Abstract
目的
基于芯片数据研究2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus，T2DM)患者脂肪组织CD14+细胞的基因表达情况，筛选差异表达基因(differentially expressed genes，DEGs)，利用生物信息学方法分析肥胖影响T2DM患者免疫状况的分子机制及环境因子对该机制的影响。
方法
从基因表达谱公共数据库中获取数据集GSE54350，采用Network analyst、String11.0、Cytoscape 3.7.1等分析软件对数据进行预处理，筛选数据库的DEGs，进行基因功能(gene ontology，GO)与KEGG(kyoto encycopedia of genes and genomes)信号通路富集分析，建立DEGs蛋白质-蛋白质互作网络、转录因子-基因调控网络、microRNA-基因调控网络、环境因子-基因调控网络等交互作用系统。
结果
肥胖型T2DM患者脂肪组织中CD14+细胞的基因表达模式与肥胖非T2DM患者有显著差异，共有19个 DEGs，表达均上调；DEGs主要参与ARP2/3复合体调控肌动蛋白细胞骨架、正向调节蛋白质复合物组装等生物学过程，并涉及与吞噬作用相关的Fcγ受体信号转导途径和受体家族信号通路；蛋白质-蛋白质互作网络显示TNF为核心蛋白节点；microRNA-基因调控网络显示hsa-miR-124-3p与DEGs具有交互作用；TNF、KYNU、RCAN1等相关基因均与环境因子有交互作用。
结论
肥胖型T2DM患者脂肪组织CD14+细胞的基因表达发生显著改变，TNF可能在肥胖影响T2DM患者免疫状况过程中发挥重要作用，多个microRNA、转录因子和环境因子在上述过程中也起一定作用。这为深入探索肥胖对T2DM患者的影响提供了新素材和思路。
Keywords: 肥胖, 2型糖尿病, 免疫, 环境因子, 生物信息学
Abstract
Objective
To study the gene expression of adipose tissue CD14+ cells in patients with Type 2 diabetes mellitus (T2DM) based on chip data, screen differentially expressed genes, and analyze their relationship with the environmental factors.
Methods
The data of GSE54350 were obtained from the public database of gene expression profiling. The data were pre-processed by Network Analyst, String 11.0, Cytoscape 3.7.1, and other analytical software. The differentially expressed genes were analyzed by gene ontology biological function and kyoto encycopedia of genes and genomes (KEGG) signaling pathway to establish differential gene protein interaction network, transcription factor-gene regulatory network, microRNA-gene regulatory network, environmental factors-gene regulatory network, and other interaction systems.
Results
The gene expression pattern of CD14+ cells in adipose tissue of obese T2DM patients was significantly different from that of obese non-T2DM patients. There were 19 differentially expressed genes with up-regulation. The differentially expressed genes were mainly involved in ARP2/3 complex regulation of actin cytoskeleton, positively associated with biological processes such as protein complex assembly, and involved in the phagocytic Fcγ receptor signaling pathways and receptor family signaling pathways. The protein-protein interaction networks showed that TNF was the core protein node. The microRNA-gene regulatory network showed that hsa-mir-124-3p interacted with differentially expressed genes; TNF, KYNU, RCAN1 and other related genes all interacted with environmental factors.
Conclusion
The gene expression of adipose tissue CD14+ cells are significantly changed in obese T2DM patients. TNF may play an important role in the process of obesity affecting the immune status of T2DM patients. Multiple microRNAs, transcription factors, and environmental factors also play a role in the above process. This study provides new material and new ideas for further exploration of the impact of obesity on T2DM patients.
Keywords: obesity; Type 2 diabetes mellitus; immunity; environmental factors, bioinformatics
糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一种常见的慢性非传染性疾病，其发病率在世界范围内的很多国家均呈上升趋势[1]。2017年全球约1/11的成年人患有DM，患病人数高达4.45亿，在20~79岁的人群中有400万人死于DM，DM的卫生支出占全球总卫生支出的12%[2-3]。2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus，T2DM)是DM的主要类型，其发病主要与遗传因素、环境因素有关[4]。传统观点[5]认为肥胖是T2DM的危险因素，可使T2DM的发病风险升高5~8倍。目前学者对DM的发病机制研究不断深入，但对于肥胖影响DM的发病机制仍不清楚，值得进一步深入发掘。
基因芯片技术不断应用于DM的发病机制研究，产生了越来越多的基因表达数据[6-8]，尤其在肥胖影响T2DM患者的免疫状况方面。研究者[9-11]力求通过细致分析这些数据，挖掘出更多有意义的生物学信息促进T2DM的发病机制研究，以改善T2DM预防和治疗效果。为进一步深入探讨肥胖对T2DM患者免疫状况的影响，本研究利用生物信息学技术分析基因表达(Gene Expression Omnibus，GEO)数据库中GSE54350的基因表达数据。该数据集来自于肥胖型T2DM患者和肥胖非T2DM患者内脏脂肪组织CD14+细胞的全基因组基因的表达检测。本研究首先在数据预处理基础上，筛选肥胖型T2DM患者与肥胖非T2DM患者内脏脂肪组织CD14+细胞的差异表达基因(differentially expressed genes，DEGs)，通过富集分析诠释其生物学功能；其次，建立蛋白质-蛋白质互作(protein-protein interaction，PPI)网络、microRNA-基因调控网络以及转录因子(transcription factor，TF)基因调控网络，寻找可能对T2DM发病具有重要意义的关键蛋白质；最后，分析DEGs与环境因子的关系，寻找环境因子影响T2DM发病的因素，为预防和治疗T2DM提供科学依据。
1. 材料与方法
1.1. 数据的预处理及归一化处理
在美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)的GEO数据库中，以“Diabetes”为关键词，收集DM相关的表达谱数据，根据数据库的摘要及实验设计筛选芯片数据。数据集纳入标准：1)病例对照研究设计，病例组来源为肥胖型T2DM患者，对照组来自肥胖非T2DM患者；2)标本来源必须为人类；3)样本量≥5。最终获得Elise Dalmas等提交的编号为“GSE54350”的数据集。该数据集来自于12份人脂肪组织CD14+细胞样本，其中6份来自肥胖型T2DM患者(Case)，6份来自肥胖非T2DM患者(Control)；共包含47 231个探针。在正式分析前，本研究首先采用Network Analyst[12-13]对GSE54350数据进行归一化处理，其必要性在于该芯片可能存在多个探针对应于一个基因名称，此时需要计算平均数；然后进行对数转化改善其正态化特征，以确保数据的稳定性，进而保证后续分析结果的可靠性。
1.2. DEGs的筛选
将GSE54350数据集上传至Network Analyst (https://www.networkanalyst.ca/)，采用Limma法(https://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/limma.html)分析和筛选两组的DEGs，筛选标准为P Adjusted<0.05且log2(Fold change)>1；均严格按照操作指南进行操作。
1.3. 基因功能(gene ontology，GO)和KEGG(kyoto encycopedia of genes and genomes)信号通路富集分析
将DEGs上传至STRING 11.0(https://string-db.org/)和Meta scape在线软件，行GO和KEGG富集分析。GO包括生物学过程(biological process，BP)、分子功能(molecular function，MF)和细胞学组分(cellular components，CC)，可以对特定基因的功能进行多方面的限定和描述。KEGG是一个整合了基因组、化学和系统功能信息的综合数据库，其中的KEGG Pathway专门存储不同物种基因信号通路的信息，使用最为广泛。
1.4. PPI网络建立
将GSE54350数据集的DEGs所对应的蛋白提交至STRING后，获得PPI网络信息，随后导入一个免费的、开放源的计算网络Cytoscape(https://www.cytoscape.org/)获得各节点的拓扑特性，绘制直观的PPI网络图。根据每个DEGs之间的交互作用情况，寻找核心蛋白质。
1.5. MicroRNA对DEGs的调控作用
为了解DEGs的上游microRNA的调控情况，采用Network analyst建立microRNA-基因网络，并通过Cytoscape可视化后，分析microRNA对DEGs的调控关系。
1.6. TF对DEGs的调控作用
TF可特异性结合到靶基因调控区的顺式作用元件上，实现调节基因表达强度、调控靶基因的时空特异性表达及应答外界环境刺激的蛋白质等功能。为了解对DEGs具有特异性调控作用的TF，本研究进一步建立了TF-基因调控网络，分析DEGs的调控作用关系。
1.7. 环境因子对DEGs的影响作用
环境因子在特定条件下可以导致哺乳动物的基因变异。为了解环境因子对肥胖型T2DM患者免疫状况的影响，采用Network analyst和CTD数据库(Comparative Toxicogenomics Database，http://ctdbase.org/)的Chemical-Gene Interaction的功能，检索与 DEGs具有潜在关联的环境因子，建立环境因子-DEGs网络，筛选和寻找影响肥胖型T2DM患者免疫状况的潜在重要环境因子。
2. 结果
2.1. 数据的预处理及质量评价
对基因芯片数据GSE54350进行归一化、正态化处理后得到各标本芯片表达的箱式图和分布密度曲线分别见图1A，1B。图1A显示12份标本的基因表达数据均数基本处在一条直线上；图1B显示各样本基因表达数据分布密度基本重合，正态性明显改善，提示数据质量稳定，可用于下一步分析。
图1.
经数据预处理后各样本基因表达数据的箱式图(A)和分布密度曲线(B)
Figure 1 Box diagram (A) and distribution density curve (B) of gene expression data of each sample after data preprocessing
2.2. DEGs筛选及分析
根据既定的筛选标准，通过差异表达分析，共获得19个DEGs，均为上调基因。DEGs的主要信息见表1，DEGs的分布情况见图2A，上调最明显的4个基因(SLC16A10、NLRP3、CCL18、FGL2)的分布模式见图2B~2E。
表1.
两组的差异表达基因
Table 1 Differentially expressed genes in the 2 groups
| No. | Symbols | Log2(Fold change) | P | P Adjusted | No. | Symbols | Log2(Fold change) | P | P Adjusted |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 1 | SLC16A10 | 2.5326 | 6.95×10-7 | 0.0110 | 11 | ARPC1B | 1.1262 | 3.84×10-5 | 0.0368 |
| 2 | NLRP3 | 1.8131 | 1.45×10-6 | 0.0114 | 12 | PTPN1 | 1.2489 | 1.40×10-5 | 0.0221 |
| 3 | CCL18 | 1.6618 | 2.24×10-6 | 0.0118 | 13 | VSIG4 | 1.2018 | 1.17×10-5 | 0.0221 |
| 4 | FGL2 | 1.5069 | 3.48×10-6 | 0.0393 | 14 | CCNH | 1.1811 | 4.72×10-5 | 0.0393 |
| 5 | PTX3 | 1.4703 | 2.74×10-5 | 0.0362 | 15 | LIPN | 1.0908 | 6.40×10-5 | 0.0482 |
| 6 | TNF | 1.4263 | 1.10×10-5 | 0.0221 | 16 | RGS1 | 1.0886 | 5.94×10-6 | 0.0176 |
| 7 | SAMSN1 | 1.3930 | 6.66×10-6 | 0.0176 | 17 | NINJ1 | 1.0820 | 5.72×10-5 | 0.0453 |
| 8 | FGR | 1.3340 | 3.48×10-6 | 0.0138 | 18 | RCAN1 | 1.0804 | 3.06×10-5 | 0.0368 |
| 9 | CTSZ | 1.3226 | 1.27×10-5 | 0.0221 | 19 | KYNU | 1.0786 | 2.06×10-5 | 0.0296 |
| 10 | RNF144B | 1.2876 | 3.27×10-5 | 0.0368 |
SLC16A10：溶质载体家族蛋白16成员A10抗体；NLRP3：含有pyrin结构域的蛋白3；CCL18：C-C基序趋化因子配体18；FGL2：纤维蛋白原样2凝血酶原酶；PTX3：人正五聚蛋白3；TNF：肿瘤坏死因子；SAMSN1：结构域、sh3结构域和核定位信号1；FGR：原癌基因Src家族酪氨酸激；CTSZ：组织蛋白酶；RNF144B：环指蛋白144B；ARPC1B：肌动蛋白2/3复合物亚基1B；PTPN1：蛋白酪氨酸磷酸酯酶非受体1型；VSIG4：重组人V-set和Ig结构域蛋白4；CCNH：细胞周期蛋白H；LIPN：人脂肪酶N；RGS1：蛋白信号调节因子1；NINJ1：神经损伤诱导蛋白1；RCAN1：钙调神经磷酸酶调节因子1；KYNU：犬尿氨酸酶。
图2.
DEGs的火山图及差异表达最明显的4个基因的表达模式
Figure 2 Volcano plots of differential expression genes and expression patterns of the first 4 genes in differential expression
A: Volcanic maps; B: SLC16A10 gene expression pattern; C: NLRP3 gene expression pattern; D: CCL18 gene expression pattern; E: FGL2 gene expression pattern.
2.3. GO和KEGG富集分析
GO结果显示：19个DEGs主要涉及ARP2/3复合体调控肌动蛋白细胞骨架、与吞噬作用相关的Fcγ受体信号转导、蛋白质复合物合成的正向调节等生物学过程，同时涉及促进氨基酸及蛋白质结合、调节酶活性等分子功能，还涉及ARP2/3蛋白复合物、肌动蛋白细胞骨架、细胞前缘、板状伪足等细胞成分(图3)。
图3.
差异表达基因的Top 5 GO富集分析结果
Figure 3 Top 5 GO enrichment analysis results of differentially expressed genes
FDR: False discovery rate; BP: Biological process; CC: Cellular component; MF: Molecular function.
KEGG信号通路富集结果显示19个DEGs主要参与致病性大肠杆菌感染、核苷酸切除修复、基础TF、上皮细胞的细菌入侵、沙门氏菌感染、Fcγ受体介导的吞噬作用、调节肌动蛋白细胞骨架等信号通路(图4)。
图4.
差异表达基因的Top 10 KEGG富集分析结果
Figure 4 Top 10 KEGG enrichment analysis results of differentially expressed genes
FDR: False discovery rate.
2.4. PPI网络的建立
DEGs相应的PPI网络包含1个典型的主网络和3个子网络图。整个网络由24个节点组成，其中肿瘤坏死因子(TNF)在网络图中与6个蛋白质之间有相互作用关系，如果删除TNF这个节点，网路结构将失去稳定性，故TNF为主网路的核心节点(图5)。
图5.
差异表达基因的PPI网络
Figure 5 PPI network of differential expression genes
2.5. MicroRNA对DEGs的调控作用
MicroRNA-DEGs关系网络显示：16个microRNA (hsa-mir-4438、hsa-mir-21-5p、hsa-mir-335-3p、hsa-mir-587等)与DEGs之间存在调节作用，其中hsa-mir-124-3p与4个DEGs(ARPC1B、RNF144B、RCAN1、SAMSN1)具有靶向调节关系，has-mir-6807-5p、has-mir-26b-5p分别与3个DEGs具有靶向关系，SLC16A10可同时受6种microRNA的调控(图6)。
图6.
MicroRNA-DEGs调控网络
Figure 6 MicroRNA-DEGs regulatory network
Blue diamonds represent microRNA and red ovals represent DEGs.
2.6. TF对DEGs的调控作用
TF对DEGs的调控作用见图5，TF-DEGs网络显示47种TF对15个DEGs具有调节作用，其中PIPN1受26种TF的调控，CTSZ受22种TF的调控，ARPC1B受17种TF的调控(图7)。
图7.
TF-DEGs调控网络
Figure 7 TF-DEGs regulation network
Green diamonds represent the transcription factors and red ovals represent DEGs.
2.7. 环境因子对DEGs的调控作用
环境因子- DEGs调控网络显示维甲酸、三氧化二砷等18种环境因子可与17个DEGs具有交互作用。其中，TNF受17种环境因子(包括镍、锌等)的影响与调控；KYNU受14种环境因子(包括维甲酸、镍、硫化镍等)的影响与调控；RCAN1受12种环境因子(包括锌、镍等)的影响与调控(图8)。
图8.
环境因子-DEGs调控网络
Figure 8 Environmental factors-DEGs regulation network
Blue diamonds represent environmental factors and red ovals represent DEGs.
3. 讨论
为进一步了解肥胖型T2DM患者机体的免疫状况变化和分子特征，本研究采用系统生物信息学技术(GO和KEGG信号通路富集分析、构建PPI网络、建立microRNA-DEGs、TF-DEGs、环境因子-DEGs调控网络等)分析肥胖型T2DM患者与肥胖非T2DM患者脂肪组织的CD14+细胞标本的全基因组表达数据，共筛选出19个DEGs。这19个DEGs可能对肥胖型T2DM的免疫状况有潜在的影响，其中，SLC16A10基因上调最为明显，该基因主要介导质膜氨基酸的转运，且已有研究[14]表明肥胖型T2DM患者血浆游离氨基酸水平与正常人相比有明显改变，本研究结果是对上述结果的补充和扩展，提示SLC16A10基因上调可能是引起肥胖型T2DM患者血浆游离氨基酸水平变化的始动因素之一。NLRP3主要参与调节炎症反应、免疫反应及细胞凋亡。研究[15]提示NLRP3炎性体活动失调导致不受控制的炎症，是许多慢性疾病的基础。关闭NLRP3炎性体但不关闭其他炎性体的药物，对多种炎症性疾病治疗有效。CCL18作为一种炎性趋化因子，与肿瘤、免疫性及炎症性非肿瘤疾病有联系[16-17]。上述研究表明：肥胖型T2DM患者处于一定程度的炎症状态，较为敏感的免疫因子处于激活状态。
GO和KEGG信号通路富集分析结果显示：19个DEGs的功能主要集中于促进氨基酸和蛋白质结合及参与吞噬作用，进一步说明肥胖可能首先影响T2DM患者机体的代谢和内分泌功能，进而引起机体的免疫反应，这在一定程度上解释了肥胖是T2DM的危险因素。PPI显示TNF在网络结构中起重要作用，TNF是肿瘤坏死因子超家族中的一种多功能促炎因子。脂肪组织可分泌TNF，并在胰岛素抵抗过程中发挥关键作用。邢茂娟等[18-19]研究发现TNF在T2DM患者体内呈高表达。FGL2与TNF、FGR、VSIG4存在相互作用关系，研究[20]表明FGL2基因可影响不同糖环境中的多个基因表达，本研究结果与上述研究[18-20]发现相吻合。上述结果提示：TNF和FGL2可能在肥胖型T2DM的炎性反应及糖代谢紊乱中发挥一定作用。Hsa-mir-124-3p在microRNA-DEGs网络中对4个DEGs均有调节作用。李立平等[21]发现hsa-miR-124-3p在胃癌细胞中可靶向下调CD151蛋白质表达，从而影响胃癌的发生与发展，并认为hsa-miR-124-3p具有一定的免疫调节作用。Has-mir-6807-5p和has-mir-26b-5p均可调节3个DEGs，有研究[22]表明has-mir-6807-3p可促进肿瘤的生长和迁移，抑制细胞凋亡和细胞周期阻滞，发挥致癌作用。本研究筛选出的microRNA与肥胖及T2DM的具体关系目前研究较少，仍需在后续的研究中深入探讨。
TF-DEGs网络表明：核因子C(NFIC)、肝癌衍生生长因子(HDGF)、T细胞介导的转录调节因子Tbx21抗体(TBX21)、核心结合因子亚基β(CBFB)等对基因(≥5个)的调控更为紧密。NFIC属于NFI家族且其编码位置具有特异性，研究[23]表明小鼠牙根缺陷的形成与NFCI的缺失有关。Zhang等[24]认为HDGF在非小细胞肺癌组织中高表达提示预后不良。反-HDGF治疗对晚期非小细胞肺癌患者的骨转移有潜在的保护作用[24]。TBX21在呼吸、消化、免疫等系统中均有相关研究[25-27]，目前还尚未见其与DM的关系报道。本研究建立的TF-DEGs网络为DM病因研究提供了一个新思路。
除了遗传因素，环境因素对T2DM的发生也具有重要的影响。本研究的分析结果显示镍、丙戊酸、维甲酸等化学因素对DEGs有直接作用。早有研究[28]发现：细胞膜结构上的镍与代谢具有一定相关性，且在DM患者体内血清镍水平与血糖水平呈正相关。本研究结果为上述现象提供了一定的分子证据。姚春萌等[29-30]研究发现全反式维甲酸既可对DM大鼠心脏的收缩和舒张有保护作用，又能减轻DM大鼠肾脏病理损伤，可延缓DM肾病的恶化。丙戊酸常作为药品与丙戊酸钠混合使用，可有效改善胰岛B细胞功能，发挥调节内分泌作用[31]。结合本研究结果可知，环境因素对DM的影响具有两面性，促进有益的环境因素，抑制有害的环境因素有利于预防和治疗DM。
综上所述，肥胖型T2DM患者脂肪组织CD14+细胞的基因表达发生了一定的改变，TNF可能在肥胖影响T2DM患者免疫状况过程中发挥重要作用；microRNA、TF和环境因子参与了肥胖影响T2DM患者免疫过程，但其具体作用机制仍需进一步深入研究。本研究为深入探索肥胖影响T2DM患者的免疫机制提供了新素材和思路。
利益冲突声明
作者声称无任何利益冲突。
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