腺相关病毒介导的基因治疗在儿童神经遗传罕见病中应用的现状与展望

Abstract

Rare pediatric neurogenetic diseases always have early onset, no specific therapy, high mortality, and pose a severe risk to the health and survival of children. Adeno-associated virus (AAV)-mediated gene therapy, a type of disease-modifying therapy, provides a new option for the treatment of rare pediatric neurogenetic diseases and represents a significant advancement in the field. Currently, the US Food and Drug Administration (FDA) and the European Medicines Association (EMA) have approved AAV-mediated gene therapy medications for treating spinal muscular atrophy, aromatic L-amino acid decarboxylase deficiency, and Duchenne muscular dystrophy. Numerous preclinical and clinical trial research findings from recent years indicate that AAV-mediated gene therapy has a promising future in treating genetic disorders. The quick approval process for rare diseases medications may bring hope for the treatment of children with rare neurogenetic diseases. AAV-mediated gene therapy is an emerging technology with certain risks and challenges. It is necessary to establish a standardized regulatory system and a sound long-term follow-up system to evaluate the efficacy and safety of gene therapy.

随着遗传、免疫、代谢、功能影像等检测技术和生物学、基因工程技术的快速发展，癫痫、癫痫脑病、脱髓鞘脑病、遗传性脑白质病、神经肌肉病等各类儿童神经系统疾病的诊疗模式有了巨大的改变^[1-2]。作为医学研究新的发展方向，基因治疗为以儿童神经系统疾病为代表的罕见病治疗带来了新的希望。基因治疗的载体包括病毒载体和非病毒载体2种。由于非病毒载体转染效率较低，目前70%以上基因治疗的临床研究均采用病毒载体，其中腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)约占28%，慢病毒占22%，腺病毒占50%^[3-4]。AAV具有转染效率高、低免疫原性、不整合到宿主基因组、组织趋向性、长时稳定表达等优点，在神经系统遗传罕见病基因治疗中有很好的应用前景^[5]。随着越来越多临床试验的成功及多款基因治疗产品获批上市，AAV介导的基因治疗进入高速发展阶段，并有望从根本上改变目前的治疗模式，甚至治愈罕见病和疑难病，从而满足临床迫切的需求。

1. AAV载体概述

AAV属于微小病毒科，呈二十面体结构。病毒基因组为线状单链DNA，长度约4.7 kb，其中包含2个开放阅读框，分别编码调节蛋白Rep(Rep78、Rep68、Rep52和Rep40)及结构蛋白Cap(VP1、VP2、和VP3)。基因组两端为反向重复序列(inverted terminal repeat，ITR)，对病毒的复制和包装起决定性作用，也是重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus，rAAV)包装复制所必需的自身结构^[6-7]。目前已分离出13种天然AAV血清型(AAV1~AAV13)和上百种AAV变体，不同的AAV血清型具有不同的组织趋向性^[8]。AAV血清型、启动子、注射方式及注射量都是影响AAV感染效率的重要因素。已经有多种AAV血清型及AAV变体应用于中枢神经系统疾病的临床试验，包括AAV1、AAV2、AAV5、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh10、AAV-PHP.eB等^[9]。血脑屏障一方面对中枢神经系统具有重要的保护作用，另一方面也会阻隔治疗药物的传递和吸收，给神经系统疾病的治疗带来难题^[10-11]。既往中枢神经系统疾病基因治疗的研究多采用鞘内注射、脑实质注射或脑室注射。随着研究人员进一步改造AAV衣壳，发现AAV9、AAV-PHP.B、AAV-PHP.eB、AAV-PHP.S、AAV.CAP-B10等可以通过静脉注射高效穿过血脑屏障，实现全脑表达，且AAV.CAP-B10在全脑高表达的同时不在肝富集，避免了肝毒性等不良反应^[12-13]。安全有效的载体传递系统是基因治疗成功的关键，如何提高AAV载体的安全性、特异性、转染效率和生产能力等是目前研发的重点。

2. AAV在儿童神经遗传罕见病中的应用

AAV介导基因治疗的临床试验主要集中在神经肌肉病、溶酶体病、神经退行性病、眼部疾病和血液系统疾病。目前，全球在美国临床试验注册中心(https://www.clinicaltrials.gov/)注册的AAV介导的基因治疗临床试验达300余项，其中儿童神经遗传罕见病相关的临床试验研究约60项(表1)；中国在美国临床试验注册中心(https://www.clinicaltrials.gov/)和中国临床试验注册中心(https://www.chictr.org.cn/)注册的关于AAV介导儿童神经遗传罕见病基因治疗的临床试验共计9项(表2)，主要针对I型脊髓性肌萎缩症(spinal muscular atrophy，SMA)、婴儿型庞贝病以及芳香族L-氨基酸脱羧酶缺乏症(aromatic L-amino acid decarboxylase deficiency，AADCD)；全球有7种获批上市的以AAV为载体的基因治疗药物，分别为Zolgensma(治疗SMA)、Upstaza(治疗AADCD)、Glybera(治疗高脂蛋白血症I型)、Luxturna(治疗RPE65基因突变相关视网膜变性疾病)、Roctavian(治疗血友病A)、Hemgenl(治疗血友病B)及Elevidys[治疗杜氏肌营养不良症(Duchenne muscular dystrophy，DMD)]，其中Zolgensma、Upstaza和Elevidys是目前美国食品药品管理局(Food and Drug Administration，FDA)/欧洲药品管理局(European Medicines Association，EMA)批准的用于儿童神经遗传罕见病的AAV介导的基因治疗药物(表3)。这些药物的获批上市也进一步推动了AAV介导的基因治疗在神经遗传罕见病中的研究应用。

表1.

AAV介导的基因治疗在儿童神经遗传罕见病中开展的临床试验

Table 1 Clinical trials of AAV-mediated gene therapy in rare pediatric neurogenetic diseases

疾病名称	状态	载体	目标基因	给药途径	适用年龄	性别	分期	研发单位	编号
Dravet综合征	招募	AAV9	SCN1A	脑室注射	6~36个月	男/女	I/II期	Encoded Therapeutics	NCT05419492
DMD	招募	AAV9	DMD	静脉注射	6个月~13岁	男	I/II期	Megan Waldrop	NCT04240314
DMD	招募	AAV9	DMD	静脉注射	≥4岁	男	I期	Pfizer	NCT03362502
DMD	完成	AAV2.5	DMD	肌肉注射	5~15岁	男	I期	Nationwide Children’s Hospital	NCT00428935
DMD	招募	AAV8	DMD	静脉注射	4~11岁	男	I/II期	REGENXBIO Inc.	NCT05693142
DMD	完成	AAV1	DMD	肌肉注射	≥7岁	男	I/II期	Jerry R. Mendell	NCT02354781
DMD	招募	AAV9	DMD	静脉注射	4~17岁	男	I/II期	Solid Biosciences Inc.	NCT03368742
DMD	招募	AAV9	DMD	静脉注射	4~7岁	男	III期	Pfizer	NCT04281485
DMD	完成	AAVrh74	DMD	肌肉注射	≥7岁	男	I期	Jerry R. Mendell	NCT02376816
DMD	招募	AAVrh74	DMD	静脉注射	4~7岁	男	III期	Sarepta Therapeutics, Inc.	NCT05096221
SMA	完成	AAV9	SMN1/SMN2	鞘内注射	6~60个月	男/女	I期	Novartis Gene Therapies	NCT03381729
SMA	完成	AAV9	SMN1/SMN2	静脉注射	≤6个月	男/女	I期	Novartis Gene Therapies	NCT02122952
SMA	完成	AAV9	SMN1/SMN2	静脉注射	≤6个月	男/女	III期	Novartis Gene Therapies	NCT03306277
SMA	完成	AAV9	SMN1/SMN2	静脉注射	≤6个月	男/女	III期	Novartis Gene Therapies	NCT03461289
SMA	完成	AAV9	SMN1/SMN2	静脉注射	≤42 d	男/女	III期	Novartis Gene Therapies	NCT03505099
SMA	完成	AAV9	SMN1/SMN2	静脉注射	≤6个月	男/女	III期	Novartis Gene Therapies	NCT03837184
SMA	招募	AAV9	SMN1/SMN2	静脉注射	≤17岁	男/女	III期	Novartis Pharmaceuticals	NCT04851873
SMA	招募	AAV9	SMN1/SMN2	鞘内注射	2~17岁	男/女	III期	Novartis Pharmaceuticals	NCT05089656
SMA	招募	AAV9	SMN1/SMN2	静脉注射	≤24个月	男/女	IV期	Novartis Pharmaceuticals	NCT05073133
SMA	招募	AAV9	SMN1/SMN2	鞘内注射	0~6个月	男/女	I/II期	GeneCradle Inc.	NCT05824169
SMA	招募	AAV9	SMN1/SMN2	静脉注射	1~180 d	男/女	I/II期	Hangzhou Jiayin Biotech Ltd.	NCT05614531
SMA	招募	AAV9	SMN1/SMN2	静脉注射	<240 d	男/女	I/II期	Biocad	NCT05747261
LGMD-2C	完成	AAV1	γ-sarcoglycan	静脉注射	≥15岁	男/女	I期	Genethon	NCT01344798
LGMD-2D	完成	AAV1	α-sarcoglycan	静脉注射	≥5岁	男/女	I期	Nationwide Children’s Hospital	NCT00494195
LGMD-2D	完成	AAVrh74	α-sarcoglycan	静脉注射	≥7岁	男/女	I/II期	Sarepta Therapeutics, Inc.	NCT01976091
晚发型庞贝病	完成	AAV1	GAA	肌肉注射	2~18岁	男/女	I/II期	University of Florida	NCT00976352
婴儿型庞贝病	招募	AAV9	GAA	静脉注射	≤6个月	男/女	I/II期	北京锦篮基因科技有限公司	NCT05793307
MPS I	招募	AAV9	IDUA	脑室注射	≤4个月	男/女	I/II期	REGENXBIO Inc.	NCT03580083
MPS I	终止	AAV2/6	IDUA	静脉注射	≤5岁	男/女	I/II期	Sangamo Therapeutics	NCT02702115
MPS II	招募	AAV9	IDS	脑室注射	5~17岁	男	I/II期	REGENXBIO Inc.	NCT04571970
MPS II	招募	AAV9	IDS	脑室注射	4个月~5岁	男	I/II/ III期	REGENXBIO Inc.	NCT03566043
MPS IIIA	完成	AAVrh10	SGSH	脑室注射	18个月~6岁	男/女	I/II期	LYSOGENE	NCT01474343

表2.

中国自主研发的用于儿童神经遗传罕见病的基因治疗药物注册临床试验

Table 2 Registered clinical trials of AAV-mediated gene therapy drugs independently developed in China for rare pediatric neurogenetic diseases

疾病名称	状态	载体	目标基因	给药途径	适用年龄	性别	分期	研发单位	编号
MPS IIIA	招募	AAVrh10	SGSH	脑室注射	≤6个月	男/女	II/III期	LYSOGENE	NCT03612869
MPS IIIA	招募	AAV9	SGSH	静脉注射	所有年龄	男/女	I/II/ III期	Ultragenyx Pharmaceutical Inc.	NCT02716246
MPS IIIA	招募	AAV9	SGSH	静脉注射	所有年龄	男/女	III期	Ultragenyx Pharmaceutical Inc.	NCT04360265
MPS IIIB	完成	AAV2/5	NAGLU	脑实质注射	18~60个月	男/女	I/II期	UniQure Biopharma B.V.	NCT03300453
MPS VI	招募	AAV2/8	ARSB	静脉注射	4~65岁	男/女	I/II期	Fondazione Telethon	NCT03173521
LINCL	完成	AAVrh.10	CLN2	脑实质注射	2~18岁	男/女	I期	Weill Medical College of Cornell University	NCT01161576
LINCL	完成	AAV2	CLN2	脑实质注射	3~18岁	男/女	I期	Weill Medical College of Cornell University	NCT00151216
LINCL	完成	AAVrh.10	CLN2	脑实质注射	3~18岁	男/女	I/II期	Weill Medical College of Cornell University	NCT01414985
NCL	招募	AAV9	CLN2	视网膜下 注射	12~144个月	男/女	I/II期	REGENXBIO Inc.	NCT05791864
NCL	招募	AAV9	CLN3	鞘内注射	3~10岁	男/女	I/II期	Amicus Therapeutics	NCT03770572
NCL	招募	AAV9	CLN5	脑室注射	3~9岁	男/女	I/II期	Neurogene Inc.	NCT05228145
LINCL	完成	AAV9	CLN6	鞘内注射	≥1岁	男/女	I/II期	Amicus Therapeutics	NCT02725580
NCL	招募	AAV9	CLN7	鞘内注射	1~18岁	男/女	I期	Benjamin Greenberg	NCT04737460
MLD	招募	AAVrh.10	ARSA	脑实质注射	6个月~5岁	男/女	I/II期	Institut National de la Santé Et de la Recherche Médicale, France	NCT01801709
Krabbe病	招募	AAVhu68	GALC	枕大池内 注射	1~9个月	男/女	I/II期	Passage Bio, Inc.	NCT04771416
Canavan病	招募	AAV9	ASPA	静脉注射	≤30个月	男/女	I/II期	Aspa Therapeutics	NCT04998396
Canavan病	招募	rAAV-Olig001	ASPA	脑室注射	3~60个月	男/女	I/II期	Myrtelle Inc.	NCT04833907
Danon病	招募	AAV9	LAMP2B	静脉注射	≥8岁	男	I期	Rocket Pharmaceuticals Inc.	NCT03882437
GM1神经节苷脂沉积病	招募	AAV9	GLB1	静脉注射	6个月~ 12岁	男/女	I/II期	National Human Genome Research Institute (NHGRI)	NCT03952637
GM1神经节苷脂沉积病	招募	AAVrh.10	GLB1	静脉注射	≤3岁	男/女	I/II期	LYSOGENE	NCT04273269
GM1神经节苷脂沉积病	招募	AAVhu68	GLB1	静脉注射	4~36个月	男/女	I/II期	Passage Bio, Inc.	NCT04713475
戈谢病2型	招募	AAV9	GBA1	脑室注射	0~24个月	男/女	I/II期	Prevail Therapeutics	NCT04411654
AADCD	招募	AAV2	AADC	脑实质注射	≥4岁	男/女	I期	Krzysztof Bankiewicz	NCT02852213
AADCD	完成	AAV2	AADC	脑实质注射	≤6岁	男/女	II期	PTC Therapeutics	NCT02926066
AADCD	完成	AAV2	AADC	脑实质注射	≥24个月	男/女	I/II期	PTC Therapeutics	NCT01395641
AADCD	招募	AAV9	AADC	脑实质注射	24个月~ 7岁	男/女	I期	上海交通大学医学院 附属上海儿童医学中心	NCT05765981
AADCD	招募	AAV2	AADC	脑实质注射	1~17岁	男/女	II期	PTC Therapeutics	NCT04903288

AAV：腺相关病毒；SCN1A：电压门控钠离子通道α1亚基；DMD：杜氏肌营养不良症；SMA：脊髓性肌萎缩症；SMN：运动神经元生存蛋白；LGMD：肢带型肌营养不良症；GAA：酸性α-葡萄糖苷酶；MPS：黏多糖贮积症；IDUA： α-L-艾杜糖苷酶；IDS：艾杜糖-2-硫酸酯酶；SGSH：N-磺氨基葡糖磺基氢化酶；NAGLU：N-乙酰-α-D-氨基葡萄糖苷酶；ARSB：芳基硫酸酯酶B抗体；LINCL：婴儿神经元蜡样脂褐质沉积症；NCL：神经元蜡样脂褐质沉积症；MLD：异染性脑白质营养不良；ARSA：芳基硫酸酯酶A抗体；GALC：半乳糖神经酰胺酶；ASPA：天冬氨酸酰化酶；LAMP2B：溶酶体相关膜蛋白2异构体B；GLB1：β-半乳糖苷酶-1；GBA1：β-葡萄糖脑苷酶-1；AADCD：芳香族L-氨基酸脱羧酶缺乏症；AADC：芳香族L-氨基酸脱羧酶；NCT：美国国家临床试验。

表3.

目前FDA/EMA批准的用于儿童神经遗传罕见病的AAV介导的基因治疗药物

Table 3 AAV-mediated gene therapy products approved by FDA and EMA in rare pediatric neurogenetic diseases

疾病名称	药物名称	载体	生产商	获批上市 时间	给药途径	批准适用 年龄	批准机构
SMA(I型)	Zolgensma	AAV9	Novartis Gene Therapies	2019年5月	静脉注射	2岁以下	FDA
AADCD	Upstaza	AAV2	PTC Therapeutics	2022年7月	脑实质注射	18个月以上	EMA
杜氏肌营养不良	Elevidys	rAAVrh74	Sarepta Therapeutics and Novartis	2023年6月	静脉注射	4~5岁	FDA

SMA：脊髓性肌萎缩症；AADCD：芳香族L-氨基酸脱羧酶缺乏症；DMD：杜氏肌营养不良症；AAV：腺相关病毒；FDA：美国食品药品监督管理局；EMA：欧洲药品管理局。

表2.

中国自主研发的用于儿童神经遗传罕见病的基因治疗药物注册临床试验

Table 2 Registered clinical trials of AAV-mediated gene therapy drugs independently developed in China for rare pediatric neurogenetic diseases

疾病名称	状态	载体	目标基因	给药途径	适用 年龄	分期	试验地点	研发单位	编号
婴儿型庞贝病	招募	AAV9	GAA	静脉注射	<6个月	I期	解放军总医院 第七医学中心	锦篮基因科技有限公司	ChiCTR2200063229
婴儿型庞贝病	招募	AAV9	GAA	静脉注射	1~6岁	I/II期	中国人民解放军总医院第一医学中心	锦篮基因科技有限公司	ChiCTR2200065664
晚发型庞贝病	招募	AAV9	GAA	静脉注射	1~18岁	I/II期	中国人民解放军总医院第一医学中心	锦篮基因科技有限公司	ChiCTR2200065663
婴儿型庞贝病	招募	AAV9	GAA	静脉注射	≤6个月	I/II期	全国多中心	锦篮基因科技有限公司	NCT05793307
SMA 1型	招募	AAV9	SMN1/SMN2	鞘内注射	<8个月	I期	解放军总医院 第七医学中心	锦篮基因科技有限公司	ChiCTR2200063230
SMA 1型	招募	AAV9	SMN1/SMN2	鞘内注射	≤6个月	I/II期	解放军总医院 第七医学中心	锦篮基因科技有限公司	ChiCTR2200066399
SMA 1型	招募	AAV9	SMN1/SMN2	鞘内注射	0~6个月	I/II期	解放军总医院 第七医学中心	锦篮基因科技有限公司	NCT05824169
SMA 1型	招募	AAV9	SMN1/SMN2	静脉注射	1~180 d	I/II期	复旦大学附属 儿科医院	杭州嘉因生物科技有限公司	NCT05614531
AADCD	招募	AAV9	AADC	脑实质 注射	24个月~7岁	I期	上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心	上海天泽云泰生物医药有限公司	NCT05765981

AAV：腺相关病毒；GAA：酸性α-葡萄糖苷酶；SMA：脊髓性肌萎缩症；SMN：运动神经元生存蛋白；AADCD：芳香族L-氨基酸脱羧酶缺乏症；AADC：芳香族L-氨基酸脱羧酶；NCT：美国国家临床试验；ChiCTR：中国临床试验注册中心。

2.1. 神经肌肉病

近年来，AAV介导的基因治疗在DMD、SMA等神经肌肉病中有了突破性的进展。目前的基因治疗药物研发以体内增补为主，基因编辑较少。2019年5月，美国FDA批准Zolgensma用于治疗2岁以下SMA患者，2022年1月该药通过中国国家药品监督管理局药品审评中心(Center for Drug Evaluation，CDE)的临床试验许可。Zolgensma是目前首个也是唯一获得批准用于SMA基因治疗的药物。Zolgensma通过AAV9载体引入人SMN1基因，为单次静脉注射给药，可透过血脑屏障，直接增加体内SMN的蛋白质表达，长期改善患者生活质量，具有良好的安全性和有效性^[14-15]，但在部分患者中出现的不良反应仍然不容忽视。2022年2名儿童在接受Zolgensma治疗后死于急性肝功能衰竭^[16]。2022年6月，中国自主研发的SMN1基因增补治疗药物EXG001-307注射液(CXSL2200146)的临床试验获得中国CDE批准，成为国内首个被批准进入注册临床试验的I型SMA静脉注射基因治疗药物。该产品对AAV载体进行了创新设计，目的在于减轻对心脏和肝脏的副作用以更好地发挥疗效；随后2022年10月，通过鞘内注射给药的CG101AAV注射液获得临床试验许可，用于治疗I型及II型SMA，2023年4月获批用于III型SMA临床试验。

DMD的基因治疗进入临床应用阶段，针对基因治疗的递送方式也在不断改进，从物理递送、非病毒载体递送、病毒载体递送发展到组织特异性病毒载体。目前，在美国临床试验注册中心(https://www.clinicaltrials.gov/)和欧盟临床试验登记中心(https://www.clinicaltrialsregister.eu/)注册的关于AAV介导DMD基因治疗的临床试验有10余项，主要研究策略包括：终止密码子通读、外显子跳跃、载体介导的基因替代治疗、基因编辑治疗^[17]。由于DMD基因外显子数量庞大，是已知的人类最大基因(2.4 Mb)，而AAV载体容量仅约4.7 kb，目前有研究^[18-19]通过双重AAV技术和慢病毒载体提高基因载体的容量，有望装载全长的DMD基因。Sarepta Therapeutics、Pfizer和Solid Biosciences公司主要致力于DMD基因治疗的开发，且都开发了AAV递送小型DMD基因治疗^[20-21]。2023年6月，Sarepta公司与罗氏（Roche）联合开发的基因治疗产品Elevidys获FDA加速批准上市，用于治疗4至5岁DMD儿童患者。前期部分研究^[22]数据显示DMD基因治疗具有一定的有效性及安全性；但在临床试验PF-06939926中，1例失去独立行走能力的DMD患者在参加Ib期临床试验后死亡，III期临床试验中也有3名DMD患者出现肌肉无力、急性肾损伤和血小板下降，多在给药后的最初几周发生^[23]。近年规律性重复短回文序列簇(clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)/CRISPR相关核酸酶9(CRISPR-associated nuclease 9，Cas9)技术被广泛应用^[24]，通过注射rAAV包装的Cas9和gRNA，可以恢复抗肌营养不良蛋白表达，改善肌肉收缩能力，表明CRISPR/Cas9系统技术用于纠正导致DMD的多种遗传突变，并为永久治疗DMD提供了方向^[25-26]。Tabebordbar等^[27]开发了一种靶向肌肉组织的新型AAV载体即MyoAAV，其具有特异性靶向肌肉组织、治疗剂量较低、肝毒性低等优点，MyoAAV的出现进一步推动了AAV在神经肌肉病中的应用。

2.2. 溶酶体病

溶酶体病常累及多个器官和系统，70%的患者有显著的中枢神经系统症状^[28]。血脑屏障的存在限制了酶替代疗法治疗溶酶体病的效果，AAV介导的基因疗法在动物实验和临床试验中都表现出显著的优越性和安全性，在儿童庞贝病，黏多糖贮积症(mucopolysaccharidosis，MPS)，神经元蜡样脂褐质沉积症(neuronal ceroid lipofuscinoses，NCL)2、3、6、7型，异染性脑白质营养不良病(metachromatic leukodystrophy，MLD)，神经节苷脂贮积症，I型和II型戈谢病等中开展了多项临床研究^[29]。目前已注册多项AAV介导的儿童庞贝病基因治疗的临床试验，基因治疗产品主要为美国佛罗里达大学研发的用于晚发型庞贝病治疗的rAAV1-CMV-GAA，以及中国锦篮基因科技有限公司研发的用于婴儿型庞贝病治疗的GC301，二者分别使用AAV1、AAV9血清型载体，通过肌肉注射、静脉注射方式进行基因替补治疗(表1、2)。通过麻醉后胸腔镜辅助下膈肌注射给药[AAV1-巨细胞病毒(cytomegalovirus，CMV)-酸性α-葡糖苷酶(acid alpha-glucosidase，GAA)]，可改善晚发型庞贝病患者的呼吸功能，数据显示该研究安全、有效^[30-31]。北京锦篮基因科技有限公司开发的GC301腺相关病毒注射液治疗庞贝病的临床研究数据有待进一步更新。在MPS中AAV介导基因治疗的临床试验研究主要集中在MPS I、II、III、VI型患者，儿童患者中共计注册10项，采用血清型AAV9、AAV2/6、AAVrh10、AAV2/5、AAV2/8，通过脑室注射、静脉注射、脑实质注射方式进行基因治疗。目前有4项(3种基因治疗药物)3期临床试验正在进行患者招募。部分前期研究^[32-34]结果显示：在MPS I型、II型患者中，AAV介导的基因治疗耐受性良好，无严重的治疗相关不良事件；治疗后患者酶活性增加，与自然病程相比，患者神经认知水平有一定程度的提高。

2.3. 癫痫和发育性癫痫性脑病

癫痫和发育性癫痫性脑病是发现新致病基因的重点领域。尽管抗癫痫发作药物不断研发上市，但仍有25%~30%的癫痫患者为药物难治性癫痫。关于基因治疗癫痫的临床研究及应用远远落后于神经肌肉病、溶酶体病和其他遗传罕见病。特别是离子通道基因变异导致的癫痫及发育性癫痫性脑病，涉及复杂的基因功能改变，包括功能获得型、功能丧失型、功能获得和丧失型，让基因治疗变得较为复杂。SCN1A基因变异导致的Dravet综合征是遗传性癫痫的代表，由于SCN1A基因较大，含有26个外显子，而且SCN1A基因在体外复制时容易产生新发变异，稳定性较差，在大肠杆菌感受态扩增SCN1A质粒时每次扩增均需要进行测序，因此通过AAV递送SCN1A基因受限。AAV9-RE(GABA)-eTF(SCN1A) (ETX101)是一种靶向γ-氨基丁酸(gamma-aminobutyric acid，GABA)能抑制性神经元的基因疗法，通过AAV递送SCN1A特异性转录因子eTF(SCN1A)和GABA能调节元件，以上调SCN1A基因在受影响的抑制性神经元中的表达水平，发挥抗癫痫作用。杂合Dravet小鼠经侧脑室单次给药后，小鼠的存活率增加，热性惊厥发作的阈值升高且自发性癫痫发作次数减少^[35]，现已进入I/II期临床试验阶段(NCT05419492，表1)。此外，还有其他AAV介导的基因疗法在Dravet综合征的动物实验中显示出有效性，如通过脑室注射AAV9载体递送NaVβ1，或静脉注射AAV-PHP.eB载体递送CRISPR/cas9、gRNA，均可以改善小鼠表型^[36-37]。CG01是一种基于AAV的基因治疗药物，目前处于临床前研究阶段，可以将神经肽Y(neuropeptide Y，NPY)及其受体Y2递送到脑内特定区域，并稳定表达，目前未发现其在认知和体重方面的不良反应^[38]。相信越来越多癫痫相关基因治疗临床研究的开展会改变诊疗模式，为药物难治性癫痫的治疗带来新希望。

2.4. 其他神经遗传罕见病

AAV介导的基因治疗策略在其他神经遗传罕见病中也有较好的应用前景。针对AADCD，目前有多项临床试验在招募受试者或已完成。对于儿童AADCD患者，主要选用血清型AAV2，采用脑实质注射进行基因治疗。2022年7月PTC Therapeutics公司AAV基因治疗药物Upstaza已获得EMA批准上市(表3)，成为首个通过脑定位注射给药的基因治疗药物，同时也是首个获得上市批准的用于治疗18个月以上AADCD的AAV基因治疗药物。I/II期临床试验^[39](NCT01395641，表1)结果显示：治疗后患者耐受性良好，运动发育得到了一定程度的改善。2023年3月，上海交通大学医学院儿童医学中心注册了一项新的临床试验(NCT05765981，表2)，采用血清型AAV9，通过双侧壳核注射基因治疗药物VGN-R09b，目前该研究正在招募阶段，这也是国内首个针对AADCD患者开展的基因治疗临床研究，研究结果有待后续更新。近年来AAV介导的基因治疗在多种儿童神经遗传罕见病中开展了临床前研究及临床试验。随着技术的发展，不同细胞类型特异性的AAV载体不断被研发出来，如对少突胶质细胞趋向性更强的AAV变体AAV/Olig001可以克服常用AAV血清型难以靶向少突胶质细胞，突破对海绵状脑白质营养不良等遗传性脑白质病的治疗瓶颈^[40]。同时，AAV介导的神经追踪和疾病造模深化了儿童神经遗传罕见病致病机制的研究，为其防治奠定了基础^[41]。

3. 挑战与机遇

在临床上AAV载体有诸多的优势，但也存在一定的局限性，给AAV介导的基因治疗的临床应用带来了很大的挑战。这些挑战包括降低免疫原性，提升细胞/组织靶向性，优化可携带的基因容量限制，降低生产成本，增加适应证等。AAV是一种外源性抗原，尽管免疫原性低，仍有引起机体相应的免疫反应，产生中和抗体，甚至是细胞毒性反应的风险。在临床试验研究中发现的严重不良事件警示研究人员应对AAV介导的基因治疗的安全性提出更高的要求。虽然理论上AAV载体为非整合型病毒载体，导致细胞基因组发生插入突变的风险相对较小，但仍有在特定情况下载体整合至基因组的报道^[42-43]，部分药物的基因修饰活性可使细胞的遗传物质或生物学特性发生不可逆的改变。基因治疗通过引起人体的永久或长期的变化达到治疗效果，这些变化在体内长期存在，可能增加不可预测的风险，如迟发性不良反应、长期表达、潜伏再激活、持续感染、基因编辑活性、非预期的生物分布、基因重排或重组、免疫原性等，甚至增加患者发生肿瘤的风险。因此，需要建立规范的监管体系以及健全的长期随访制度，评估治疗的有效性、安全性及长期预后。

挑战与机遇并存。随着基因治疗研发和上市脚步的加速，中国成为全球基因治疗药物临床试验注册热点国家，更多国内外公司已将中国作为推出其原研产品的首发市场，而此前传统药物通常是在美国、欧盟或日本首发。基于基因治疗产品临床试验的特殊性，早期临床试验通常采用I/II期融合试验设计，在罕见病药物快速审批流程的推动下，具有良好安全性的研究将会迅速推进至注册临床研究II期或III期。例如Zolgensma先后获得该药审批的快速通道、突破性疗法、罕见儿科疾病治疗药物、优先审评等相关资格认证，极大地缩短了审评时间。目前，多个领先的中国临床科研团队主持的多项AAV介导的基因治疗已经注册或者进入临床试验阶段。临床研究规模的不断扩大，有助于国内研究团队收集第一手诊治数据，积累基因治疗经验。同时，相关支持性的政策环境将进一步加速整个基因治疗生态圈的形成。针对罕见病的优惠医保政策的出台为儿童神经遗传罕见病诊治提供了重要基础条件。基因治疗的发展进步也将为更多遗传性疾病的治疗带来希望。

基金资助

湖南省重点研发计划(2022SK2036)。

This work was supported by the Key Research and Development Program of Hunan Province (2022SK2036), China.

利益冲突声明

作者声称无任何利益冲突。

作者贡献

王晓乐 论文撰写与修改；林雪芹、贺海兰 论文修改；彭镜 论文指导及修改。所有作者阅读并同意最终的文本。

原文网址

http://xbyxb.csu.edu.cn/xbwk/fileup/PDF/2023091388.pdf