Abstract
目的
2019冠状病毒病(coronavirus disease 2019，COVID-19)是一种由严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)引起的急性呼吸道传染病。SARS-CoV-2既可直接损伤心肌，也可通过激活免疫系统，引发细胞因子风暴，导致炎症细胞在心肌组织的浸润而损伤心肌。本研究基于测序数据分析SARS-CoV-2感染后人心肌细胞和巨噬细胞基因表达的变化，探讨SARS-CoV-2对心脏和免疫系统的潜在影响。
方法
检索公共数据集GSE151879，采用在线软件Network Analyst对数据进行预处理，并进行感染组和对照组心肌细胞、人胚胎干细胞来源的心肌细胞及巨噬细胞差异表达基因(differentially expressed genes，DEGs)[log2(fold change)>2，调整后P<0.05]的筛选。获取心肌细胞和巨噬细胞中表达模式一致的共同差异表达基因(consistent common differentially expressed genes，CCDEGs)，利用在线分析软件String对其进行生物学功能和信号通路的富集分析。建立蛋白质交互作用网络、转录因子-基因交互网络、miRNA-基因交互网络和环境化学物-基因交互网络，并利用Cytoscape3.72进行可视化。
结果
经标准化后的数据质量优秀，可确保分析结果可靠；心肌细胞感染SARS-CoV-2后，基因表达谱发生明显改变；成人心肌细胞中共484个DEGs，巨噬细胞中共667个DEGs，人胚胎干细胞来源的心肌细胞中共1 483个DEGs。机械传感介体同系物(STUM)、脱氢酶/还原酶9(DHRS9)、钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶IIβ(CAMK2B)、紧密连接蛋白1(CLDN1)、C-C基序趋化因子配体2(CCL2)、肿瘤坏死因子α诱导蛋白3相互作用蛋白3(TNIP3)、G蛋白偶联受体84(GPR84)、C-X-C基序趋化因子配体1(CXCL1)在3类细胞中表达模式完全一致。蛋白质交互作用网络提示CAMK2B蛋白在3类细胞抗病毒过程中可能发挥着关键性作用。环境化学物二氧化硅、苯并芘、镍和雌二醇影响3类细胞的抗病毒过程。
结论
CAMK2B、CLDN1、CCL2和DHRS9基因在心肌细胞抗SARS-CoV-2免疫反应中发挥重要作用；二氧化硅、苯并芘、镍和雌二醇可能通过增加心肌细胞毒性影响细胞的抗病毒过程，进而加重SARS-CoV-2对心脏的损害。
Keywords: 2019冠状病毒病, 严重急性呼吸综合征冠状病毒2, 心肌细胞, 巨噬细胞, 免疫反应, 环境化学物
Abstract
Objective
Coronavirus disease 2019 (COVID-19) is an acute respiratory infectious disease caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2). SARS-CoV-2 can damage the myocardium directly, or activate the immune system, trigger a cytokine storm, and cause inflammatory cells to infiltrate the myocardial tissue and damage the myocardium. This study is based on the sequencing data to analyze the changes in gene expression of cardiomyocytes and macrophages after SARS-CoV-2 infection, and explore the potential effects of SARS-CoV-2 on the heart and immune system.
Methods
The public data set GSE151879 was retrieved. The online software Network Analyst was used to preprocess the data, and the differentially expressed genes (DEGs) [log2(fold change)>2, adjusted P-value<0.05] screening between the infection group and the control group in cardiomyocytes, human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes, and macrophages were screened. Consistent common differentially expressed genes (CCDEGs) with the same expression pattern in cardiomyocytes and macrophages were obtained, and the online analysis software String was used to conduct enrichment analysis of their biological functions and signal pathways. Protein-protein interaction network, transcription factor-gene interaction network, miRNA-gene interaction network and environmental chemical-gene interaction network were established, and Cytoscape 3.72 was used to perform visualization.
Results
After data standardization, the data quality was excellent and it can ensure reliable results. Myocardial cell infection with SARS-CoV-2 and gene expression spectrum were changed significantly, including a total of 484 DEGs in adult cardiomyoblasts, a total of 667 DEGs in macrophages, and a total of 1 483 DEGs in human embryo source of cardiomyopathy. The Stum，mechanosensory transduction mediator homolog (STUM), dehydrogenase/reductase 9 (DHRS9), calcium/calmodulin dependent protein kinase II beta (CAMK2B), claudin 1(CLDN1), C-C motif chemokine ligand 2 (CCL2), TNFAIP3 interacting protein 3 (TNIP3), G protein-coupled receptor 84 (GPR84), and C-X-C motif chemokine ligand 1 (CXCL1) were identical in expression patterns in 3 types of cells. The protein-protein interaction suggested that CAMK2B proteins may play a key role in the antiviral process in 3 types of cells; and silicon dioxide (SiO2), benzodiazepine (BaP), nickel (Ni), and estradiol (E2) affect anti-SARS-CoV-2 processes of the 3 types of cells.
Conclusion
CAMK2B, CLDN1, CCL2, and DHRS9 genes play important roles in the immune response of cardiomyocytes against SARS-CoV-2. SiO2, BaP, Ni, E2 may affect the cell's antiviral process by increasing the toxicity of cardiomyocytes, thereby aggravating SARS-CoV-2 harm to the heart.
Keywords: coronavirus disease 2019, severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, cardiomyocytes, macrophages, immune response, environmental chemicals
2019冠状病毒病(coronavirus disease 2019，COVID-19)是一种由严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)引起的急性呼吸道传染病。COVID-19的主要临床表现有发热、咳嗽、头痛[1-2]。老年人和伴有高血压、心血管疾病的人更容易发生COVID-19[3-4]。截至2021年7月6日，全球累计确诊人数超183 934 913例[5]。虽然中国防控SARS-CoV-2战役取得了阶段性胜利，但疫情的国际形势依然严峻。
SARS-CoV-2感染主要导致肺炎和中东呼吸综合征等肺部并发症，也与急性心肌损伤、心肌炎、心律失常、心力衰竭和静脉血管栓塞等心血管并发症有关。患有肺炎和既往有心血管疾病病史的患者感染SARS-CoV-2后死亡风险增加[6]。SARS-CoV-2既可直接损伤心肌，也可通过激活免疫系统，引发细胞因子风暴，导致炎症细胞在心肌组织的浸润而损伤心肌[7]。感染SARS-CoV-2后免疫系统被广泛、有效地激活，可能在急性疾病康复后持续存在的心脏损伤中具有重要作用。但是，免疫系统和心肌细胞在感染SARS-CoV-2后的变化及其机制仍未阐明。
本研究检索了3类细胞感染SARS-CoV-2后的测序数据集，对数据集预处理后分析3类细胞中表达模式一致的共同差异表达基因(consistent common differentially expressed genes，CCDEGs)，对CCDEGs进行基因本体(geneontology，GO)功能注释、京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)信号通路分析，在基因组层面初步探讨心肌细胞和巨噬细胞感染SARS-CoV-2后的基因表达谱变化，以期为保护COVID-19患者心功能提供理论研究的基础。
1. 资料与方法
1.1. 数据来源
以“COVID-19”为关键词检索美国国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)的GEO数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)，最终采用的基因测序数据为GSE151879(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE151879)。该数据集采用Illumina NextSeq 500(Homo sapiens)和Illumina NovaSeq 6000(Homo sapiens)平台检测SARS-CoV-2感染组和对照组各9个样本[每组包含心肌细胞(cardiacmyocyts，CMs)、人胚胎干细胞(human embryonic stem cells，hESC)来源的心肌细胞(hESC-CMs)及巨噬细胞(macrophage cells，MPs)样本各3个]，每个样品检测57 916个基因。
1.2. 测序数据预处理
首先，剔除实验的无效数据；然后，对测序数据进行均值计算，以防止出现多个探针定位到同一基因的情况；最后，采用在线分析软件Network Analyst(https://www.networkanalyst.ca/)对数据进行归一化处理[log2Counts Per Million(log2CPM)]，以确保基因的同质性和后续分析的准确性。
1.3. 共同差异表达基因分析
为获取CMs、hESC-CMs和MPs感染SARS-CoV-2后的CCDEGs，对数据进行归一化处理后，首先采用R语言依次筛选3类细胞的差异表达基因(differential expression genes，DEGs)，标准为 log2(fold change)>2，调整后P<0.05(感染组vs对照组)；然后采用韦恩图获得其交集，即共同差异表达基因(common differentially expressed genes，CDEGs)；最后选出3类细胞CDEGs表达模式一致的基因，即CCDEGs。
1.4. 蛋白质-蛋白质交互作用网络的构建
将CCDEGs导入Network Analyst和String数据库，建立Generic蛋白质-蛋白质交互作用(protein-protein interaction，PPI)网络；以可信度为0.700，获得最核心的PPI网络；采用Cytoscape3.72进行可视化，建立PPI网络图。
1.5. 转录因子-CCDEGs网络的建立
将CCDEGs导入Network Analyst，选择转录因子(transcription factor，TF)-基因交互网络，调用ENCODE芯片序列数据。利用Cytoscape调节结果，获得最核心的调节关系。
1.6. MiRNA-CCDEGs调控作用分析
利用Network Analyst，选择Gene-miRNA网络对CCDEGs进行分析。在miRTarBase v8.0中收集实验数据，并将关系作最小化处理。利用Cytoscape对数据进行处理和可视化，找出CCDEGs上游离的miRNA。
1.7. 环境化学物-CCDEGs调控作用分析
为分析环境因素对基因的影响，在Network Analyst中选择Protein-Chemical，采用Comparative Toxicogenomics Database(CTD)中的数据，将关联紧密的环境化学物与CCDEGs之间的联系进行最小化处理。同样利用Cytoscape对数据进一步进行核心化和可视化。
1.8. 生物学功能及信号通路富集分析
将CCDEGs导入在线分析软件String(https://string-db.org/)，调节可信度为0.700，最大接触器显示1级和2级附加节点参数均不超过10。对CCDEGs进行基因本体(Gene Ontology，GO)功能注释、京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路富集分析。
2. 结 果
2.1. 测序数据质量
各基因分布的集中程度基本一致，各样本基因表达数据基本为一条直线，提示数据质量优秀，用于后续研究的可靠性高(图1)。
图1.
经数据预处理后各样本基因表达数据的箱式图和分布密度曲线
Figure 1 Box plots (A, C, E) and distribution density curve (B, D, F) of gene expression data in each sample after data preprocessing
Infection group: CMs, hESC-CMs, MPs; Control group: CMm, hESC-CMm, MPm.
2.2. CDGEs分析
基因表达火山图(图2A)表明：感染SARS-CoV-2后，3类细胞的基因表达谱均发生了明显的改变；CMs中共有484个DEGs，其中323个(66.74%)上调，161个(33.26%)下调；hESC-CMs中共有1 483个DEGs，其中1 117个(75.32%)上调，366个(24.68%)下调；MPs中共有667个DEGs，其中261个(39.13%)上调，406个(60.87%)下调；3类细胞DEGs变化的概率密度曲线见图2B；最终在3类细胞的DEGs中筛选出16个CDGEs(图2C)。
图2.
3类细胞的基因表达火山图(A)、概率密度曲线(B)及韦恩图(C)
Figure 2 Volcanic map (A), probability density curve (B), and Wayne map (C) of gene expression in 3 types of cells
2.3. CCDGEs分析
CCDGEs为3类细胞中表达模式一致的8个基因，分别是：机械传感介体同系物(Stum，mechanosensory transduction mediator homolog，STUM)、脱氢酶/还原酶9(dehydrogenase/reductase 9，DHRS9)、钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶IIβ(calcium/calmodulin dependent protein kinase II beta，CAMK2B)、紧密连接蛋白1(claudin 1，CLDN1)、C-C基序趋化因子配体2(C-C motif chemokine ligand 2，CCL2)、肿瘤坏死因子α诱导蛋白3相互作用蛋白3(TNFAIP3 interacting protein 3，TNIP3)、G蛋白偶联受体84(G protein-coupled receptor 84，GPR84)、C-X-C基序趋化因子配体1(C-X-C motif chemokine ligand 1，CXCL1)(图3)。
图3.
16个CDGEs在3类细胞中的表达模式
Figure 3 Expression pattern of 16 CDGEs in 3 types of cells
2.4. 中心蛋白质
由CCDEGs的PPI网络(图4)可见：CAMK2B蛋白质与其他蛋白质联系最为紧密，为中心蛋白质，提示该蛋白质可能在3类细胞抗病毒过程中发挥着关键性作用。
图4.
CCDEGs的PPI网络图(蓝色代表下调基因，粉色代表与CCDEGs有交互作用的下游基因)
Figure 4 PPI network of CCDEGs (blue represents down-regulated genes, and pink represents downstream genes that interact with CCDEGs)
2.5. TF-CCDEGs调控作用
与TF调控作用相关的CCDEGs有3个：CLDN1、CCL2及DHRS9。其中上调基因为CLDN1和CCL2。CLDN1与14个TF相关联，CCL2与3个TF相关联。下调基因DHRS9与8个TF关系紧密。在有关联的TF中，TEAD4、FOXA2及CEBPD与CLDN1和DHRS9均有相互作用；CEBPG与DHRS9和CCL2关系紧密(图5)。
图5.
TF-CCDEGs交互网络图(红色代表上调CCDEGs，蓝色代表下调CCDEGs，粉色代表与CCDEGs相关的TF)
Figure 5 TF-CCDEGs network diagram (red represents up-regulated genes, blue represents down-regulated genes, and pink represents TF related to CCDEGs)
2.6. MiRNA-CCDEGs调控作用
Hsa-mir-1-3p和hsa-mir-124-3p对CCL2和CXCL1发挥调节作用，hsa-mir-155-5p对CLDN1和CCL2发挥调节作用，hsa-mir-338-5p对CLDN1和TNIP3发挥调节作用(图6)。
图6.
MiRNA-CCDEGs交互网络图(红色代表上调基因，粉色代表与CCDGEs有交互作用的miRNA)
Figure 6 Network diagram of interaction between miRNA and genes (red represents up-regulated genes, and pink represents miRNA that interacts with CCDGEs)
2.7. 环境化学物-基因相互作用分析
CCL2、CLDN1、CXCL1、DHRS9、STUM、TNIP3、GPR84及CAMK2B基因分别受7、6、5、4、3、2、2及2种环境化学物的影响。黄曲霉毒素B1(AFB1)、二氧化硅(SiO2)、苯并芘(BaP)、镍(Ni)及雌二醇(E2)在网络中发挥的作用较大(图7)。
图7.
环境化学物-CCDEGs交互网络图(红色代表上调基因，蓝色代表下调基因，粉色代表与CCDGEs有交互作用的环境化学物)
Figure 7 Network diagram of invironmental chemical-gene interaction (red represents up-regulated genes, blue represents down-regulated genes, and pink represents environmental chemicals that interact with CCDGEs)
2.8. CCDEGs的GO分析和KEGG信号通路分析
GO分析结果显示：CCDEGs涉及的细胞成分(cellular component，CC)包括胞外间隙、质膜外侧和肌浆网膜等，分子功能(molecular function，MF)包括细胞因子受体结合、细胞因子活性和趋化因子受体结合等，生物学过程(biological process，BP)包括细胞因子介导的信号转导途径、细胞对细胞因子刺激的反应和免疫反应等。结果主要涉及各膜质成分，调节因子和应激反应。KEGG信号通路主要集中在细胞因子-细胞因子受体相互作用、IL-17信号通路及趋化因子信号通路等(图8)。
图8.
GO分析和KEGG信号通路图
Figure 8 GO analysis and KEGG signal pathway diagram
Count: Number of genes; FDR: False discovery rate; CC: Cellular component; MF: Molecular function; BP: Biological process; KEGG: Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes.
3. 讨 论
本研究筛选了CMs、hESC-CMs及MPs感染SARS-CoV-2后的CCDEGs，由CCDEGs的PPI网络可见，CAMK2B为中心蛋白质，与之关联的12个蛋白包括CAMK2A、CAMK2D和CAMK2G等，它们都属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族和Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶(Ca2+/calmodulin dependent protein kinases，CaMKs)亚家族，在细胞中有抗氧化损伤的作用[9]，由此推测CMs、hESC-CMs及MPs在感染SARS-CoV-2后激活了细胞的抗氧化损伤。TF调控网络表明CLDN1、CCL2及DHRS9基因在病毒过程中处于重要位置。CLDN1对角质层的水屏障功能非常重要，与大分子形成紧密连接的角质层蛋白[10]。CCL2介导的趋化因子信号可以将再生神经元与再生巨噬细胞激活联系起来[11]。DHRS9为调节性巨噬细胞特异性标志物，在限制免疫反应中起关键作用[12]。MiRNA-CCDEGs调控作用结果表明hsa-mir-1-3p和hsa-mir-124-3p对基因CCL2和CXCL1起调节作用。CXCL1的表达可以促进IL-6的表达，激活炎症反应[13]。其通过调节T细胞的功能和中性粒细胞的相关杀菌功能在募集中性粒细胞的过程中发挥作用[14]。在有关联的TF中，TEAD4、FOXA2及CEBPD与CLDN1和DHRS9均有相互作用；CEBPG与DHRS9和CCL2关系紧密。FOXA2缺陷的小鼠hESC-CMs分化潜力降低[15]。CEBPD是参与细胞分化、生长、代谢、炎症和死亡等生理过程的转录因子[16-17]。上述结果表明：3类细胞感染SARS-CoV-2后，CAMK2B和DHRS9基因表达下调，CLDN1、CCL2和CXCL1基因表达上调，并通过调节其他蛋白质、TF和miRNA等促进细胞生长、分化；增强了抗氧化功能、炎症反应、细胞免疫等。
环境化学物-基因交互作用分析发现：AFB1、SiO2、BaP、Ni及E2对SARS-CoV-2感染后心肌的损伤有影响。AFB1主要通过增加氧化损伤和脂质氧化来影响心肌细胞[14]。SiO2使心肌细胞受到毒性损伤，发生自噬和凋亡[18]。Bap可诱导DNA损伤和氧化应激反应，损伤人胚胎干细胞分化的心肌细胞[19]，且消化、神经、呼吸、免疫系统也会受其毒性攻击发生损伤[20]。Ni有细胞毒性作用，使机体发生应激反应和免疫反应[21-22]。SiO2、BaP、Ni、E2等环境化学物可能通过增加心肌细胞毒性而影响其抗病毒过程，进而加重SARS-CoV-2对心脏的损害。
综上，本研究结果表明：心肌细胞和巨噬细胞感染SARS-CoV-2后基因表达谱发生明显改变；CCDGEs主要涉及机体应激反应及免疫反应等，其中CAMK2B、CLDN1、CCL2及DHRS9基因在抗病毒的免疫反应中发挥着重要的作用。对上述基因进行更深入的研究，可能在基因层面治疗COVID-19实现突破。同时，在救治COVID-19患者的过程中，应保持其周围环境的洁净，减轻环境化学物对心脏的毒性负担，为抗病毒治疗提供环境保障。
基金资助
大学生创新训练计划项目(S202010716009)；陕西中医药大学学科创新团队(132041933)。
This work was supported by the Innovation Training Program for College Students (S202010716009) and the Subject Innovation Team of Shaanxi University of Chinese Medicine (132041933), China.
利益冲突声明
作者声称无任何利益冲突。
原文网址
http://xbyxb.csu.edu.cn/xbwk/fileup/PDF/2021111203.pdf
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