rLL-Eg95 with no culturing; 2-6: rLL-Eg95 after culturing for 1, 2, 3, 4 and 5 d, respectively.

2.4. rLL-Eg95疫苗的免疫印迹鉴定

如图4所示，细粒棘球蚴感染的鼠血清可特异性结合重组LL菌呈现的目的蛋白，目的蛋白的条带位于相对分子质量为16.5×10³处，空质粒对照组未见目的蛋白的条带。

图 4.

Western blot of the Eg95 protein expressed in the rLL-Eg95 vaccine

rLL-Eg95疫苗表达产物的免疫印迹鉴定

M: proein marker; 1: control; 2: Eg95 protein.

3. 讨论

早期研究^[4]提示Eg95分子是一种相对分子质量为24.5×10³的天然六钩蚴抗原。其编码基因全长为715 bp，其中462 bp基因可编码相对分子质量为16.5×10³的含153个氨基酸的蛋白质。本课题组^[7-10]先后以BCG、根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens, At）、两歧双歧杆菌（Bifidobacteria bifidum, Bb）和粪肠球菌（Enterococcus faecalis, Efs）为载体构建了rBCG-Eg95疫苗、转Eg95-EgA31融合基因苜蓿、rBb-Eg95-EgA31疫苗和rEfs-Eg95-EgA31疫苗，实验结果表明上述载体疫苗可产生有效的免疫应答，从而对抗Eg原头节的攻击感染，但只能诱导宿主产生部分保护力，因此，还需要开发新的疫苗载体，把Eg疫苗的研究推向一个新的高度。

为了将外源DNA有效引入乳酸乳球菌，需构建大肠埃希菌-乳球菌穿梭表达载体。这类载体常分为组成型和诱导型，其中pMG36e和pNZ8148是其中的模式载体^[11]。本研究选择pMG36e表达质粒，是因为该质粒选择p32启动子作为RNA聚合酶结合的区域，在该启动子的作用下，Eg95基因的表达大体恒定在一定水平上，在不同组织部位表达水平大致相似，使用罗红霉素作为标记容易筛选。已有研究表明pMG36e质粒大小为3.6 kb，通常含有p32启动子及其下游部分的开放阅读框、来自pUC18的多克隆位点、来自乳酸乳球菌乳脂亚种蛋白酶（PrtP）基因的转录终止子、pWV01的复制子和源自pE194质粒的罗红霉素抗性基因（Em^R）等。

乳酸乳球菌NCD0712株经过紫外线照射可得到MG1363株，本研究即采用该菌株。乳酸乳球菌的细胞壁厚而且复杂，摄取外源DNA较为困难，采用电穿孔（electroporation, EP）技术进行转染具有作用机制相对明确和转化效率高等优点^[12]，EP利用高于某一阈值的外加电脉冲刺激细胞膜，导致细胞的膜磷脂双分子结构发生重排，形成瞬时性空洞，从而使外源性大分子通过空洞进入细胞。不同乳酸乳球菌的菌株具有不同的电转染条件，需要进行优化。脉冲场电压、电容、脉冲时间、脉冲次数、细胞生长期以及细胞密度、细菌培养温度、细胞电击前后冰浴时间、质粒大小、浓度、构象和纯度、电穿孔缓冲液和电穿孔后培养液等因素影响EP的转化效率。本研究将对数生长期的细菌制成感受态，采用1.6 kV/cm的电压和2次脉冲即可获得较高的转染效率，转化效率可达10⁴～10⁸/μg的DNA。

近期报道以LL为载体的疫苗^[13-19]有：表达猪带绦虫（Taenia Solium）TSOL18蛋白的重组LL-TSOL18疫苗、表达柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tenella）3-1E蛋白的重组LL-3-1E-CWA疫苗、表达硕大利什曼原虫（Leishmania major）PPsp15的重组LL-PPsp15疫苗、表达羊种布鲁氏菌（Brucella melitensis）OMP31蛋白的重组LL-OMP31疫苗、表达流产布鲁氏菌（Brucella abortus）BLS蛋白的重组LL-BLS疫苗、表达1型鸭乙肝病毒VP1蛋白的重组LL-VP1疫苗以及表达禽腺病毒4型六邻体蛋白的重组LL-hexon疫苗。它们的接种剂量为5×10⁸ CFU或2×10⁹ CFU，接种次数为1次、3次或连续多次，接种途径有口服灌胃或皮下注射等，结果发现疫苗多次口服或皮下注射BALB/c鼠能诱导混合型的Th1和Th2应答，可部分对抗柔嫩艾美耳球虫卵囊的口服攻击、硕大利什曼原虫前鞭毛体的皮下注射攻击、流产布鲁氏菌的腹腔注射攻击、1型鸭乙肝病毒的眼鼻感染攻击或禽腺病毒4型的皮下注射攻击，但均未诱导完全的保护力。已知LL是一种常见的口服益生菌，以LL为载体的疫苗也应该采取口服接种为最佳选择，但现有的保护力结果尚不尽如人意，因此需要探索疫苗口服接种的剂量、次数、每次接种后的间隔时间以及可否加入佐剂等，也需要摸索病原体的攻击途径、次数和能否对抗病原体的连续或联合攻击，进一步阐明疫苗诱导的免疫应答机制，这对于开拓这类疫苗的应用市场具有一定意义。

本实验将抽提的pMG36e-Eg95质粒采用电转染技术转化LL感受态，筛选和诱导培养后从重组LL抽提目标质粒，将其作为底物通过PCR可克隆出471 bp的Eg95基因，表明重组LL疫苗已初步制备，这为下一步的疫苗实验提供了新材料。本研究经SDS-PAGE显示rLL-Eg95疫苗培养2～3 d后可表达相对分子质量为16.5×10³的Eg95蛋白；借助薄层扫描显现重组菌的表达效率达到17%；免疫印迹提示细粒棘球蚴感染的鼠血清可特异识别rLL表达的Eg95蛋白，提示rLL表达的目的蛋白能够正确折叠，具有特异的抗原性，这为下一步rLL疫苗的保护力研究奠定了基础。

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作者贡献声明　李文桂负责论文构思、经费获取、提供资源、调查研究、监督指导、验证、可视化和初稿写作，欧兴坤和何爱琳负责研究方法、数据审编和正式分析。所有作者已经同意将文章提交给本刊，且对将要发表的版本进行最终定稿，并同意对工作的所有方面负责。

利益冲突　所有作者均声明不存在利益冲突

Funding Statement

国家自然科学基金（No. 30801052、No. 30671835、No. 30500423、No. 30200239）资助