低环境压力下超声造影剂微泡高频次谐波散射特性的实验研究

Abstract

超声造影剂微泡非线性次谐波散射与环境压力之间的相关性有望用于局部脑组织压力的监测。尽管高频超声实现了颅内微血管的高分辨成像，但是当前对微泡的高频次谐波散射特性研究不充分，制约了基于微泡高频次谐波散射估测局部脑组织压力的研究进展。因此，本研究以离体方式探索了在10 MHz高频超声激励下，不同声压和环境压力对声诺维（SonoVue）、示卓安（Sonazoid）和华声显三种超声造影剂微泡高频次谐波散射特性的影响。结果显示，在696、766、817 kPa的峰负声压下，三种微泡的次谐波散射幅度均随着环境压力的增加而增长，且次谐波幅值与压力之间具有良好的线性相关性。在上述三个声压下，声诺维的相关性系数最高可达0.948（P = 0.03），测压灵敏度最高为0.248 dB/mm Hg，均方根误差（RMSE）最小为2.64 mm Hg；示卓安的相关性系数最高可达0.982（P < 0.01），测压灵敏度最高为0.052 dB/mm Hg，RMSE最小为1.51 mm Hg；华声显的相关性系数最高可达0.969（P = 0.02），测压灵敏度最高为0.098 dB/mm Hg，RMSE最小为2.00 mm Hg。以上离体实验结果表明，通过选择超声造影剂微泡并优化声压，可以改进微泡的高频次谐波散射与环境压力之间的相关关系、提高测压灵敏度、减小测量误差，以满足临床对局部脑组织压力测量的需求，这为后续在体研究提供了重要的实验依据。

0. 引言

局部受损脑组织的压力变化对于创伤性脑损伤（traumatic brain injury，TBI）的诊断和治疗具有重要的指导意义。目前临床上主要通过将测压导管置入侧脑室、脑实质或蛛网膜下腔等部位来监测颅内压（intracranial pressure，ICP），从而评估TBI患者的病情进展情况^[1]。但是通常情况下ICP只能反映全脑的压力变化^[2-3]，不能直接反映局部受损脑组织的压力。并且由于局部压力传导的滞后，ICP亦存在滞后性。因此，在反映全脑压力的ICP改变之前，局部损伤脑组织可能已发生不可逆改变，这种不可逆的脑组织改变与TBI的高致残率和不良预后密切相关。因此，迫切需要一种能够实时动态监测TBI患者局部损伤脑组织压力情况的方法，以满足临床TBI治疗的需求，从而改善TBI患者远期预后并降低致残率。

次谐波辅助压力估测技术（subharmonic aided pressure estimation，SHAPE）是一种通过超声激励使超声造影剂微泡发生非线性振动产生次谐波，利用次谐波的散射幅度与环境压力之间的相关性进行压力估测的技术^[4]。该技术提出后，国内外学者针对影响SHAPE测压灵敏度和相关性的各项参数（包括：频率、声压、波形、微泡粒径、包膜参数等）进行了深入研究和不断优化^[5-12]，使该技术有望用于局部脑组织压力的监测。对于门静脉压、肿瘤间隙压和ICP等低压力范围（< 40 mm Hg）的测压，通常需要较高的测压灵敏度和良好的相关性来获得较高的测压精度，以满足临床应用的需求。虽然近年来的离体和在体研究对低压力范围的测压参数进行了不断的优化^[13-19]，但这些研究多为1～5 MHz低频超声激励下的压力估测研究，通常难以满足颅内微血管成像对高空间分辨率的要求。近几年脑血流超分辨成像技术研究表明，利用10 MHz以上的高频超声对脑组织进行成像能够明显提升颅脑超声的成像水平，并已在脑血管的可视化方面得到了应用^[20-23]。因此，利用高频超声对TBI患者损伤局部脑血管进行成像，并结合SHAPE技术对血管内的压力进行估测，有望定位损伤部位并测量该部位脑组织的压力，从而为进一步诊治提供重要依据。因此，本研究将利用定制开放式医学超声研究平台，在离体条件下研究三种超声造影剂微泡［声诺维（SonoVue）、示卓安（Sonazoid）和华声显］，在10 MHz的高频超声激励下的次谐波散射特性，为局部脑组织压力测量的可行性提供必要的实验依据。

1. 方法

1.1. 实验系统

本研究采用如图1所示的体外循环实验系统模拟微泡在体内的情况。与本课题组之前基于单阵元超声换能器的体外研究系统类似^[15]，主要由装有400 mL生理盐水的圆柱形密闭罐、流量为1.5 L/min（平均流速约为0.88 m/s）的恒速直流泵和直径为6 mm的仿体血管组成。仿体血管内置入压力导管连接压力传感器；传感器接收的压力信号通过生理信号采集装置（MP160，BIOPAC Systems, Inc.，美国）采集，实时显示仿体血管内的压力数值。本研究采用开放式医学超声研究平台［iNSIGHT-37CT，声泰特（成都）科技有限公司，中国］和中心频率7.5 MHz、﹣6 dB带宽为4～12 MHz的128阵元线阵探头进行实验。线阵探头通过立体定位仪固定在方形水箱上方，并利用立体定位仪调整线阵探头的位置，使仿体血管的中心位于探头的焦点位置（焦距15 mm）。

图 1.

Schematic diagram of the extracorporeal circulation system

体外循环系统示意图

1.2. 实验参数

本实验采用三种造影剂进行实验，分别是：目前国内批准上市的声诺维（Bracco Inc.，意大利）和示卓安（GE Healthcare Inc.，挪威），以及仍在研发阶段的华声显（广州康臣药业有限公司，中国）。如表1所示，三种造影剂的初始微泡浓度分别为：2 × 10⁸、2 × 10⁸～5 × 10⁸、2 × 10⁹ 个/mL。实验中为了统一微泡浓度，将华声显微泡悬浊液稀释10倍后使用。本实验的压力范围为10～40 mm Hg，以10 mm Hg为增量。线阵探头的发射频率设定为10 MHz。

表 1. Physical properties of SonoVue, Sonazoid and Huashengxian ultrasound contrast agent microbubbles.

声诺维、示卓安和华声显超声造影剂微泡的物理学特性

造影剂	内部气体	平均直径/μm	微泡悬液浓度/(个·mL-1)	奥斯特瓦尔德系数
声诺维	六氟化硫	2.5	2 × 108	5.40 × 10−3
示卓安	全氟丁烷	2.6	2 × 108～5 × 108	2.02 × 10−4
华声显	八氟丙烷	1.3	2 × 109	5.20 × 10−4

本研究采用696、766、817 kPa三个峰负声压进行实验。本课题组之前的离体实验研究了不同激励声压，对微泡次谐波散射幅值与环境压力的相关性及测压灵敏度的影响^[15]。结果显示：声诺维微泡的次谐波增长曲线存在第二个增长期（激励声压 > 400 kPa）；与第一个增长期（< 300 kPa）相比，第二增长期内的次谐波幅值与环境压力的相关性更好、测压灵敏度更高，更适合低环境压力（< 40 mm Hg）的测量^[15]。随后，本课题组进一步在比格犬门静脉压力测量的在体实验中验证了上述结论^{[16, 19]}。因此，本研究选择了处于第二增长期的上述三个峰负声压进行实验。

1.3. 实验过程

1.3.1. 线阵探头的标定

通过调节开放式医学超声研究平台的焦距与孔径大小的比值和声功率获得不同的峰负声压，利用全自动三维声场扫描测量系统（BRC8090，深圳博锐创科技有限公司，中国）和针式水听器（0.5 mm Needle Probe，Precision Acoustics Inc.，英国）在距离线阵探头表面15 mm的焦点位置进行声压标定。

1.3.2. 微泡悬液的制备

声诺维和示卓安微泡悬液的制备与产品说明书一致。华声显造影剂微泡悬液，使用振荡器（DB338，佛山宇森医疗器械有限公司，中国）将含有1.5 mL华声显造影剂微泡的密闭西林瓶振荡45 s后，再稀释10倍制成。

1.3.3. 实验流程

调节立体定位仪使线阵探头距仿体血管中心点15 mm，设置线阵探头发射频率为10 MHz（波长λ = 150 μm，周期t = 0.1 μs），发射脉冲持续16个周期（持续时间1.6 μs），焦距15 mm，调节焦距与孔径大小的比值和声功率至对应的峰负声压值。将400 mL生理盐水加入圆柱形密闭罐内，并将0.2 mL上述制备的微泡悬液注入其中；打开磁力搅拌器（MS-H-S，大龙兴创实验仪器（北京）股份公司，中国），使密闭罐内的微泡充分混合均匀；通过空气压力泵（KY2001B，北京凯航伟业科技有限公司，中国）向密闭罐内注入空气，使仿体血管内压力达到设定的压力值；打开恒速直流泵，使微泡在体外循环系统中流动。通过开放式医学超声研究平台对脉冲回波原始射频信号（radiofrequency，RF）进行采集（采样频率60 MHz），每个声压和压力值采集5次，每次采集完成后关闭恒速直流泵，更换生理盐水并充分清洗循环系统内残留的微泡。

需要说明的是，根据恒速直流泵的平均流速计算，仿体血管内的微泡在1.6 μs的脉冲作用时间里移动的距离仅为0.009 λ，远小于焦域尺寸所能达到的物理极限1.22 λ（衍射极限）。因此，在单个脉冲作用的时间里，焦域内的微泡并未离开焦点区域，线阵探头可以接收到该发射脉冲激励微泡产生的全部散射信号。

1.4. 数据处理

使用科学计算软件MATLAB 7.0（Mathworks Inc.，美国）对采集的RF信号进行后续处理。如图2所示，首先进行B模式下图像重建，在重建的图像上选取血管中心4 mm×2.7 mm矩形区域（包含30条扫描线，每条线上有250个数据点）作为感兴趣区（region of interest，ROI）（图2中红色矩形框）。由于线阵的工作方式是从探头的一端移动子阵列进而移动聚焦波束，使得聚焦波束可以扫描整个成像区域，因此能够保证选取的ROI位于线阵聚焦区域里。

图 2.

The selection of ROI and the time domain diagram and spectrogram of microbubble scattering signals

ROI选取及微泡散射信号时域图和频谱图

如图2所示，分别为重建的仿体血管造影图像、ROI（红色矩形框）内微泡散射RF信号的时域图和频谱图。本实验采用的微泡浓度可使微泡空间分布均匀，从而产生灰度均匀的造影图像，因此降低了微泡散射的随机性。RF信号处理的主要流程为：① 通过汉宁窗函数处理ROI中每条扫描线的RF时域信号，再通过快速傅里叶变换获得其频谱图；② 每条扫描线的次谐波幅值定义为频谱图上频率5 MHz附近的最大值；③ 将ROI中每条扫描线的次谐波幅值取均值，得到单帧次谐波幅值，以降低微泡散射信号空间分布的随机性对幅值的影响；④ 再将5帧数据的次谐波幅值平均，获得最终的次谐波幅值用于估测仿体血管内的压力，以进一步降低微泡散射信号时间分布的随机性对幅值的影响。

1.5. 数据统计

采用统计产品与服务解决方案软件SPSS（23.0，SPSS Inc.，美国）对实验数据进行统计分析。通过皮尔逊（Pearson）相关分析，对次谐波幅值和仿体血管内压力的线性相关性进行统计分析，利用得出的线性相关方程式计算出次谐波幅值对应的压力估测值。用均方根误差（root mean square error，RMSE）表示压力估测值与仿体血管内的实际压力值之间的偏差，检验水准为0.05。

2. 结果分析

2.1. 声诺维造影剂微泡的次谐波散射幅值与仿体血管内压力的相关关系

如图3所示，在696、766、817 kPa三个实验声压下，随着仿体血管内压力的增加，声诺维造影剂微泡的次谐波幅值均呈现递增的趋势。当峰负声压值为696 kPa时，灵敏度为0.143 dB/mm Hg，次谐波幅值与仿体血管内压力的线性相关性系数r = 0.948，P = 0.03。当峰负声压值为766 kPa时，灵敏度为0.248 dB/mm Hg，次谐波幅值与仿体血管内压力的线性相关性系数r = 0.928，P = 0.04。当峰负声压值为817 kPa时，灵敏度为0.093 dB/mm Hg，次谐波幅值与仿体血管内压力的线性相关性系数r = 0.924，P = 0.04。在以上三个实验声压下，声诺维次谐波散射估测的仿体血管压力的RMSE分别为2.64、3.11、3.19 mm Hg，压力估测偏差都在4 mm Hg范围内。

图 3.

Correlation between subharmonic amplitude of SonoVue microbubbles and biomimetic endovascular pressure

声诺维微泡的次谐波幅值和仿体血管内压力的相关性

2.2. 示卓安造影剂微泡的次谐波散射幅值与仿体血管内压力的相关关系

如图4所示，在696、766、817 kPa三个实验声压下，随着仿体血管内压力的增加，示卓安造影剂微泡的次谐波幅值均呈现递增趋势。当峰负声压值为696 kPa时，灵敏度为0.041 dB/mm Hg，次谐波幅值与仿体血管内压力的线性相关性系数r = 0.954，P = 0.02。当峰负声压值为766 kPa时，灵敏度为0.052 dB/mm Hg，次谐波幅值与仿体血管内压力的线性相关性系数r = 0.982，P < 0.01。当峰负声压值为817 kPa时，灵敏度为0.032 dB/mm Hg，次谐波幅值与仿体血管内压力的线性相关性系数r = 0.931，P = 0.04。在以上三个实验声压下，示卓安次谐波散射估测的仿体血管压力的RMSE分别为2.41、1.51、3.03 mm Hg，压力估测偏差都在4 mm Hg范围内。

图 4.

Correlation between subharmonic amplitude of Sonazoid microbubbles and biomimetic endovascular pressure

示卓安微泡的次谐波幅值和仿体血管内压力的相关性

2.3. 华声显造影剂微泡的次谐波散射幅值与仿体血管内压力的相关关系

如图5所示，在696、766、817 kPa三个实验下，华声显造影剂微泡散射的次谐波幅值随着仿体血管内压力的增加均呈现递增趋势。当峰负声压值为696 kPa时，灵敏度为0.098 dB/mm Hg，次谐波幅值与仿体血管内压力的线性相关性系数r = 0.969，P = 0.02。当峰负声压值为766 kPa时，灵敏度为0.073 dB/mm Hg，次谐波幅值与仿体血管内压力的线性相关性系数r = 0.909，P = 0.04。当峰负声压值为817 kPa时，灵敏度为0.054 dB/mm Hg，次谐波幅值与仿体血管内压力的线性相关性系数r = 0.938，P = 0.03。在以上三个实验声压下，华声显次谐波散射估测的仿体血管压力的RMSE分别为2.00、3.54、2.91 mm Hg，压力估测偏差都在4 mm Hg范围内。

图 5.

Correlation between subharmonic amplitude of Huashengxian microbubbles and biomimetic endovascular pressure

华声显微泡的次谐波幅值和仿体血管内压力的相关性

3. 讨论

本研究结果显示，在10 MHz高频超声激励下，峰负声压值分别为696、766、817 kPa时，声诺维和示卓安造影剂微泡散射的次谐波幅值均随仿体血管内压力的增加而增加。而本课题组之前的体外实验对声诺维造影剂微泡测压特性的研究结果表明，在4 MHz的发射频率下，在高声压阶段（> 400 kPa）声诺维造影剂微泡的次谐波幅值随仿体血管内压力的增加而降低^[15]。Gupta等^[24]利用示卓安造影剂微泡在频率为2.5 MHz、峰负值声压为0～800 kPa的参数下估测了10～40 mm Hg范围内的压力，结果显示，次谐波幅值与环境压力负相关。以上研究结果的差异，可能是由于不同驱动频率下发生非线性振动的微泡粒径存在差异所导致。Goertz等^[25-27]的研究证实，在高频的超声驱动下，非线性信号主要由粒径< 2 μm的微泡产生。由于微泡的粒径较小，表面活性剂浓度较高，使得微泡的表面张力较小，因而微泡处于屈曲状态^[28]。Frinking等^[10]的进一步研究表明，次谐波散射幅度随环境压力升高的现象与那些处于屈曲状态的微泡有关。因此，本研究观察到的微泡高频次谐波幅值与环境压力之间的正相关关系，可能是由粒径较小且处于屈曲状态的微泡的非线性散射产生。

如图3～图5所示，不同造影剂微泡的测压灵敏度存在较大的差异。其中，声诺维的测压灵敏度在各个声压均明显优于其他两种微泡，最高测压灵敏度在峰负声压值为766 kPa时达到0.248 dB/mm Hg，这可能是不同微泡的稳定性差异所致。对造影剂微泡溶解时间的研究显示，微泡内部填充气的奥斯特瓦尔德（Ostwald）系数越小，填充气的溶解度越低，则微泡越稳定^[29-30]。如表1所示，声诺维微泡的封装气体具有最高的奥斯特瓦尔德系数，因此声诺维微泡的稳定性最低。所以，在相同声压下，声诺维微泡比另外两种造影剂微泡更容易破裂。另外，Frinking等^[10]的研究显示，高声压下次谐波散射是由微泡破裂释放的自由气泡产生。因此，在相同声压激励下，声诺维微泡破裂释放的自由气泡更多，且自由气泡相对于有壳微泡，其对压力的变化更加敏感，所以相应的声诺维微泡测压灵敏度更高。

综上，对于压力的测量，可以通过调整激励声压、驱动频率等参数来优化微泡次谐波散射与压力的相关关系以及测压灵敏度和测量误差，从而满足临床应用的需求。本文探索了10 MHz高频超声激励下，利用微泡次谐波散射对低压力范围进行测量的可行性。结果显示，高驱动频率条件下，通过选择造影剂微泡和对应的激励声压，可利用微泡次谐波幅值估测40 mm Hg内的压力。然而本研究只选取了三个声压和一个频率进行压力估测，因此后续可以进一步扩大声压和频率的范围进行相关参数的研究。此外，示卓安和华声显造影剂微泡的测压灵敏度较低，后续可以通过单分散微泡等方法尝试提高其灵敏度和测压精度^[31]。由于组织对声波的衰减随频率升高而增大，后续在体研究需要进一步考虑高频超声在组织中的损耗。

4. 总结

本文在10 MHz高频超声激励下，探讨了声压和环境压力对微泡次谐波散射特性的影响，研究了利用三种微泡造影剂的高频次谐波散射估测低环境压力的可行性。实验结果显示，当发射频率为10 MHz时，三种造影剂微泡的次谐波幅值均随着环境压力的增加而增长，且压力测量的均方根误差均在4 mm Hg内。相较其他两种微泡造影剂，声诺维显示出更高的测压灵敏度，可能更适合于高频超声下利用次谐波幅值进行压力估测。后续的在体实验需要进一步考虑高频超声的声衰减问题，并通过算法优化实现实时测压。本研究为基于微泡高频次谐波散射估测局部脑组织压力的可行性提供了必要的实验依据，并可为进一步的在体研究提供具有指导意义的实验参数。

重要声明

利益冲突声明：本文全体作者均声明不存在利益冲突。

作者贡献声明：卢慧敏负责实验实施、结果分析和论文撰写，王云负责数据整理，黄来鑫负责超声探头标定，徐岗负责图表绘制，周娟负责编码，虞文魁负责医学指导，李飞负责整体实验设计；所有作者参与了论文的修改。

Funding Statement

国家自然科学基金（81927808，12074402，12004411）；深圳市基础研究重点项目（JCYJ20200109114825064）；深圳市国际合作项目（GJHZ20210705141404012）；四川省自然科学基金（2022NSFSC0843）；中国博士后科学基金（2022M712262）

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