SET7对Ang II介导的心肌成纤维细胞增殖和胶原合成的影响及其机制

Abstract

Objective

Silence of SET domain containing lysine methyltransferase 7 (SET7) alleviates myocardial tissue injury caused by ischemia-reperfusion. But the effects of SET7 on angiotensin II (Ang II)-induced myocardial fibroblast proliferation and the collagen synthesis are not clear. The purpose of this study was to explore the effect of SET7 on the proliferation and collagen synthesis of myocardial fibroblasts and its mechanisms.

Methods

Myocardial fibroblasts were isolated and identified by immunofluorescence. Myocardial fibroblasts were randomly divided into 4 groups: a control group (cells were normally cultured), an Ang II group (cells were treated with 100 nmol/L Ang II for 24 h), a siCtrl group (cells were transfected with siRNA control and were then treated with 100 nmol/L Ang II for 24 h), and a siSET7 group (cells were transfected with siRNA SET7 and were then treated with 100 nmol/L Ang II for 24 h). Cell counting kit-8 (CCK-8) and 5-ethynyl-2’-deoxyuridine (EdU) assay were used to evaluate cell proliferation. Real-time PCR was used to detect the mRNA levels of SET7, collagen I, collagen III, and α-smooth muscle actin (α-SMA). Western blotting was used to detect the protein expression of SET7, collagen I, collagen III, α-SMA, sonic hedgehog (Shh), ptched1 (Ptch1), and glioma-associated oncogene homolog 1 (Gli1).

Results

Fluorescence microscopy showed positive vimentin staining, and myocardial fibroblasts were in good condition. As compared to the control group, the mRNA and protein levels of SET7 in the Ang II group were significantly upregulated; cell proliferation rate and EdU fluorescence intensity in the Ang II group were significantly increased; the mRNA and protein levels of collagen I, collagen III, and α-SMA were significantly upregulated (all P<0.05). As compared to the siCtrl group, the mRNA and protein levels of SET7 in the siSET7 group were significantly downregulated; cell proliferation rate and EdU fluorescence intensity in the siSET7 group were significantly decreased; the mRNA and protein levels of collagen I, collagen III, and α-SMA in the siSET7 group were significantly downregulated (all P<0.05).

Conclusion

Silence of SET7 gene inhibits Ang II-induced proliferation and collagen synthesis of myocardial fibroblasts. Shh signaling pathway may be involved in this process.

心肌纤维化是缺血性心肌病、瓣膜疾病、心律失常和心肌梗死等心脏病的病理学基础^[1]。心肌成纤维细胞过度激活会诱发collagen I和collagen III沉积，最终导致心功能下降。因此，寻找抑制细胞外基质过度沉积的靶分子对减缓心肌纤维化发展具有重要的意义。

含SET结构域赖氨酸甲基转移酶7(SET domain containing lysine methyltransferase 7，SET7)是一种组蛋白赖氨酸甲基化转移酶，含有SET结构域，能够甲基化组蛋白H3K4^[2]。近期研究^[3]发现沉默SET7基因可改善缺血再灌注介导的心肌组织损伤。但是，SET7在心肌纤维化中的作用尚未阐明。因此，本研究旨在探讨沉默SET7基因对血管紧张素II(angiotensin II，Ang II)介导的心肌成纤维细胞增殖及胶原合成的影响及其机制。

1. 材料与方法

1.1. 材料

出生1~3 d SPF级Wistar大鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司上海分公司；DMEM培养基和胎牛血清购自美国Hyclone公司；collagen I、collagen III和α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)引物购自上海生工生物工程股份有限公司；胰蛋白酶、TRIzol试剂和Lipofectamine^TM 2000试剂盒购自美国Invitrogen公司；Alexa Flour 594标记山羊抗兔IgG购自上海翊圣生物科技有限公司；Hoechst 33258细胞核染料、CCK-8、5-乙炔基-2’-脱氧尿苷(5-ethynyl-2’-deoxyuridine，EdU)细胞增殖检测试剂盒、BCA试剂盒和RIPA裂解液购自上海碧云天生物技术有限公司；siRNA SET7(siSET7，序列为：5'-GTAATCCGT-CATCGTCCAGGTGC-3')和siRNA control(siCtrl，序列为：5'-AAGAGTGTTGAGCGA-GCCAAG-3')购自上海吉玛制药技术有限公司；反转录试剂盒购自美国Promega公司；SYBR Green PCR Master Mix试剂盒购自美国ABI公司；HRP标记的二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司；ECL发光液购自美国Millipore公司；vimentin、collagen III、跨膜蛋白patched1(Ptch1)抗体和胶质瘤相关癌基因1(glioma-associated oncogene homolog 1，Gli1)抗体购自美国Abcam公司；collagen I、α-SMA、SET7和音猬因子(sonic hedgehog，Shh)抗体购自美国CST公司；β-actin抗体和GAPDH抗体购自美国Santa Cruz公司。

1.2. 方法

1.2.1. 心肌成纤维细胞的分离

参照文献[4]分离乳鼠心肌成纤维细胞。取新生小鼠心室，将其置于冷PBS中，用直剪剪碎心室组织，加入4 mL的0.25%胰蛋白酶，于37 ℃在摇床上反应15 min，当消化液变浑浊时收集上层消化液并加入完全培养基终止反应，离心以收集细胞，如此反复操作直至组织消化完全。细胞用含10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的完全培养基，置于37 ℃培养箱中培养1 h使心肌成纤维细胞贴壁，移除未贴壁的细胞。使用常规方法进行细胞传代，第3代心肌成纤维细胞用于后续实验。

1.2.2. 心肌成纤维细胞的鉴定

将处于对数生长期的心肌成纤维细胞接种于有盖玻片的24孔板中，待细胞达到60%~70%的融合时取出盖玻片，用PBS清洗3次，4%多聚甲醛固定15 min，PBS清洗3次；用0.1% Triton-100孵育15 min，PBS清洗3次；用5%山羊血清在室温下封闭1 h，加入vimentin一抗在4 ℃下孵育过夜，PBS清洗3次；加入Alexa Flour 594标记山羊抗兔IgG二抗于37 ℃避光反应2 h，用PBS清洗3次；加入Hoechst 33258染核15 min，用PBS清洗3次，抗荧光淬灭封片剂封片。在荧光显微镜下观察细胞。

1.2.3. 细胞分组及处理

将心肌成纤维细胞随机分为4组：1)对照组正常培养细胞；2)Ang II组给予100 nmol/L Ang II处理细胞24 h；3)siCtrl组细胞转染siCtrl后给予100 nmol/L的Ang II处理24 h；4)siSET7组细胞转染siSET7后给予100 nmol/L的Ang II处理24 h。

1.2.4. 细胞转染

将处于对数生长期的心肌成纤维细胞接种于6孔板中，待细胞达到60%~70%的融合时弃培养基，采用Lipofectamine^TM 2000试剂盒按照说明书中的步骤将siCtrl和siSET7转染至心肌成纤维细胞。培养6 h后将无血清培养基更换为完全培养基继续培养48 h。

1.2.5. CCK-8法检测细胞增殖

将细胞接种于96孔板中，培养24 h后更换无血清培养基继续培养24 h，按分组对细胞进行处理。按照试剂盒说明书，弃培养基，更换含有10 μL CCK-8溶液的无血清培养基110 μL，于37 ℃孵育2.5 h。在酶标仪上测定各孔吸光度值，测定波长为490 nm，参考波长为630 nm。

1.2.6. EdU法检测细胞增殖

将细胞接种于6孔板中，培养24 h后更换无血清培养基继续培养24 h，按分组对细胞进行处理。按照试剂盒说明书，用终浓度为50 μmol/L的EdU工作液孵育细胞5 h，去除培养基并加入4%多聚甲醛在室温下固定15 min，去除固定液，用洗涤液清洗细胞3次，去除洗涤液，用0.3% Triton X-100溶液在室温下孵育细胞15 min，用洗涤液清洗细胞2次。每孔加入500 μL反应液，在室温下避光孵育30 min。在多功能酶标仪上测定各孔荧光强度，激发波长为495 nm，发射波长为519 nm。

1.2.7. Real-time PCR检测mRNA表达水平

按照TRIzol试剂盒说明书，提取各组细胞总RNA。采用紫外分光光度法测定各组细胞RNA浓度。采用反转录试剂盒将5 μg RNA反转录为cDNA。Real-time PCR在96孔板中进行，每组设置3个复孔，反应体系为20 μL，反应条件：95 ℃，30 s后95 ℃，5 s，60 ℃，34 s，共35个循环。按照2^-ΔΔCt方法计算目的基因SET7、collagen I、collagen III和α-SMA mRNA的相对表达水平，β-actin为内对照。

1.2.8. 蛋白质印迹法检测蛋白质表达水平

将细胞接种于6孔板中，按分组处理细胞后弃培养基，用PBS清洗细胞3次，加入RIPA裂解液，刮取细胞后于冰上反应15 min，离心后收集上清液。采用BCA试剂盒测定各组细胞蛋白质浓度。每孔上样50 μg蛋白质行SDS-PAGE，转膜2 h，用5%脱脂牛奶于室温封闭1 h，加入一抗于4 ℃过夜孵育，加入二抗于室温孵育1 h。采用ECL发光试剂显影，Image J软件分析条带灰度值，以β-actin或GAPDH为内对照，计算各目的基因蛋白质的相对表达水平。

1.3. 统计学处理

采用SPSS 11.0统计学软件进行分析，数据以均数±标准差( $\overline{x}$ ±s)表示。两两比较采用t检验，多组比较采用单因素方差分析，组间比较用LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2. 结 果

2.1. 心肌成纤维细胞的鉴定

在荧光显微镜下可见：心肌成纤维细胞呈梭形、多角形，胞体较大，胞质内可见丝状结构，vimentin染色呈阳性(图1A)，细胞核形态呈球形或卵形，细胞状态良好(图1B)。

图1.

荧光显微镜下的心肌成纤维细胞(×200)

Figure 1 Primary myocardial fibroblasts under fluorescence microscope (×200)

A: Vimentin staining; B: Hoechst staining

2.2. Ang II对SET7表达的影响

与对照组比较，Ang II组SET7 mRNA和蛋白质表达水平均显著上调(均P<0.05，图2)。

图2.

Ang II对SET7 mRNA(A)和蛋白质(B)表达的影响

Figure 2 Effects of Ang II on SET7 mRNA (A) and protein (B) expression

2.3. 沉默SET7基因对细胞增殖的影响

与siCtrl组比较，siSET7组SET7 mRNA表达水平显著下调(P<0.05，图3A)。与对照组比较，Ang II组细胞增殖率显著增加；与siCtrl组比较，siSET7组组细胞增殖率显著下降(均P<0.05，图3B)。Ang II组EdU荧光强度较对照组显著增加，siSET7组EdU荧光强度较siCtrl组显著降低(均P<0.05，图3C)，表明沉默SET7基因抑制Ang II介导的心肌成纤维细胞的增殖。

图3.

沉默SET7基因对Ang II介导的细胞增殖的影响

Figure 3 Effects of SET7 gene silencing on Ang II-mediated cell proliferation

A: SET7 mRNA expression level; B: Cell proliferation rate determined by CCK-8 assay; C: Results of EdU assay

2.4. 沉默SET7基因对collagen I、collagen III和α-SMA表达的影响

与对照组比较，Ang II组collagen I、collagen III和α-SMA mRNA表达水平显著上调(均P<0.05)；与siCtrl组比较，siSET7组collagen I、collagen III和α-SMA mRNA表达水平显著下调(均P<0.05，图4)，表明沉默SET7基因抑制Ang II介导的心肌成纤维细胞collagen I、collagen III和α-SMA mRNA表达。

图4.

SET7基因沉默对Ang II介导的collagen I(A)、collagen III(B)、α-SMA(C) mRNA表达水平的影响

Figure 4 Effects of SET7 gene silencing on Ang II-mediated collagen I (A), collagen III (B), and α-SMA (C) mRNA expression levels

与对照组比较，Ang II组collagen I、collagen III和α-SMA蛋白质表达水平显著上调(均P<0.05)；与siCtrl组比较，siSET7组collagen I、collagen III和α-SMA蛋白质表达水平显著下调(均P<0.05，图5)，表明沉默SET7基因抑制Ang II介导的心肌成纤维细胞collagen I、collagen III和α-SMA蛋白质表达。

图5.

SET7基因沉默对Ang II介导的collagen I(A)、collagen III(B)、α-SMA(C)蛋白质表达水平的影响

Figure 5 Effects of SET7 gene silencing on Ang II-mediated collagen I (A), collagen III (B), and α-SMA (C) protein expression levels

2.5. 沉默SET7基因对Shh信号通路的影响

与对照组比较，Ang II组Shh、Ptch1和Gli1蛋白质表达水平显著上调(均P<0.05)；与siCtrl组比较，siSET7组Shh、Ptch1和Gli1蛋白质表达水平显著下调(均P<0.05，图6)，表明沉默SET7基因抑制Ang II介导的Shh信号通路激活。

图6.

SET7基因沉默对Shh信号通路的影响

Figure 6 Effects of SET7 gene silencing on Shh signaling pathway

A: Electrophoretogram showing protein expression of Shh, Ptch1, and Gli1; B: Comparison of Shh protein expression level between groups; C: Comparison of Ptch1 protein expression level between groups; D: Comparison of Gli1 protein expression level between groups

3. 讨 论

已有研究^[6]表明：SET7能对非组蛋白如转录因子、肿瘤抑制因子和膜相关受体进行甲基化修饰，参与细胞周期、DNA修复、基因转录、染色质调节、细胞增殖和分化过程。SET7通过调控转录因子E2F1促进肝癌细胞增殖、侵袭和迁移^[7]。下调SET7表达抑制缺血再灌注介导的心肌成纤维细胞凋亡以及ROS产生，提示SET7参与心脏疾病的发生和发展。

心肌纤维化是多种终末期心脏疾病的共同病理过程^[8]。当心肌组织受到压力负荷或者其他刺激，心肌成纤维母细胞被激活，随后通过多种途径诱发心肌成纤维细胞发育、成熟、增殖及迁移，同时分泌大量的collagen I和collagen III，形成瘢痕组织，导致心功能下降，最终引发心力衰竭^[9]。α-SMA是心肌成纤维细胞的结构蛋白质，也是其特有的标志性蛋白质。在心肌纤维化模型中，collagen I、collagen III和α-SMA的表达水平显著上调^[10-11]。在本研究中，Ang II显著上调SET7的表达水平，提示SET7可能参与心肌纤维化的过程。为了研究SET7对Ang II介导的心肌成纤维细胞增殖和胶原合成的影响，本研究进一步将siCtrl和siSET7转染至心肌成纤维细胞中，然后给予Ang II处理，结果发现：沉默SET7基因可抑制Ang II诱导的心肌成纤维细胞增殖以及collagen I、collagen III和α-SMA的表达。此结果与SET7在腹膜纤维化和肾纤维化模型中的作用一致^[12-13]。

研究^[5]发现：在腹膜纤维化小鼠模型中Shh信号通路被激活，伊曲康唑通过阻断Shh信号通路降低小鼠腹膜纤维化程度。阻断Shh信号通路可抑制滑膜成纤维细胞增殖^[15]。Chung等^[16]研究发现：环孢霉素A激活Shh信号通路的同时诱导牙龈成纤维细胞增殖，Shh信号通路抑制剂环巴胺可削弱环孢霉素A的促细胞增殖的作用。Shh信号通路在心脏疾病中也具有重要的作用。研究^[14]表明抑制Shh信号通路可减轻缺血再灌注介导的心肌纤维化，促进心脏功能恢复。本研究发现：Ang II激活Shh信号通路，沉默SET7基因后Shh信号通路的激活被抑制。本研究结果提示Shh信号通路参与SET7促进心肌成纤维细胞增殖及胶原合成的过程。

利益冲突声明

作者声称无任何利益冲突。

原文网址

http://xbyxb.csu.edu.cn/xbwk/fileup/PDF/202102135.pdf