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. 2024 Jan 20;44(1):108–118. [Article in Chinese] doi: 10.12122/j.issn.1673-4254.2024.01.13

新风胶囊抑制软骨细胞炎症和细胞外基质降解：基于调控miR-502-5p/TRAF2/NF-κB轴

Xinfeng Capsule alleviates interleukin-1β-induced chondrocyte inflammation and extracellular matrix degradation by regulating the miR-502-5p/TRAF2/NF-κB axis

周 巧 1,3,*, 刘 健 2, 万 磊 2, 朱 艳 1, 齐 亚军 3, 胡 月迪 3
PMCID: PMC10878885  PMID: 38293982

Abstract

目的

探讨新风胶囊（XFC）对白介素（IL）-1β诱导的软骨细胞功能的影响及作用机制。

方法

构建IL-1β诱导的软骨细胞炎症模型；SD大鼠灌胃制备XFC含药血清。细胞增殖实验（CCK-8）和流式细胞术筛选最佳XFC含药血清浓度；双荧光素酶报告分析miR-502-5p和TRAF2的靶向关系。构建miR-502-5p抑制表达质粒（inhibitor）及阴性对照组，转染至软骨细胞中。分为对照组（NC），IL-1β组，XFC组，IL-1β+NC-inhibitor，IL-1β+miR-502-5p inhibitor，IL-1β+miR-502-5p inhibitor+XFC最佳含药血清组，酶联免疫吸附试验（ELASA）检测IL-1β、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、IL-4、IL-10的水平。逆转录PCR（RT-PCR）、蛋白质免疫印迹实验（WB）、免疫荧光法检测Ⅱ型胶原α1（COL2A1）、基质金属蛋白酶13（MMP13）、软骨蛋白聚糖抗体（ADAMTS5）和miR-502-5p/TRAF2/NF-κB基因的表达。

结果

与NC组相比，IL-1β组中软骨细胞活力下降，细胞凋亡率升高，且miR-502-5p、IL-4、IL-10和COL2A1表达下降，IL-1β、TNF-α和ADAMTS5、MMP13、TRAF2、NF-κB p65表达升高（P＜0.05）。筛选得出20% XFC为最佳含药血清浓度。与IL-1β组相比，XFC含药血清干预后，软骨细胞活力升高，细胞凋亡率下降，IL-1β、TNF-α、ADAMTS5、MMP13、TRAF2、NF-κB p65表达下降，miR-502-5p、IL-4、IL-10和COL2A1表达升高（P＜0.05）。与NC-inhibitor相比，转染miR-502-5p inhibitor后，IL-1β、TNF-α、ADAMTS5、MMP13、TRAF2、NF-κB p65表达升高，miR-502-5p、IL-4、IL-10和COL2A1表达下降；与miR-502-5p inhibitor相比，将miR-502-5p inhibitor转染的软骨细胞和最佳XFC含药血清共培养后，XFC含药血清能逆转miR-502-5p抑制状态对软骨细胞炎症和ECM的影响。

结论

XFC抑制软骨细胞炎症、细胞外基质降解，减轻IL-1β诱导的软骨细胞损伤，其机制可能是通过调节miR-502-5p/TRAF2/NF-κB轴。

Keywords: miR-502-5p, 骨关节炎, 新风胶囊, 炎症, 细胞外基质

骨关节炎（OA）是最常见的关节退行性疾病，其特征是软骨损伤和炎症反应[1]。OA发病机制尚不明确，中医药治疗OA疗效确切[2]。关节软骨由独特的细胞外基质（ECM）组成，维持关节软骨内部环境的稳态，包括软骨蛋白聚糖抗体（ADAMTS5）、Ⅱ型胶原蛋白（COL2A1）、基质金属蛋白酶（MMP）等[3]。炎症加速诱导软骨细胞凋亡，导致基质分子丢失，破坏ECM分解和合成平衡[4]。细胞因子，如肿瘤坏死因子α（TNF-α）、干扰素γ（IFN-γ）和转化生长因子-β等，影响ECM蛋白酶合成和降解。另一方面，ECM也参与了炎症细胞的浸润、组织损伤和再生等过程。ECM成分的异常表达会影响免疫细胞的活化、分化和存活[5]。因此，炎症和ECM代谢之间的串扰是OA发病的重要因素。MiRNA是长度约为20~25个核苷酸的小RNA，可以靶向不同途径来调节软骨细胞稳态[6]。既往研究表明，miR-502-5p抑制IL-1β诱导的软骨细胞细胞凋亡和炎症反应，缓解白介素（IL）-1β诱导的ECM代谢失衡[7]。TRAF2是肿瘤坏死因子受体相关因子（TRAF）蛋白家族的一员，是调节软骨细胞凋亡和炎症方面关键蛋白[8]。NF-κB信号通路的异常激活与软骨破坏、滑膜炎症等密切相关[9]。相关文献研究表明，调节p53/miR-502-5p/TRAF2通路能减轻IL-1β诱导的OA软骨细胞损伤[10]。TRAF2-NF-κB信号通路参与机体的炎症反应和免疫应答[11]。但miR-502-5p、TRAF2、NF-κB三者之间在OA软骨细胞的机制尚未报道。

中药复方新风胶囊（XFC，专利号：ZL201310011369.8，注册号：皖药制字Z20050062）全方由黄芪、薏苡仁、蜈蚣、雷公藤组成，具有健脾化湿通络法功效，广泛应用于临床[12, 13]。既往研究表明，XFC降低OA中异常的炎症免疫反应，减轻OA患者的关节疼痛等症状[14]。前期体外实验证实XFC通过miR-23a-3p/PTEN/PI3K/AKT/mTOR抑制OA软骨细胞中免疫炎症反应[15]。既往研究关注XFC调节OA中免疫炎症分子机制[15]，而XFC调节OA软骨细胞ECM代谢的机制尚缺乏。关节软骨细胞和细胞外基质是关节软骨的主要组成部分，也是参与OA进展的重要角色[16]。细胞外基质代谢紊乱导致OA关节软骨破坏，进而出现功能丧失。炎症和ECM代谢密切相关。ECM衍生的片段和某些分子的改变，除了发挥趋化活性外，还可能激活免疫细胞，促进炎症反应，进而激活了关键转录因子和炎症信号传导途径，最终造成了关节软骨被破坏、侵蚀[17]。因此，深入了解软骨细胞及细胞外基质在OA发生、发展中的作用，探索调节OA中ECM代谢的有效方法具有重要意义。

IL-1β体外诱导软骨细胞（CH）炎症模型是经典的细胞模型[18]。本研究通过构建IL-1β诱导的软骨细胞炎症模型，以miR-502-5p/TRAF2/NF-κB组合为研究主线，以ECM代谢为研究靶点，以XFC为干预手段，探讨XFC对IL-1β诱导的软骨细胞损伤的影响并从细胞水平分析其抗OA的可能机制，以期为药物的应用提供实验基础。

1. 材料和方法

1.1. 主要药物和试剂

新风胶囊（组成：薏苡仁、黄芪、蜈蚣、雷公藤，皖药制字Z20050062，规格：0.4 g/粒，由安徽中医药大学第一附属医院制剂中心提供。人软骨细胞（CH）购于上海赛百慷生物技术股份有限公司，293T细胞购于赛默飞世尔科技有限公司。

白介素4（IL-4）、白细胞介素1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素10（IL-10）购自武汉基因美科技有限公司。p-NF-κB p65抗体（CST），TRAF2抗体（bioss，p-IKBα抗体（Bioworld）；CCK8试剂盒（BIOSS），Annexin V-FITC/PI apoptosis kit（联科生物），Ficoll-Paque（GE）。Trizol（Life technogies）；RIPA细胞裂解液购自Beyotime；DMEM培养基购自美国Gibco公司；BD周期试剂盒（BD），4%多聚甲醛固定液（ebiogo），抗荧光淬灭封片剂（含DAPI）（ebiogo），胰酶消化液（Gibco）。双荧光素酶报告实验试剂盒（Promega生物公司），Lipofectamine2000（赛默飞世尔科技有限公司）。

酶标仪（雷杜，RT-6100），离心机（安徽嘉文，JW3021HR），倒置显微镜（OLYMPUS），培养箱（Thermo），流式细胞仪（BECKMAN，CytoFLEX），高速台式冷冻离心机（安徽嘉文仪器装备有限公司），培养箱（Thermo），荧光定量PCR仪（Thermo Scientific），数字切片扫描仪（3DHISTECH）。

1.2. XFC含药血清的制备

SPF级雄性SD大鼠40只，体质量180~220 g，购自安徽省动物实验中心，许可证号SCXK2020-0001，随机分为正常组、XFC组，采用经人-大鼠体表面积比值折算成相当于人临床等效用量，324 mg/kg，按2 mL/100 g体质量进行给药，1次/d，连续给药7 d，末次给药1 h后，分别腹主动脉取血，2500 r/min离心15 min取血清，无菌操作分装，-80 ℃保存备用。本动物实验经安徽中医药大学动物实验伦理委员会批准，伦理号：AHUCM-rats-2023020。

1.3. XFC含药血清对软骨细胞功能的影响

1.3.1. CCK-8检测细胞增殖

胰酶消化对数期软骨细胞（浓度至5~10×104/mL），设置阴性对照组（空白组），IL-1β、10.0%、20.0%和40.0% XFC含药血清，孵育24、48或72 h，每孔加入CCK-8 10 μL，培养4 h。在酶联免疫检测仪测量各孔的吸光值A450 nm。

1.3.2. 流式细胞术（FCM）检测细胞凋亡和细胞周期

取对数期细胞，加入5 μLAnnexin V-FITC和10 μL PI，室温避光孵育5 min，加入缓冲液重悬后，流式细胞仪测定细胞凋亡。另加入25 μL碘化丙啶染色液（×20）和10 µL RNaseA（×50）混匀，测定细胞周期。

1.4. 软骨细胞培养和质粒转染

软骨细胞以含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基，在37 ℃、体积分数5% CO2培养箱中培养。取对数生长期细胞，正常培养的细胞作为对照组（NC）；用10 ng/mL的IL-1β刺激软骨细胞（模拟软骨细胞炎症损伤）作为IL-1β组，用最佳浓度XFC含药血清和10 ng/mL的IL-1β处理软骨细胞，设为XFC组，将miR-502-5p抑制表达质粒及阴性对照转染至软骨细胞6 h后，再用10 ng/mL的IL-1β处理24 h，分为（4）NC-inhibitor（IL-1β + NC-inhibitor）；（5）miR-502-5p inhibitor（IL-1β + miR-502-5p inhibitor）；（6）miR-502-5p inhibitor+XFC（IL-1β+miR-502-5p inhibitor+XFC最佳含药血清）。

1.5. 双荧光素酶实验验证miR-502-5p和TRAF2靶向关系

使用StarBase v2.0数据库预测miR-502-5p与TRAF2的结合位点，进行双荧光素酶报告确定TRAF2和miR-502-5p之间的结合关系，TRAF2野生型（TRAF2-WT）和突变型（TRAF2-MUT）重组荧光素酶报告载体质粒由南京金贝津生物科技有限公司构建。TRAF2-WT基因启动子荧光素酶报告基因序列：CTCTGGGCCTCAGAACTGTGCTGCCTGTGTTCA CGAGGGCATATATGAAGAAGGCATTTCTATTTTA GAAAGCAGTTCGGCCTTCCCAGATAATGCTGCC CGCAGGGAGGTGGAGAGCCTGCCGGCCGTCTG TCCCAGTGATGGATGCACCTGGAAGGGGACCCT GAAAGAATACGAG，TRAF2-MUT基因启动子荧光素酶报告基因序列：CTCTGGGCCTCAGAACTGTGC TGCCTGTGTTCACGAGGGCATATATGAAGAAGG CATTTCTATTTTAGAAAGCAGTTCGGCCTTCTAA TGCCATGCTGCCCGCAGGGAGGTGGAGAGCCT GCCGGCCGTCTGTCCCAGTGATGGATGCACCTG GAAGGGGACCCTGAAAGAATACGAG。hsa-miR-502-5p基因序列是AUCCUUGCUAUCUGGGUGC UA。具体步骤如下：将用于转染的293T细胞和目的质粒铺在96孔板中，待细胞密度达到80%为宜。将10 μL DMEM与0.16 μg的hsa-TRAF2-3UTR目的质粒（野生型和突变型）以及5 pmol的hsa-miR-502-5p和Negative Control（NC）充分混匀后室温放置（溶液A），之后将10 μL DMEM与0.3 μL的转染试剂（Lipofectamine2000，浓度为0.8 mg/mL）充分混匀（溶液B），室温放置5 min。再将溶液A与溶液B充分混匀，室温放置20 min后，将转染混合物加入细胞，37 ℃，5% CO2培养。转染6 h后换取新鲜DMEM培养基，继续转染48 h后收集细胞检测。按照双荧光素酶报告实验试剂盒说明书操作，测定记录Renilla luciferase值，即为荧光素酶活性。细胞分组：TRAF2-WT+mimics-NC、TRAF2-WT + miR-502-5p mimics、TRAF2-MUT + mimics-NC和TRAF2-MUT+miR-502-5p mimics。

1.6. ELASA检测炎症因子

收集各组细胞上清液，按照各试剂盒说明书进行操作，检测IL-1β、TNF-α、IL-4、IL-10的表达。

1.7. RT-PCR检测ECM产物（COL2A1、MMP-13、ADAMTS5）和miR-502-5p、TRAF2、NF-κB p65 mRNA的表达

TRIzol试剂盒提取细胞的总RNA，PrimeScript™ RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒进行逆转录。qRT-PCR检测试剂盒和SYBR混合物在实时PCR系统上进行分析。U6小核糖核酸（U6）或β-actin作为内部参考基因。通过2-ΔΔCt方法计算miR-502-5p、TRAF2、NF-κB p65、ADAMTS5、MMP 13和COL2A1，以及β-actin和U6的相对表达。引物序列是由Sangon Biotech（中国上海）设计并获得的，详细的引物序列见表 1。

表 1.

RT-PCR各基因引物序列

Primer sequences for qRT-PCR

Gene Amplicon size (bp) Forward primer (5'→3') Reverse primer (5'→3')
β-actin 96 CCCTGGAGAAGAGCTACGAG GGAAGGAAGGCTGGAAGAGT
U6 94 CTCGCTTCGGCAGCACA AACGCTTCACGAATTTGCGT
MMP13 98 CAGAACTTCCCAACCGTATTGAT TGTATTCAAACTGTATGGGTCCG
ADAMTS5 102 GTGTCACATGAATGATGCCC CGACCCTCAAGAACTTTTGC
COL2A1 104 TGCATGAGGGCGCGGTA GGTCCTGGTTGCCGGACAT
miR-502-5p 61 ACACTCCAGCTGGGATCCTTGCTATCTGG TGGTGTCGTGGAGTCG
miR-502-5p-RT CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGTAGCAC
TRAF2 168 GAAGGGAGCATTCCTAGACC TGGCAAGCTCTCACACTTTA
NF-κB p65 130 AACCTGGGAATCCAGTGTGT GCACAGCATTCAGGTCGTAG
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1.8. Western blotting检测TRAF2、p-IKBα、p-NF-κB p65蛋白表达

RIPA细胞裂解液分离提取总蛋白，用NanoDrop 3000对蛋白浓度进行定量。用十二烷基硫酸钠（SDS）-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分离蛋白。主要抗体如下：抗p-NF-κB p65（1∶1000；Rabbit），抗p-IKBα（1∶1000；Rabbit），TRAF2（1∶1000；Rabbit）。按照1∶20 000用二抗稀释液稀释辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗。使用增强化学发光（ECL）检测试剂盒进行化学发光。

1.9. 免疫荧光染色分析p-IKBα、p-NF-κB p65蛋白平均荧光强度

收集各组细胞，每孔加入4%多聚甲醛固定20 min后，PBS洗涤3次。每孔加入200 L 0.5%Triton完全覆盖，室温孵育30 min，滴加山羊血清封闭液后，滴加足量的一抗，p-NF-κB p65（1∶200），和p-IKBα（1∶200），置于37 ℃培养箱孵育60 min。除去一抗，滴加足量的免疫荧光二抗（山羊抗小鼠/兔1∶400），将爬片取出，用抗荧光淬灭封片剂（含DAPI）封片。数字切片扫描仪（Pannoramic MIDI）扫描荧光切片。

1.10. 统计学分析

SPSS 22.0（Chicago, IL, U.S.A.）软件进行数据统计，Graphpad绘制图表。Shapiro-Wilk法检查数据的正态性。用均数±标准差描述具有正态分布的连续变量。多组间比较采用单因素方差分析（ANOVA），两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2. 结果

2.1. 不同浓度XFC含药血清对IL-1β诱导的软骨细胞功能的影响

CKK-8结果显示，与NC组相比，IL-1β组软骨细胞活力下降（P＜0.01）。与IL-1β组相比，随XFC浓度的增加，软骨细胞活力逐渐升高，差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。与同一时间段20%XFC相比，培养24 h后，10%XFC细胞活力低于20%XFC，40%XFC浓度无明显变化；培养48 h后，10%和40%细胞活力低于20% XFC。继续培养72 h后，20%XFC细胞活力高于10% XFC，40%XFC浓度无明显变化（P＜0.05或P＜0.01）。20%XFC中48 h达到最大值（图 1）。

图 1.

图 1

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CKK-8检测细胞活力

CKK-8 assay for assessing cell viability in different groups. *P < 0.01 vs NC group; #P < 0.05, ##P < 0.01 vs IL-1β at the same time point, △P < 0.05, △△P < 0.01 vs 20% XFC.

FCM检测细胞周期的变化，与NC组相比，IL-1β诱导的软骨细胞G1的比例升高，S期、G2期比例明显下降（P＜0.01），表明IL-1β抑制软骨细胞的增殖；与IL-1β组相比，随XFC浓度的增加，软骨细胞G1的比例降低，G2期比例明显升高（P＜0.05或P＜0.01）。与20%XFC浓度相比，10%XFC和40%XFC浓度含药血清G1和S期的比例较高，G2期比例较低（P＜0.05或P＜0.01）。在20% XFC浓度时G1的比例降到最低，G2比例升高到最大值（表 2，图 2）。观察软骨细胞凋亡的情况，与NC组相比，IL-1β诱导的软骨细胞凋亡率升高（P＜0.01）；与IL-1β组比较，XFC干预后，软骨细胞中凋亡率下降（P＜0.05或P＜0.01）。与20%XFC组相比，10%XFC和40%浓度XFC细胞凋亡率较高（P＜0.05，图 3）。

表 2.

在不同浓度XFC含药血清作用下细胞周期分布

Cell cycle distribution in chondrocytes treated with different concentrations of XFC-medicated serum

Group G1 S G2
*P＜0.01 vs NC group; #P＜0.05, ##P＜0.01 vs IL-1β group, △ P＜0.05, △△P＜0.01 vs 20% XFC.
NC 60.04±0.05 2.34±0.03 37.62±0.02
IL-1β 84.47±0.04* 2.46±0.01 13.06±0.01*
10%XFC 71.16±0.05#△ 4.57±0.02#△ 24.25±0.04#△△
20%XFC 61.76±0.02## 2.23±0.03 36.01±0.02##
40%XFC 69.59±0.03#△ 5.95±0.05#△ 24.46±0.05#△△
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图 2.

图 2

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FCM检测细胞周期

Flow cytometry for cell cycle analysis in different groups. *P < 0.01 vs NC group; #P < 0.05, ##P < 0.01 vs IL-1β group, △P < 0.05, △△P < 0.01 vs 20% XFC.

图 3.

图 3

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FCM检测细胞凋亡

Flow cytometry for analyzing apoptosis of the chondrocytes with different treatments. *P < 0.01 vs NC group; #P < 0.05, ##P < 0.01 vs IL-1β group, △P < 0.05 vs 20% XFC.

结合CKK-8、细胞周期和细胞凋亡结果，最终，选择20%XFC作为最佳含药血清浓度。

2.2. miR-502-5p和TRAF2靶向关系的验证

双荧光素酶实验结果显示，miR-502-5p与TRAF2 3'-UTR-WT存在结合位点（图 4A）。构建含有野生型（TRAF2-WT）和突变型（TRAF2-MUT）的荧光素酶报告基因质粒。在TRAF2-WT组中，与mimics-NC组相比，miR-502-5p mimics组荧光素酶活性明显降低（P＜0.001），在TRAF2-MUT组中，miR-502-5p mimics组荧光素酶活性无显著变化（图 4B）。因此，说明miR-502-5p、TRAF2存在结合位点。

图 4.

图 4

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双荧光素酶报告检测miR-502-5p和TRAF2靶向关系

Dual luciferase reporter gene assay for verifying the targeting relationship between miR-502-5p and TRAF2. A: Schematic of hsa-miR-502-5p binding to has-TRAF2 site. B: Dual luciferase assay of miR-502-5p with TRAF2. ***P < 0.001.

2.3. XFC含药血清对IL-1β诱导的软骨细胞miR-502-5p、TRAF2、NF-κB p65 mRNA的影响

首先，将miR-502-5p inhibitor转染至IL-1β诱导的软骨细胞中，采用RT- qPCR检测转染效率。与inhibitor NC组相比，miR-502-5p inhibitor组miR-502-5p的表达降低（P＜0.01，图 5），说明转染效果较好，故以此进行后续实验。RT-PCR结果表明，与NC组相比，IL-1β刺激的软骨细胞中miR-502-5p mRNA表达下降，TRAF2、NF-κB p65mRNA相对表达上升（P＜0.05或P＜0.01）；而XFC含药血清共培养后，miR- 502- 5p mRNA表达升高，TRAF2、NF-κB p65 mRNA表达下降（P＜0.05）；转染miR-502-5p inhibitor后，TRAF2、NF-κB p65 mRNA表达明显升高，miR-502-5p mRNA表达降低（P＜0.05或P＜0.01）；将miR-502-5p inhibitor质粒和最佳XFC含药血清共培养，XFC含药血清能逆转miR-502-5p抑制状态下对通过TRAF2、NF-κB p65 mRNA的影响（P＜0.05或P＜0.01，表 3）。

图 5.

图 5

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miR-502-5p在IL-1β诱导软骨细胞中的转染效率

Transfection efficiency of miR-502-5p in chondrocytes induced by IL-1β. **P < 0.01.

表 3.

XFC含药血清对IL-1β诱导软骨细胞miR-502-5p、TRAF2、NF-κB p65 mRNA的影响

Effect of XFC-medicated serum on miR-502-5p, TRAF2 and NF-κB p65 mRNA expressions in IL-1β-induced chondrocytes

Group/indicator NC IL-1β XFC NC-inhibitor miR-502-5p inhibitor miR-502-5p inhibitor+XFC
*P＜0.05, **P＜0.01 vs NC group; #P＜0.05 vs IL-1β group, △P＜0.05, △△P＜0.01 vs NC-inhibitor group; & P＜0.05, && P＜0.01 vs miR-502-5p inhibitor group.
miR-502-5p mRNA 1.29±0.09 0.79±0.07** 1.16±0.01# 0.80±0.10 0.36±0.03△△ 0.82±0.05 &&
TRAF2 mRNA 0.79±0.07 1.12±0.09* 0.82±0.06# 1.12±0.19 1.44±0.05△ 0.89±0.07 &&
NF-κB p65 mRNA 1.26±0.01 1.43±0.07* 1.27±0.03# 1.42±0.13 1.66±0.03△ 1.32±0.01 &
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2.4. XFC含药血清对IL-1β诱导的软骨细胞炎症因子的影响

ELASA结果表明，与NC组相比，IL-1β诱导的软骨细胞中IL-1β、TNF-α表达高于NC组，IL-4和IL-10表达则下降（P＜0.05或P＜0.01），表明IL-1β诱导软骨细胞炎症状态；而将最佳XFC含药血清共培养后，XFC含药血清抑制IL-1β、TNF-α水平，上调IL-4和IL-10水平（P＜0.05或P＜0.01）；转染miR-502-5p inhibitor质粒后，IL-1β、TNF-α表达明显升高，IL-4和IL-10明显降低（P＜0.05）；将miR-502-5p inhibitor转染质粒和最佳XFC含药血清共培养，IL-1β、TNF-α明显降低，IL-4和IL-10明显升高（P＜0.01），XFC含药血清能逆转miR-502-5p抑制状态下对炎症因子的影响（表 4）。

表 4.

XFC含药血清对IL-1β诱导软骨细胞炎症因子的影响

Effect of XFC-medicated serum on inflammatory factors in IL-1β-induced chondrocytes

Group/indicator NC IL-1β XFC NC-inhibitor miR-502-5p inhibitor miR-502-5p inhibitor+XFC
*P＜0.05, **P＜0.01 vs NC group; #P＜0.05, ##P＜0.01 vs IL-1β group, △P＜0.05 vs NC-inhibitor group; & P＜0.01 vs miR-502-5p inhibitor group.
IL-1β (pg/mL) 30.26±4.89 43.49±3.78** 35.64±2.55# 41.24±4.90 47.97±7.49△ 37.09±2.80 &
TNF-α (pg/mL) 52.59±5.74 77.92±8.23** 65.27±3.47## 75.97±5.95 80.21±6.34△ 68.36±6.22 &
IL-4 (pg/mL) 18.51±2.61 13.18±3.39* 17.71±5.73# 13.95±2.84 10.53±2.12△ 19.32±5.34 &
IL-10 (pg/mL) 26.48±11.92 17.62±5.90** 22.67±4.01# 16.57±3.13 11.31±5.74△ 19.59±6.04 &
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2.5. XFC含药血清对IL-1β诱导的软骨细胞ECM代谢的影响

RT-PCR结果表明，与NC组相比，IL-1β组的ECM降解产物（ADAMTS5和MMP13mRNA）相对表达上升，软骨修复产物（COL2A1 mRNA）表达下降（P＜0.05或P＜0.01）；而XFC含药血清共培养后，ADAMTS5、MMP13、TRAF2 mRNA表达下降，COL2A1 mRNA表达升高（P＜0.05或P＜0.01）；转染miR-502-5p inhibitor后，ADAMTS5、MMP13、TRAF2表达明显升高，COL2A1 mRNA表达降低（P＜0.05）；而将miR-502-5p inhibitor转染质粒和最佳XFC含药血清共培养，XFC含药血清能逆转miR-502-5p抑制状态下对通过细胞ECM产物的影响（P＜0.05或P＜0.01，表 5）。

表 5.

XFC含药血清对IL-1β诱导软骨细胞ECM产物的影响

Effect of XFC-medicated serum on ECM products in IL-1β-induced chondrocytes

Group/indicator NC IL-1β XFC NC-inhibitor miR-502-5p inhibitor miR-502-5p inhibitor+XFC
*P＜0.05, **P＜0.01 vs NC group; #P＜0.05, ##P＜0.01 vs IL-1β group, △ P＜0.05 vs NC-inhibitor group; & P＜0.05, && P＜0.01 vs miR-502-5p inhibitor group.
COL2A1 mRNA 1.24±0.16 0.63±0.07** 1.15±0.03## 0.61±0.08 0.47±0.02△ 0.81±0.06 &
MMP13 mRNA 1.47±0.18 2.34±0.27** 1.79±0.06## 2.22±0.52 2.56±0.08△ 1.81±0.09 &&
ADAMTS5 mRNA 1.75±0.08 2.09±0.05* 1.83±0.08# 2.08±0.14 2.21±0.13△ 1.91±0.05 &
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2.6. XFC含药血清对IL-1β诱导的软骨细胞中TRAF2、p-IKBα、p-NF-κB p65蛋白水平的影响

IL-1β诱导软骨细胞中TRAF2、p-IKBα、p-NF-κB p65蛋白表达高于NC组（P＜0.01）；XFC含药血清干预共培养细胞后，蛋白表达水平下降（P＜0.01）；转染miR-502-5p inhibitor后，TRAF2、p-IKBα、p-NF-κB p65蛋白表达升高（P＜0.05）；与miR-502-5p inhibitor相比，将miR-502-5p inhibitor转染的软骨细胞和最佳XFC含药血清共培养后，TRAF2、p-IKBα、p-NF-κB p65蛋白表达下降（P＜0.01，图 6）。

图 6.

图 6

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XFC含药血清对IL-1β诱导软骨细胞TRAF2、p-IKBα、p-NF-κB p65蛋白表达的影响

Effect of XFC-medicated serum on protein expressiond of TRAF2, p-IKBα and p-NF-κB p65 in IL-1β-induced chondrocytes. A. WB band. B: Relative protein expression of p-NF-κB p65. C: Relative protein expression of p-IKBα. D: Relative protein expression of RAF2. aP < 0.01 vs NC group; bP < 0.01 vs IL-1β group, cP < 0.05 vs NC-inhibitor group; dP < 0.01 vs miR-502-5p inhibitor group.

2.7. XFC含药血清对IL-1β诱导的软骨细胞p-IKBα、p-NF-κB p65平均荧光强度表达的影响

与NC组相比，IL-1β刺激的软骨细胞中p-IKBα、p-NF-κB p65的平均荧光强度显著升高（P＜0.01）。XFC含药血清干预后，p-IKBα、p-NF-κB p65的平均荧光强度水平下降（P＜0.01）；与NC-inhibitor相比，转染miR-502-5p inhibitor后，p-IKBα、p-NF-κB p65的平均荧光强度相对升高（P＜0.01）；与miR-502-5p inhibitor相比，将miR-502-5p inhibitor转染的软骨细胞和最佳XFC含药血清共培养后，p-IKBα、p-NF-κB p65的平均荧光强度表达下降（P＜0.01，图 7、8）。

图 7.

图 7

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XFC含药血清对p-NF-κB p65平均荧光强度表达的影响

Effect of XFC-medicated serum on p-NF-κB p65 average fluorescence intensity (Immunofluorescence staining, original magnification: × 50). A: Histogram of mean fluorescence intensity (Mean ± SD). aP < 0.01 vs NC group; bP < 0.01 vs IL-1β group, cP < 0.01 vs NC-inhibitor group; dP < 0.01 vs miR-502-5p inhibitor group. B: Nuclei are in blue, positive expression location is in green, Merge is the result of nucleus-protein overlap.

图 8.

图 8

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XFC含药血清对p-IKBα平均荧光强度表达的影响

Effect of XFC-medicated serum on p-IKBα average fluorescence intensity (Immunofluorescence staining, ×50). A: Histogram of mean fluorescence intensity (Mean±SD). aP < 0.01 vs NC group; bP < 0.01 vs IL-1β group, cP < 0.01 vs NC-inhibitor group; dP < 0.01 vs miR-502-5p inhibitor group. B: Nuclei are in blue, positive expression location is in green, Merge is the result of nucleus-protein overlap.

3. 讨论

OA中炎症微环境的失衡，导致低度炎症，是软骨退化和滑膜增殖的原因[19]。以中医理论指导和临床实践基础上的新风胶囊，功于健脾化湿通络，正对痹证“脾虚湿盛、脾虚致痹”的病因病机[20]，治疗OA的临床疗效明显[21, 22]，其作用机制值得进一步研究。新风胶囊主要由黄芪、薏苡仁、雷公藤、蜈蚣组成。方中黄芪、薏苡仁，具有补气健脾化湿之功。现代药理学研究也表明黄芪多糖通过抑制Toll样受体4/核因子κB p65通路的激活改善KOA的ECM降解、炎症反应，改善关节损伤[23]。薏苡仁酯可以减轻CIA模型大鼠关节的炎症反应[24]。臣药雷公藤和蜈蚣，通络，止痹痛。雷公藤有效成分雷公藤甲素可以改善CIA大鼠软骨组织损伤[25]。蜈蚣外达经络，又内走筋骨，可治顽痹，药理学研究表明蜈蚣可有效减轻CIA大鼠关节炎性细胞浸润和关节软骨损伤，达到减轻关节疼痛的效果[26]。

促炎因子，如TNF-α、IL-1β和IL-6的作用与OA的发病机制有关。炎症介质进一步可触发软骨细胞外基质降解，破坏软骨内稳态[27]。COL2A1的减少加速了软骨细胞肥大[28]。MMP-13是参与软骨降解的主要MMP，它具有切割Ⅱ型胶原的特殊能力[29]。ADAMTS5是OA发病机制中的主要聚集酶，是关节软骨分解和基质丧失的主要原因[30]。MicroRNA（miRNA）可以改变mRNA的表达，从而改变特定基因的表达，调节OA软骨细胞基因转录[31]。先前的研究发现，miR-502-5p在IL-1β诱导的软骨细胞中显著下调[32]，但目前miR-502-5p在OA中的调节功能研究较少。NF-κB参与OA软骨细胞分解代谢和滑膜炎症[33]。TRAF2是NF-κB通路的关键介质。

IL-1β激活MMPs诱导软骨降解，并抑制聚集聚糖的合成[34]。本研究中，用IL-1β诱导软骨细胞模拟炎症反应，结果表明，软骨细胞活力降低，抑制软骨细胞增殖，凋亡率升高，抑炎因子（IL-4和IL-10）下降，促炎因子（IL-1β、TNF-α）升高，表明模型构建成功。NF-κB在调节炎症免疫反应中起重要作用。IL-1β激活的NF-κB途径与多种炎症病理有关[35]。活化的NF-κB分子可诱导关节破坏，导致OA的进展。Lin等[36]发现川柏素通过抑制NF-κB来抑制IL-1β诱导的软骨细胞炎症。在本研究中，我们发现IL-1β诱导软骨细胞中miR-502-5p、COL2A1 mRNA水平下降，TRAF2、NF-κB p65、ADAMTS5和MMP13mRNA相对表达水平上升，表明IL-1β诱导的软骨细胞存在miR-502-5p、TRAF2、NF-κB表达异常，ECM代谢紊乱。CKK-8和流式细胞术实验筛选最佳的含药血清浓度是20%的含药血清浓度，经XFC含药血清干预后，IL-1β诱导的软骨细胞凋亡率下降，细胞活力升高，表明XFC含药血清对软骨细胞有保护作用。

双荧光素酶报告验证TRAF2可以作为miR-502-5p的下游靶标。转染miR-502-5p inhibitor后，TRAF2、p-IKBα、p-NF-κB p65表达升高，表明miR-502-5p基因干扰后，下游的TRAF2/NF-κB通路异常活化，IL-1β、TNF-α升高，IL-4、IL-10下降，ADAMTS5、MMP13mRNA相对表达明显上升，COL2A1 mRNA相对表达下降，表明miR-502-5p调控TRAF2/NF-κB轴影响软骨细胞炎症反应和软骨ECM代谢过程。将筛选的20%浓度的XFC干预IL-1β诱导的软骨细胞后，IL-1β、TNF-α表达下降，IL-4、IL-10表达升高，且ECM降解产物（ADAMTS5和MMP13mRNA）和TRAF2、NF-κB p65mRNA相对表达量明显下降，软骨修复产物（COL2A1 mRNA）和miR-502-5p mRNA表达上升，表明XFC含药血清抑制IL-1β诱导的软骨细胞中炎症反应和ECM降解，调节miR-502-5p/TRAF2/NF-κB轴。回复实验中，在XFC含药血清干预的基础上，再转染了miR-502-5p inhibitor后，IL-1β、TNF-α表达下降，IL-4、IL-10表达升高，ADAMTS5和MMP13和TRAF2、NF-κB p65表达明显下降，COL2A1表达升高，说明XFC含药血清能逆转miR-502-5p抑制剂作用，进而调节下游TRAF2/NF-κB靶点，调控IL-1β诱导的软骨细胞炎症和ECM代谢。

OA进展的主要因素是慢性炎症和关节软骨ECM代谢紊乱[37]。OA中的慢性炎症诱导软骨细胞的分解代谢活动，导致软骨细胞中基质降解酶（MMP1，MMP13）等表达上调[38]。ECM的变化与炎症下细胞功能之间的相互作用形成了一个正反馈回路，驱动OA的病理学进展。本研究关注OA软骨细胞炎症下ECM与细胞功能之间的相互作用，以及XFC调节这些因素的机制。研究表明，XFC对IL-1β诱导的软骨细胞的细胞外基质具有保护作用，可以抑制ECM降解产物ADAMTS5和MMP13的表达，上调合成产物COL2A1的表达，其机制可能是上调miR-502-5p，靶向TRAF2/NF-κB轴，抑制软骨细胞炎症反应，抑制细胞凋亡，恢复软骨细胞活力。

综上所述，本研究表明新风胶囊对IL-1β诱导的软骨细胞的细胞外基质具有保护作用，抑制软骨细胞炎症反应和ECM降解，其机制可能是通过调节miR-502-5p/TRAF2/NF-κB轴，为临床开发新风胶囊治疗骨关节炎的新策略提供实验支撑。

Funding Statement

国家自然科学基金（82274490）；安徽省高等学校科学研究项目（自然科学类）重点项目（2022AH050449）；安徽省第12批“115”创新团队（皖人才办）﹝2019﹞1号）；安徽省名中医刘健工作室建设项目（中医药发展秘﹝2018﹞11号）；安徽省中医药领军人才项目（中医药发展秘﹝2018﹞23号）资助

Supported by National Natural Science Foundation of China (82274490)

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