高原低氧对大鼠左乙拉西坦药代动力学特征及脑血分布的影响

Abstract

Objective

Plateau hypoxia exposure causes changes in pharmacokinetic parameters and cerebral-blood distribution of drugs, including many substrates of P-glycoprotein (P-gp). Levetiracetam, a kind of antiepileptic drugs, is a substrate of P-gp. Whether plateau hypoxia exposure changes its pharmacokinetic characteristics and cerebral-blood distribution remains unclear. This study aims to investigate the effects of plateau hypoxia on the pharmacokinetics and cerebra-blood distribution of levetiracetam.

Methods

Wistar rats were divided into a low-altitude control group, a high-altitude group, a solvent group, and a P-gp induction group. After 24 h of exposure at altitude of 4 010 m, rats in the high-altitude group were given levetiracetam orally or intravenously. The plasma was respectively collected at 0.083, 0.25, 0.5, 0.83, 1.25, 2, 4, 6, 8, 10, 12, and 24 h after oral administration of the drug, while both plasma and brain were respectively collected at 5, 45, 60,120 and 240 min after intravenous injection. After 3 days administration of dexamethasone, plasma and brain of rats in the P-gp induction group were collected at 120 min after intravenously giving levetiracetam. Plasma and brain concentrations of the drug were determined by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS). The expression of P-gp in blood-brain barrier was detected by Western blotting.

Results

Compared with the low-altitude control group, the area under the curve (AUC) and mean residence time (MRT) of levetiracetam were respectively decreased by 14.69% (P<0.01) and 15.42% (P<0.01), while the clearance (CL) was increased by 16.67% (P<0.01) in the high-altitude group. The ratio of brain/blood plasma drug concentration was decreased by 22.82% (P<0.05), 12.42% (P<0.05), 17.40% (P<0.01), and 13.22% (P<0.01) at 5, 45, 120, and 240 min after injection, respectively. The expression of P-gp on the blood-brain barrier was increased by 86.3% (P<0.05). Compared with the solvent control group, the expression of P-gp on the blood-brain barrier in the P-gp induction group was increased by 56.3% (P<0.05), the ratio of brain/blood plasma drug concentration was decreased by 19.3% (P<0.05).

Conclusion

After acute plateau hypoxia exposure, the pharmacokinetic of levetiracetam in rats are altered, and the cerebral-blood distribution of the drug in rats is decreased, which may be related to the up-regulation of P-gp expression on the blood-brain barrier.

左乙拉西坦(levetiracetam，LEV)是目前临床使用的一线抗癫痫药物(antiepileptic drugs，AEDs)，属于吡咯烷酮衍生物^[1]。作为第2代AEDs，LEV的安全性虽然较老一代AEDs有较大提升，但在儿童、孕妇、老年人等特殊人群中，其药代动力学特征发生了显著的改变。因此，对LEV进行治疗药物监测(therapeutic drug monitoring，TDM)依然是必要的^[2]。研究^[3]表明高原低氧暴露会改变大量药物的药代动力学参数，但是高原低氧对LEV药代动力学特征的影响尚不明确。

LEV需透过血脑屏障(blood-brain barrier，BBB)进入脑组织发挥作用，适宜的脑内药物浓度是药物治疗有效性及安全性的保证，但因标本采集存在一定困难，临床上通过测定血药浓度进行相应监测，这种替代办法的准确性依赖于相对稳定的脑/血药物浓度比。当药物在BBB的透过性发生变化时，脑/血药物浓度比随之改变，那么沿用原有血药浓度参考范围将无法正确指导患者的个体化用药^[4]。P糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)是BBB中脑微血管内皮细胞上表达的重要的外排转运蛋白质之一，可以限制药物进入脑组织^[5]。本课题组前期研究^[6]表明：暴露于高原低氧环境会导致BBB上P-gp表达的改变，进而影响AEDs的脑血分布。最新研究^[7]表明LEV是P-gp的底物。高原环境暴露是否会改变LEV的脑/血药物浓度比尚不清楚。本研究分析高原环境暴露对大鼠体内LEV药代动力学特征及脑/血药物浓度比的影响，检测BBB中P-gp的表达，并评价P-gp在改变大鼠LEV脑/血药物浓度比中的作用，旨在为LEV的高原个体化用药提供参考。

1. 材料与方法

1.1. 主要药品与试剂

LEV对照品(批号100963-202004)和卡马西平对照品(批号100629-200401)购自中国食品药品检定研究院；地塞米松(批号Y24O11G128470)和LEV(批号Y18J7C16394)购自上海源叶生物技术有限公司；色谱纯乙腈(批号JA107230)、葡聚糖(70 kD，批号C1755925)购自德国MERCK公司；细胞滤网(40和100 μm)购自中国Biosharp公司；山羊抗兔IgG-HRP二抗购自武汉博士德生物工程有限公司；抗P-gp抗体(ab170904)和抗Na⁺/K⁺转运ATP酶α亚单位(alpha-1 subunit of the Na⁺/K⁺ ATPase，ATP1A1)抗体(ab76020)购自美国Abcam公司。

1.2. 主要仪器

UFLC-20A高效液相色谱仪为日本岛津公司产品，API3200三重四级杆串联质谱仪为美国应用生物系统公司产品，Spectra Max i3酶标仪为美国Molecular公司产品，蛋白质印迹电泳仪和ChemiDOC^TM MP Imaging System为美国BIO-RAD公司产品。

1.3. 动物及分组

SPF级雄性Wistar大鼠106只，体重180~220 g，由斯贝福(北京)生物技术有限公司提供[实验动物许可证：SCXK(京)2019-0010]。将88只大鼠随机分为低海拔对照(LA)组和高海拔(HA)组；将18只大鼠随机分为溶剂对照(SC)组和P-gp诱导(PI)组。HA组大鼠通过公路运输，于20 h内从兰州(海拔1 500 m)急进至位于青海省玉树州巴塘(海拔4 010 m)的高原医学实验室，24 h后开始实验；LA组、SC组及PI组大鼠饲养于中国人民解放军联勤保障部队第九四〇医院基础医学实验室，LA组不做处理，SC组及PI组于实验开始前连续3 d分别腹腔注射玉米油或玉米油配制的地塞米松溶液[5 mg/(kg·d)]^[8]。各组大鼠实验开始前12 h均禁食不禁水。动物实验经中国人民解放军联勤保障部队第九四〇医院科研管理伦理委员会批准(审批号：2021KYLL190)，且实验均按照相关指导原则和规定进行。

1.4. 样品收集

LA组和HA组大鼠各取8只给予45 mg/kg LEV灌胃(按照体表面积折算法由临床口服剂量换算得来)后，于第0.083、0.25、0.5、0.83、1.25、2、4、6、8、10、12、24 h眼眶静脉丛采血至含有肝素钠的EP管中；LA组和HA组各另取30只大鼠尾静脉注射 45 mg/kg LEV后(LEV口服生物利用度接近100%，故注射剂量与口服剂量相同)，于第5、45、60、120、240 min分别取6只大鼠眼眶静脉丛采血至含有肝素钠的离心管中，并立即取脑组织；SC组和PI组每组取6只大鼠尾静脉注射45 mg/kg LEV后，于第120 min采集上述样本；上述血样以1 000 g离心5 min，收集上层血浆，-20 ℃保存，并立即取脑组织。脑组织均于-80 ℃保存。

1.5. 色谱质谱条件

色谱柱Gemini C18(3.0 mm × 75 mm，3.0 μm)；流动相乙腈-水(90꞉10，v/v)；柱温25 ℃，流速 0.4 mL/min，进样量2 μL，分析时间为3 min。在电喷雾电离源正离子电离方式下，采用多反应监测模式有较好的质谱响应。质谱参数设置如下：喷雾电压为4 500 V，雾化温度为200 ℃，LEV和内标卡马西平碰撞诱导解离电压分别为15和24 V，碰撞能量为20和24.5 V。最终确定LEV检测离子为m/z 171.20→126.00，卡马西平检测离子为m/z 237.20→194.20。

1.6. 生物样品处理

准确吸取血浆样品30 μL置于0.5 mL的离心管中，加入150 μL的50 ng/mL内标溶液，涡旋震荡30 s，4 500 g离心10 min后取上清于进样瓶中，进样量2 μL。取备用脑组织，称取0.1 g脑组织于2 mL的离心管中，加1.0 mL生理盐水匀浆，取30 μL匀浆液加入75 μL的100 ng/mL内标对照品工作溶液中振荡30 s，4 500 g离心10 min后取上清液进样。脑/血药物浓度比=脑组织药物浓度/血浆药物浓度^[8]。

1.7. BBB膜蛋白提取

注射LEV前，从LA和HA组各取6只大鼠，SC组和PI组各取3只大鼠，处死后立即取出大脑，在冰冷的Hank’s溶液中剥去软脑膜并去除大血管和髓质。剩余组织以Hank’s为匀浆基质，在玻璃匀浆器中上下匀浆6次，匀浆液以1 000 g离心10 min。沉淀重悬于15 mL 18%葡聚糖中，4 500 g离心15 min，再将沉淀重悬于Hank’s溶液中。悬浮液先后用100 μm细胞滤网和40 μm细胞滤网过滤，随后用含有2%蛋白酶抑制剂的Hank’s溶液收集滤网上的脑微血管，4 500 g离心15 min后收集的沉淀即为脑微血管^[9]。采用膜蛋白提取试剂盒提取脑微血管膜蛋白，使用BCA试剂盒进行蛋白质定量。

1.8. P-gp定量

使用7.5%聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白质样品，并在恒定电压(80 V)下转移至聚偏二氟乙烯(polyvinylidenefluoride，PVDF)膜中。用5%脱脂奶粉封闭2 h，加入抗P-gp抗体、抗ATP1A1抗体，于4 ℃孵育过夜。随后用缓冲液洗4次，室温条件下加入二抗孵育2 h，PVDF膜用缓冲液洗4次后曝光。曝光图片通过Quantity One软件分析目的蛋白质表达量。

1.9. 统计学处理

采用SPSS 25.0统计学软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差( $\overline{x}$ ±s)表示，多组比较采用单因素方差分析，2组比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2. 结 果

2.1. 方法验证

2.1.1. 专属性

根据上述生物样品处理方法及检测条件，分析空白生物样品、含药生物样品及给药大鼠的生物样品。结果表明：脑组织及血浆中内源性物质不干扰色谱分析。血浆中LEV的保留时间为0.99 min，脑组织中LEV的保留时间为1.27 min(图1)，表明该方法具有较高的专属性。

图1.

LEV在生物样品中的典型色谱图

Figure 1 Chromatograms of levetiracetam in biological samples

A: Blank plasma sample; B: Plasma containing the reference substances; C: Plasma sample of rats after administration; D: Blank brain tissue sample; E: Brain tissue containing the reference substances; F: Brain tissue sample of rats after administration. Blue: Levetiracetam; Red: Carbamazepine. LEV: Levetiracetam.

2.1.2. 线性关系

以药物浓度为横坐标，LEV与内标峰面积比值为纵坐标进行线性回归，得到LEV在血浆和脑组织中的线性回归方程分别为：Y=0.000457X-0.104，r=0.9982；Y=0.000793X+0.107，r=0.9990。结果表明LEV在血浆中0.05~100 μg/mL的范围内线性关系良好，在脑组织中0.05~70 μg/mL范围内线性关系良好。以标准曲线的线性范围最低点作为定量限，则在血浆及脑组织中其最低定量限均为0.05 μg/mL。

2.1.3. 提取回收率

用空白血浆配制低、中、高3个质量浓度(0.09、5、80 μg/mL)的标准血浆溶液，按上述要求进行操作，其提取回收率为分别为98.29%、101.20%、100.13%，相对标准偏差(relative standard deviation，RSD)分别为1.16%、1.13%、1.65%；用空白脑匀浆配制低、中、高3个质量浓度(0.09、1、56 μg/mL)的脑匀浆溶液，其提取回收率为分别为103.24%、107.33%、101.73%，RSD分别为4.61%、2.85%、3.40%。上述结果表明测定数据精密度良好，实验方法可重复。

2.1.4. 精密度与准确度

配制含有低、中、高质量浓度的LEV生物样品各5份，按照上述方法进行处理，测定日内和日间精密度与准确度，结果见表1，提示LEV的日内和日间精密度和准确度均满足生物样品测定要求。

表1.

LEV在生物样品中的精密度与准确度(n=5)

Table 1 Precision and accuracy of levetiracetam in biological samples (n=5)

生物样品	日内			日间
	测定水平/(μg·mL-1)	精密度/%	准确度/%	测定水平/(μg·mL-1)	精密度/%	准确度/%
血浆/(μg·mL-1)
0.09	0.09±0.001	1.32	99.81	0.09±0.001	1.15	99.05
5	5.01±0.244	4.88	100.20	4.94±0.180	3.63	98.80
80	80.67±1.320	1.64	100.75	80.07±0.860	1.07	100.08
脑/(μg·g-1)
0.09	0.09±0.001	1.31	100.95	0.09±0.003	3.31	102.10
1	1.07±0.030	2.36	106.67	1.07±0.017	1.55	107.44
56	56.43±0.850	1.51	100.77	56.66±1.140	2.01	101.17

LEV：左乙拉西坦。

2.1.5. 稳定性试验

LEV生物样品在4 ℃保存24 h、3次反复冻融、-80 ℃保存1个月的稳定性结果显示：在不同条件处理后，生物样品中LEV浓度变化≤6.74%，具有良好的稳定性。

2.2. 生物样品中的药物浓度

2.2.1. 高原低氧环境对LEV药代动力学特征的影响

与LA组相比，HA组大鼠的药时曲线下面积(area under the curve，AUC)和平均驻留时间(mean residence time，MRT)显著下降，血浆清除率(clearance，CL)显著升高(均P<0.01)，其中AUC下降14.69%，MRT下降15.42%，而CL升高了16.67%，其他参数差异均无统计学意义(均P>0.05，表2)。这表明高原低氧暴露改变了LEV的药代动力学特征，主要表现为吸收减少，代谢加快。

表2.

高原低氧环境下LEV在大鼠体内的主要药代动力学参数(n=8， $\overline{\mathit{x}}$ ±s)

Table 2 Pharmacokinetic parameters of levetiracetam in rats under plateau hypoxia environment (n=8, $\overline{\mathit{x}}$ ±s)

组别	AUC(0-t)/(μg·L-1·h-1)	AUC(0-∞)/(μg·L-1·h-1)	MRT(0-t)/h	MRT(0-∞)/h
LA组	373.14±38.32	374.61±38.47	5.06±0.23	5.15±0.24
HA组	318.31±31.17**	319.28±31.25**	4.28±0.27**	4.35±0.27**

组别	t 1/2z/h	T max/h	CLz/F/(L·h-1·kg-1)	V z/F/(L·kg-1)	C max/(μg·L-1)
LA组	2.90±0.19	1.14±0.57	0.12±0.01	0.51±0.06	57.78±4.93
HA组	2.85±0.41	0.59±0.22*	0.14±0.02**	0.59±0.12	56.70±5.01

与LA组比较，*P<0.05，**P<0.01。LA：低海拔；HA：高海拔；LEV：左乙拉西坦；AUC：曲线下面积；MRT：平均驻留时间；T _max：达峰时间；CL：血浆清除率；V _z/F：表观分布容积；C _max：峰浓度。

2.2.2. 高原低氧环境下LEV的脑血浓度

大鼠静脉注射LEV后，血浆药物浓度随着时间的变化逐渐降低，而脑组织药物浓度则在60~120 min时达到峰值。根据血浆药物浓度和脑组织药物浓度计算得到脑/血药物浓度比随时间变化呈上升趋势(图2)。与LA组相比，HA组脑/血药物浓度比在给药后5、45、120和240 min分别降低22.82%、12.42%、17.40%和13.22%(均P<0.05)。

图2.

LEV(45 mg/kg)在低海拔对照组与高海拔组大鼠体内的脑血透过率(n=6， $\overline{\mathit{x}}$ ±s)

Figure 2 Cerebral blood transmittance of levetiralacetam (45 mg/kg) in rats of the low-altitude control group and the high-altitude group (n=6, $\overline{\mathit{x}}$ ±s)

A: Drug concentration in plasma. B: Drug concentration in brain. C: Ratio ofbrain/plasma drug concentration. *P<0.05, **P<0.01 vs the HA group. LA: Low altitude; HA: High altitude; LEV: Levetiracetam.

2.2.3. 高原低氧对大鼠BBB中P-gp表达的影响

对HA组和LA组大鼠的脑微血管段中P-gp进行蛋白质印迹法检测，结果在分子量为170 kD处检测到P-gp特异性条带，在110 kD处检测到内参ATP1A1特异性条带。HA组P-gp相对表达量是LA组的1.863倍(P<0.05，图3)。

图3.

高原低氧环境对大鼠血脑屏障P-gp表达水平的影响(n=6， $\overline{\mathit{x}}$ ±s)

Figure 3 Effect of plateau hypoxia environment on P-gp protein expression level in the blood-brain barrier of rats (n=6, $\overline{\mathit{x}}$ ±s)

*P<0.05 vs the LA group. LA: Low altitude; HA: High altitude; P-gp: P-glycoprotein.

2.2.4. 地塞米松对大鼠BBB中P-gp表达的诱导作用

蛋白质印迹结果显示：与SC组相比，PI组大鼠BBB中P-gp表达水平上调56.3%(P<0.05，图4)，表明大鼠BBB 中P-gp诱导成功。

图4.

地塞米松对大鼠血脑屏障中P-gp表达水平的诱导作用(n=3， $\overline{\mathit{x}}$ ±s)

Figure 4 Induction of P-gp expression by DEX in the BBB of rats (n=3, $\overline{\mathit{x}}$ ±s)

*P<0.05 vs the SC group. SC: Solvent control; PI: P-gp induction; DEX: Dexamethasone; P-gp: P-glycoprotein; BBB: Blood-brain barrier.

2.2.5. P-gp对LEV脑血分布的影响

与SC组相比，PI组血浆药物浓度升高(P<0.05)，脑组织中药物浓度差异无统计学意义(P>0.05)，脑/血药物浓度比降低了19.3%(P<0.01，图5)。

图5.

P-gp对大鼠体内LEV脑血分布的影响(n=6， $\overline{\mathit{x}}$ ±s)

Figure 5 Effects of P-gp on cerebral-blood distribution of levetiracetam in rats (n=6, $\overline{\mathit{x}}$ ±s)

A: Drug concentration in plasma; B: Drug concentration in brain; C: Ratio of brain/plasma drug concentration. *P<0.05, **P<0.01 vs the SC group. SC: Solvent control; PI: P-gp induction; P-gp: P-glycoprotein; LEV: Levetiracetam.

3. 讨 论

癫痫是一种高发病率疾病，主要通过药物治疗，且患者需要长程服药。丙戊酸钠作为经典的广谱AEDs，治疗指数低、个体差异大，不良反应与癫痫发作症状相似，难以区分，用药患者需要进行TDM^[10]。LEV作为新型广谱AEDs，安全性好，不良反应少，目前已广泛用于临床治疗。LEV具有良好的药代动力学性质，一般人群用药无需开展TDM；但是儿童、妊娠期妇女、老年人及肾功能不全患者使用时，其药代动力学特征发生了显著改变，仍需进行TDM^[11]。药代动力学特征是否发生改变是患者服用LEV时是否需要开展TDM的参考依据。暴露于海拔大于3 000 m的高原环境会改变大部分药物的药代动力学参数^[12]，但其是否影响LEV的体内代谢过程，高原人群服用LEV是否需要开展TDM均无相关研究。因此，本研究在位于海拔4 010 m的高原实地实验室研究了高原低氧对大鼠LEV药代动力学特征的影响，结果显示：急性高原低氧暴露导致LEV在大鼠体内的AUC降低，CL升高，MRT缩短，表明高原低氧可能通过减少LEV的吸收、促进其体内消除改变其药代动力学，提示在高原低氧环境下服用LEV可能需要进行TDM。

TDM测定的是血药浓度，而LEV需透过BBB进入脑内发挥药效，血药浓度与脑内药物浓度之间相对稳定的比例关系是通过TDM正确指导用药的前提条件^[13]。当脑/血药物浓度比发生改变时，沿用已有的血药浓度参考范围则可能给药物治疗的安全性、有效性带来隐患^[14]。药物通过血液进入脑内的过程属于体内药物的分布过程，为了降低高原低氧导致药物吸收改变对药物分布研究的干扰，本研究采用静脉注射给药的方式研究高原低氧对LEV脑血分布的影响。结果表明：高原低氧的确改变了LEV在大鼠体内的脑血分布，HA组大鼠体内LEV脑/血药物浓度比较LA组显著降低。此外，注射给药后，与LA组相比，HA组大鼠血药浓度除第5 min 与其浓度一致外，之后的4个时间点均显著降低，表明高原低氧加快了大鼠体内LEV的消除，该结果与口服给药结果一致。

BBB对药物的透过率不仅与药物的物理化学性质有关，还与BBB的完整性及其表达的主动转运蛋白质有关^[15]。本课题组前期研究^[16]结果表明本研究所选择的高原低氧暴露条件不会影响大鼠BBB的完整性。P-gp可以限制LEV从血液进入脑组织的含量^[7]，因此本研究对高原低氧暴露大鼠BBB上的P-gp表达进行检测，结果表明：与LA组相比，HA组大鼠BBB中P-gp表达显著上调。这与高原低氧降低大鼠LEV脑/血浓度比的结果相符。为了进一步验证BBB中P-gp表达上调与LEV脑/血浓度比下降的关系，本研究通过注射地塞米松成功诱导了大鼠BBB中P-gp表达的上调，并测定了注射LEV后第120 min(该时间点HA组与LA组LEV的脑/血药物浓度比差值最大)的脑/血药物浓度比，结果表明P-gp表达的上调会导致大鼠体内LEV的脑/血药物浓度比的降低。上述结果表明BBB中P-gp表达的上调可能是高原低氧暴露导致LEV的脑/血药物浓度比降低的原因。

综上所述，高原低氧暴露会改变LEV在大鼠体内的药代动力学特征及LEV的脑/血药物浓度比，原因可能与BBB中P-gp的表达上调有关。在高原环境下服用LEV可能需要进行TDM，而LEV的血药浓度参考范围可能需要进行适当的调整。此外，BBB中P-gp表达的改变会影响LEV的脑血分布，在联合用药时应当考虑联用药物对BBB中P-gp的影响。

基金资助

甘肃省科技计划项目(21JR7RA009，22JR5RA017，20JR10RA014)。

This work was supported by the Science and Technology Program Project of Gansu Province, China (21JR7RA009, 22JR5RA017, 20JR10RA014).

利益冲突声明

作者声称无任何利益冲突。

作者贡献

赵安鹏 实验设计与实施，数据统计与分析，论文构想与撰写；胡琳 实验实施，数据统计与分析；姚菀腾、常熙雯 数据采集与分析；王荣、李文斌 实验设计，论文审阅与修订。所有作者阅读并同意最终的文本。

原文网址

http://xbyxb.csu.edu.cn/xbwk/fileup/PDF/2023101445.pdf