Abstract
目的
探讨结肠癌转移相关基因1(MACC1)对RAS选择性致死化合物3(RSL3)诱导的结直肠癌细胞铁死亡的影响及其分子机制。
方法
体外培养结直肠癌细胞SW620，HCT116，LOVO及RKO细胞，Western blot实验检测细胞中MACC1表达；以SW620细胞为实验材料，MTT法检测不同浓度(0、2.5、5、10、20、40 μmol/L)铁死亡诱导剂RSL3以及不同浓度(0、5、10、20 μmol/L)铁死亡抑制剂Fer-1对SW620细胞存活率的影响，分析单独使用10 μmol/L RLS3以及10 μmol/L RLS3和10 μmol/L Fer-1联合作用对SW620细胞存活率的影响，并检测干扰MACC1后不同浓度RSL3对SW620细胞存活率的影响；实时定量RT-PCR和Western blot法检测不同浓度RSL3(0、2.5、5、10 μmol/L)对MACC1在mRNA和蛋白水平的影响，并检测干扰MACC1后GPX4在mRNA和蛋白水平的表达；流式细胞仪及激光共聚焦实验检测干扰MACC1后，SW620细胞中脂质过氧化Lipid ROS水平的变化。
结果
4种结直肠癌细胞中SW620细胞MACC1表达量最高；铁死亡诱导剂RSL3抑制SW620细胞的存活率，细胞存活率随RSL3浓度升高而降低，呈剂量依赖性；不同浓度的铁死亡抑制剂Fer-1对SW620细胞的存活率没有影响；与对照Ctrl组细胞存活率相比，单独使用RSL3细胞存活率降低了50%(P < 0.01)，而联合使用RSL3与Fer-1处理SW620细胞，细胞的存活率得到恢复(P > 0.05)；不同浓度的RSL3作用于SW620细胞后，细胞中MACC1基因在mRNA和蛋白水平被显著抑制(P < 0.01)，具有一定的药物浓度依赖性。siRNA干扰MACC1基因表达后，增强RSL3对SW620细胞毒作用，并抑制细胞中GPX4的表达(P < 0.01)，增加细胞中Lipid ROS水平(P < 0.05)。
结论
MACC1通过调控GPX4影响RSL3诱导的结直肠癌细胞铁死亡。
Keywords: RAS选择性致死化合物3, 铁死亡, 结肠癌转移相关基因1, 谷胱甘肽过氧化物酶4
Abstract
Objective
To investigate the effect of MACC1 on RSL3-induced ferroptosis in colorectal cancer cells and explore its molecular mechanism.
Methods
MACC1 expression was detected in SW620, HCT116, LOVO and RKO cells using Western blotting. The effects of different concentrations of RSL3 (an inducer of ferroptosis) or Fer-1 (an inhibitor of ferroptosis) alone, or 10 μmol/L RLS3 combined with 10 μmol/L Fer-1, on viability of SW620 cells were examined using MTT assay. The survival of SW620 cells with mRNA interference of MACC1 was analyzed following treatment with RSL3, and RT-qPCR and Western blotting were performed to detect the changes in MACC1 expressions after RSL3 treatment at different concentrations and the changes in GPX4 expression after MACC1 knockdown. Flow cytometry and laser confocal microscopy were used to analyze the changes in ROS-induced lipid peroxidation in SW620 cells after MACC1 knockdown.
Results
SW620 cells had the highest MACC1 expression among the 4 colorectal cancer cell lines. Treatment with RSL3 significantly inhibited the viability of SW620 cells in a dose-dependent manner, while Fer-1 did not significantly affect the survival of SW620 cells. RSL3 alone reduced SW620 cell survival by 50% (P < 0.01), and the combined treatment with RSL3 and Fer-1 caused no significant changes in cell survival (P > 0.05). Treatment with RSL3 concentration-dependently suppressed MACC1 expressions at both the mRNA and protein levels in SW620 cells (P < 0.01). MACC1 knockdown obviously enhanced the cytotoxic effect of RSL3, inhibited the expression of GPX4, and increased ROS-induced lipid peroxidation in SW620 cells (P < 0.05).
Conclusion
MACC1 knockdown enhances RSL3-induced ferroptosis in cultured colorectal cancer cells by inhibiting the expression of GPX4.
Keywords: RAS-selective lethal 3, ferroptosis, metastasis-associated in colon cancer 1, glutathione peroxidase 4
结直肠癌是一种发病率高的恶性消化道肿瘤。虽然近些年治疗手段在不断的提升，但是由于治疗的抵抗，结直肠癌患者的5年生存率几乎没有得到明显的提升[1]。因此有必要了解结直肠癌恶性进展的分子机制，寻找更为有效的药物靶点，制定有效的治疗策略。铁死亡是一种铁依赖的，脂质过氧化的过度积累，以及氧化还原水平失衡引发的细胞死亡。细胞发生铁死亡的机制不同于典型的细胞死亡过程，如细胞凋亡，坏死以及细胞自噬[2, 3]。铁死亡的发生在各种肿瘤中受到抑制，诱导肿瘤细胞是一种新的肿瘤治疗策略[4]。谷胱甘肽过氧化物酶(GPX4)是铁死亡的关键调节因子，GPX4可以清除细胞中铁依赖性有毒脂质过氧化物的形成[5, 6]。因此，抑制GPX4会导致细胞中脂质过氧化，诱导铁死亡的发生，从而抑制肿瘤细胞的增殖。GPX4的抑制剂RAS选择性致死化合物3(RSL3)能够诱导结直肠癌细胞发生铁死亡，但是RSL3引起的铁死亡机制还不完全清楚，目前已知是一个多基因多信号参与的过程[7, 8]。同时铁死亡诱导剂RSL3能够抑制GPX4表达，而铁死亡抑制剂Fer-1(Ferrostatin-1)能够清除细胞中的氧自由基，抑制脂质过氧化，其与RSL3共同作用时能够恢复GPX4的表达[7-10]。但是，在对脑胶质瘤细胞的研究中发现，单独抑制GPX4的表达不能诱导铁死亡，而是将NF-κB通路激活和GPX4耗竭联合诱导铁死亡[11]。这些说明，RSL3诱导肿瘤细胞铁死亡的过程是一个多因素多信号通路参与的过程。
结肠癌转移相关基因1(MACC1)，在结直肠中高表达并促进结直肠癌的恶性增殖，转移以及化疗耐药[11, 13]。MACC1已被证实在多种实体瘤中作为肿瘤恶性转移和进展的生物标志物，通过靶向抑制MACC1的表达治疗肿瘤具有实际的临床应用价值[14, 15]。通过在结直肠癌细胞中过表达MACC1后进行的微阵列分析显示，在MACC1过表达后影响的下游基因中，一些基因如GPX2，SLPI以及IGFBP3等参与细胞氧化还原平衡的基因发生了明显的变化[16]。结合细胞发生铁死亡过程中，细胞氧化还原平衡被打破，因此推测MACC1可能参与肿瘤细胞的铁死亡过程。本课题的前期研究中发现，在结直肠癌细胞SW620中抑制MACC1的表达，明显的增强铁死亡诱导剂RSL3诱导细胞死亡的能力，然而MACC1参与结直肠癌细胞铁死亡尚未有研究报道。为此本研究以人源结直肠癌细胞株SW620作为主要研究对象，探讨MACC1对RSL3诱导的人结直肠癌细胞铁死亡中的作用，并分析潜在的分子机制。
1. 材料和方法
1.1. 细胞培养与试剂
1.1.1. 结直肠癌细胞培养
将人源SW620，HCT116，LOVO，RKO细胞于37 ℃，5%CO2饱和湿度条件下培养，用含有10%FBS的DMEM培养基进行常规培养和传代。用于药物处理和转染的细胞均为处于对数生长期的细胞，经传代分组后，贴壁12~18 h后加药或转染。
1.1.2. 主要试剂
DMEM培养基，胎牛血清(FBS)，Opti-MEM(Gibco)；RIPA细胞裂解液，转染试剂Lipofectamine 3000，BODIPYTM 581/591 C11，BCA蛋白浓度测定试剂盒(Invitrogen)；DMSO，噻唑蓝(Solarbio)；RSL3，Ferrostatin-1(MedChemExpress)；结肠癌转移关联基因1抗体(Metastasis Associated in Colon Cancer，MACC1，86290S)(Cell Signal Technology)；α-微管蛋白(α-tubulin, 10068-1-AP)，谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4, 67763-1-Ig)抗体购自武汉三鹰；山羊抗兔IgG H&L(IRDye® 800CW)预吸附二抗(ab216773)和山羊抗鼠IgG H&L(IRDye® 800CW)预吸附二抗(ab216772)购自Abcam；RNAiso Plus，TB Green® Fast qPCR Mix(Takara)；反转录试剂盒(ReverTra Ace® qPCR RT Master Mix with gDNA Remover)购自TOYOBO；其余实验种所使用的化学试剂均为进口分装或国产分析纯。
1.2. Western blot检测蛋白水平表达
RIPA裂解液裂解细胞，提取细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，100 ℃，10 min变性，进行SDS-PAGE(10%)凝胶电泳，200 mA湿转1 h，将蛋白转移到0.22 μm的PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，一抗4 ℃孵育过夜，荧光二抗室温避光孵育1 h，1×TBST洗3次，利用Odyssey仪器扫描检测进行扫膜并利用Image Studio软件进行条带分析。
1.3. MTT法检测细胞活力及实验分组
取处于对数生长期的的细胞，以5000/100 μL的细胞数量接种于96孔板中，培养箱中过夜培养约12 h。将孔中培养基移除，加入含有不同浓度药物的培养基，继续培养细胞，每组3复孔，药物作用24 h后，每孔加入5 mg/mL的MTT 10 μL，培养箱中避光孵育4 h。将孔中的液体全部移除后，每孔中加入100 μL的DMSO，使用酶标仪测定每孔的吸光值A490 nm。以50%的细胞存活率为依据设置RSL3的药物作用浓度，并选取该RSL3浓度的1/2，1/4作为实验的高，中低剂量组进行相关实验操作。
1.4. 实时定量RT-PCR检测基因mRNA水平表达
Trizol法提取细胞总RNA，利用ReverTra Ace® qPCR RT Master Mix with gDNA Remover(TOYOBO)反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA，以cDNA为模板，进行qRT-PCR检测，以α-tubulin为内参基因。反应条件如下：95 ℃预变性30 s，95 ℃ 5min，60 ℃ 30 s，40个循环，每组实验重复3次，得到Ct值，2-△ △ Ct法计算MACC1和GPX4的相对表达量。引物序列：MACC1基因上游引物为5'-TTCTTTTGATTCCTCCGGTGA-3'，下游引物为5'-ACTCTGATGGGCATGTGCTG-3'；GPX4基因上游引物为5'-ACAAGAACGGCTGCGT GGTGAA-3'，下游引物为5'-GCCACACACTTGTGG AGCTAGA-3'；α-tubulin基因上游引物为5'-CGGGCA GTGTTTGTAGACTTGG-3'，下游引物为5'-CTCCTTGCCAATGGTGTAGTGC-3'。
1.5. 细胞转染
MACC1干扰片段(si-MACC1，sense sequence 5'-GAGCAAGUAAUGUUUAUGUTT-3'，antisense sequence 5'-ACAUAAACAUUACUUGCUCTT-3')，空白干扰组(si-Ctrl，sense sequence 5'-UUCUCCGAAC GUGUCACGUTT-3'，antisense sequence 5'-ACGUGA CACGUUCGGAGAATT-3')购自广州锐博。将处于对数生长期的SW620细胞接种于6孔板中，待贴壁12 h，细胞汇合率约50%即可利用Lipofectamine 3000转染试剂分别将si-Ctrl及si-MACC1转染进细胞，转染时间为48 h。48 h将转染细胞分别用于MTT实验检测细胞活力，RT-PCR以及Western blot分别检测基因及蛋白表达，流式细胞仪检测。
1.6. 流式细胞仪及激光共聚焦显微镜检测细胞脂质过氧化Lipid ROS水平
si-Ctrl和si-MACC1转染SW620细胞48 h后，经过胰酶消化后收集细胞，每个样品中加入含有20 μmol/L BODIPYTM 581/591 C11的PBS重悬细胞。样品于37 ℃避光孵育1 h，经过PBS洗3次后，重悬细胞，流式细胞仪FL1通道检测脂质过氧化水平。
而将转染后的细胞接种于激光共聚焦平皿中，贴壁12 h后，加入含有20 μmol/L BODIPYTM 581/591 C11的PBS，于37 ℃避光孵育1 h，经过PBS洗3次，激光共聚焦显微镜拍照。
1.7. 数据分析
实验数据用Graphpad Prism 8软件进行分析处理，各计量数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，P < 0.05时认为差异具有统计学意义。
2. 结果
2.1. MACC1基因在结直肠癌细胞中表达比较
SW620细胞中MACC1基因表达量最高，相比较于SW620细胞，MACC1在HCT116细胞，LOVO细胞以及RKO细胞中的表达量分别降低了59%、99.4%、99.9%(图 1)。为了进行MACC1基因的功能研究，在后续实验中我们将以SW620细胞为主要的研究对象。
图 1.
Western blot比较分析MACC1基因在4种结直肠癌细胞中的表达
Analysis of MACC1 expression in four colorectal cancer cells lines. A: Western blot and (B) data analysis of MACC1 expression in four colorectal cancer cells lines; **P < 0.01 vs SW620.
2.2. RSL3诱导SW620细胞铁死亡
在结直肠癌SW620细胞中加入不同浓度的铁死亡诱导剂RSL3，MTT法对细胞活力进行检测，SW620细胞的存活率随着RSL3浓度的增加而降低，与对照组相比，RSL3为10 μmol/L时细胞存活率约为50%(图 2A)。在SW620细胞中加入不同浓度的铁死亡抑制剂Fer-1，利用MTT法检测细胞的存活率，结果显示，加入5、10、20 μmol/L对SW620细胞的存活率几乎没有任何影响(图 2B)。根据RSL3及Fer-1作用SW620细胞MTT值，将细胞分为3组：Ctrl组，10 μmol/L RSL3组，10 μmol/L RSL3和10 μmol/L Fer-1共处理组，检测细胞活力。MTT结果显示，加入铁死亡诱导剂RSL3后与对照DMSO组相比，细胞存活率降低了60%(P < 0.01)；而与对照组Ctrl相比，联合使用铁死亡抑制剂Fer-1及RSL3组对细胞存活率没有任何影响(P > 0.05)；联合使用铁死亡抑制剂Fer-1及RSL3组与单独加入RSL3组相比，细胞存活率明显升高(P < 0.01，图 2C)。
图 2.
MTT法检测细胞活力
MTT assay of viability of SW620 cells with different treatments. A: Cell viability after treatment with different concentrations of RSL3. B: Viability of SW620 cells treated with different concentrations of Fer-1. C: Viability of SW620 cells treated with RSL3 alone and in combination with Fer-1. *P < 0.05, **P < 0.01 vs 0 μmol/L RSL3 group or 0 μmol/L Fer-1 group; ##P < 0.01 vs Ctrl group; &&P < 0.01 vs RSL3 group.
2.3. RSL3对MACC1基因表达的影响
不同浓度的RSL3处理细胞后，与对照组相比，细胞中MACC1的表达在mRNA和蛋白水平的表达被抑制，且呈剂量依赖性(图 3A、B)。在mRNA水平上，RSL3浓度为2.5、5、10 μmol/L时，与对照组相比细胞中MACC1基因的表达量分别下降了32%、61%、75%。而在蛋白水平上RSL3浓度为2.5 μmol/L时，与对照组相比MACC1蛋白水平有所升高；当RSL3浓度为5 μmol/L和10 μmol/L时，与对照组相比MACC1蛋白分别降低了24%和63%。
图 3.
RSL3对MACC1基因表达的影响
MACC1 expression in SW620 cells treated with different concentrations of RSL3 or Fer-1. A: MACC1mRNA expression in SW620 cells treated with different concentrations of RSL3. B: Protein expression of MACC1 in SW620 cells treated with different concentrations of RSL3. **P < 0.01 vs 0 μmol/L RSL3 group.
2.4. 敲除MACC1对RSL3诱导的细胞铁死亡的影响
相同浓度的RSL3作用下，细胞中MACC1基因表达降低后，RSL3对细胞存活率的抑制作用明显增强(P < 0.05，图 4)。
图 4.
RSL3对敲除MACC1基因的SW620细胞存活率的影响
Effects of RSL3 on viability of SW620 cells with or without MACC1 knockdown. *P < 0.05 vs si-Ctrl group; **P < 0.01 vs si-Ctrl group.
2.5. MACC1对GPX4基因表达的影响
在SW620细胞中，与si-Ctrl组相比，干扰MACC1后，MACC1和GPX4在mRNA水平分别降低了60%和50%(P < 0.01)；MACC1和GPX4在蛋白水平上分别降低了37%和61%(图 5A、B)。
图 5.
敲除MACC1基因对SW620细胞中MACC1基因和GPX4基因mRNA(A)和蛋白(B)表达水平
MACC1 and GPX4 mRNA (A) and protein (B) expression levels in SW620 cells after MACC1 knockdown. **P < 0.01 vs si-Ctrl group.
2.6. MACC1对脂质过氧化Lipid ROS水平的影响
抑制MACC1基因表达后，SW620细胞中脂质过氧化水平明显上升。与si-Ctrl组相比，干扰MACC1组的荧光值上升了1.5倍(P < 0.05，图 6A、B)。同时利用激光共聚焦显微镜观察细胞中脂质过氧化水平的变化，SW620细胞中转染si-Ctrl和si-MACC1 48 h后，经过荧光探针BODIPYTM 581/591 C11染色30 min后，荧光探针与氧化脂质结合，观察细胞中脂质过氧化的水平，干扰SW620细胞中MACC1后，氧化态的绿色荧光强度明显高于si-Ctrl组(P < 0.05，图 6C)。
图 6.
敲除MACC1基因对SW620细胞中脂质过氧化水平的影响
MACC1 knockdown enhances lipid peroxidation in SW620 cells analyzed with flow cytometry (A, B, *P < 0.05 vs si-Ctrl group) and confocal microscopy (C, original magnification: ×4000).
3. 讨论
结直肠癌是全球第3大常见的恶性肿瘤，结直肠癌的发病率在我国呈现出逐年上升趋势，尽管早期筛查及治疗手段在不断提升，由于肿瘤的转移及复发导致结直肠癌患者的死亡率仍然在增加[17]。在对传统疗法具有抵抗作用的恶性肿瘤中，诱导细胞的铁死亡对肿瘤的治疗具有实际意义。铁死亡作为一种新发现的铁依赖的非凋亡形式的细胞死亡方式，目前对于铁死亡在表观遗传学，转录水平，翻译后水平等层面上的调控机制尚不十分清楚[18]。铁死亡过程中一个重要的事件即为自由基的产生与抗氧化防御系统激活之间的不平衡[19]。在细胞的抗氧化防御系统中GPX4发挥了重要作用，研究中也显示GPX4是铁死亡的关键蛋白，铁死亡发生时或抑制GPX4水平导致GPX4表达减少，促进肿瘤的死亡[4]。
MACC1已经被证实在多种肿瘤中异常表达，促进肿瘤的恶性进展及参与肿瘤的化疗耐药，其表达升高可以预测肿瘤对常规化疗药的治疗反应[20, 21]。抑制MACC1的表达能够在一定程度上减弱肿瘤的恶性转移过程。本项研究中发现铁死亡诱导剂RSL3能够抑制MACC1，同时抑制MACC1后能够增加结直肠癌细胞对RSL3诱导的细胞死亡，说明MACC1在RSL3诱导的铁死亡过程中发挥了重要作用。由于我们发现了抑制MACC1表达后，增强了RSL3诱导的SW620细胞的铁死亡。基于此我们分析了MACC1对GPX4的影响，结果显示MACC1能够调控GPX4的表达。目前关于调控GPX4影响肿瘤细胞铁死亡的过程主要集中在
药物抑制GPX4诱导肿瘤的死亡[22, 23]，肿瘤细胞中转录因子的表达变化影响GPX4的表达[24]，以及细胞中非编码RNA影响GPX4的表达[25]。在本研究中发现MACC1能够在RNA和蛋白水平上同时影响GPX4的表达，MACC1对GPX4表达影响的潜在机制还尚待深入研究。并且最新的研究中显示RSL3不是GPX4的直接抑制剂，说明RSL3诱导的细胞铁死亡是多通路的[26]。
目前尚未有报道称MACC1参与铁死亡过程，本研究已有的实验结果提示我们，MACC1可能是参与RSL3诱导的铁死亡中的关键因子。因此在本研究中进一步探讨MACC1其在RSL3诱导的肿瘤细胞铁死亡过程中发挥的作用，以及其参与肿瘤细胞铁死亡的相关分子机制。本研究实验结果表明，抑制MACC1表达能够降低RSL3诱导的铁死亡标志物GPX4基因的表达，通过增加细胞中脂质过氧化水平增强RSL3的毒性作用。综上所述，本研究结果证实了抑制MACC1基因对SW620细胞中RSL3诱导的铁死亡具有明显的促进作用，其机制可能是通过MACC1/GPX4通路实现的。本研究结果不仅丰富了参与铁死亡的关键因子，也为基于靶向MACC1抑制肿瘤恶性进展提供了新的依据。
Biography
孙硕，在读硕士研究生，E-mail: 1115245339@qq.com
Funding Statement
黑龙江省自然科学基金联合引导项目(LH2022H032)；黑龙江省省属高等学校基本科研业务费科研项目(135509222)；2022年齐齐哈尔大学研究生创新科研项目(160611122024)；2023年齐齐哈尔大学研究生创新科研项目(QUZLYS_CX2023010)；黑龙江省大学生创新创业训练计划资助项目(S202310232127)
Contributor Information
孙 硕 (Shuo SUN), Email: 1115245339@qq.com.
杨 清竹 (Qingzhu YANG), Email: yqzyg1123@163.com.
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