氯化血红素对缺氧导致小鼠组织损伤的保护作用

Abstract

Objective

Heme chloride (Hemin) is an in vitro purified form of natural heme and an important raw material for anti-anemia and antitumor drugs. This study aims to analyze the protective effect of Hemin on tissue damage in low-pressure oxygen chamber simulated plateau hypoxic mice, and explore its role in anti-plateau hypoxia.

Methods

Thirty male BALB/c mice were randomly divided into a blank group, a positive drug group (acetazolomide, 200 mg/kg), a Hemin low-dose group (15 mg/kg), a Hemin medium-dose group (30 mg/kg), and a Hemin high-dose group (60 mg/kg) with intraperitoneal injection. The anti-hypoxic activity of Hemin was explored by atmospheric closed hypoxia experiment and the optimal dose was screened. Thirty-six male BALB/c mice were randomly divided into a blank group, a hypoxia group, a positive drug group, and a Hemin high-dose group. The plasma inflammatory factor levels and oxidative stress indicators malondialdehyde (MDA), glutataione (GSH), and superoxide dismutase (SOD) levels of myocardium, brain, lung, and liver tissues were measured in different groups with hypoxia for 24 h. The degree of histopathological damage of mice was observed with HE staining. The degree of protection of Hemin against tissue hypoxia injury was detected with the hypoxia probe piperidazole.

Results

Compared with the blank group, the survival time of mice in the positive drug group, the Hemin medium-dose group, and high-dose group was significantly extended (all P<0.05), with the highest prolongation rate in the Hemin high-dose group. Compared with the hypoxia group, mice in the Hemin high-dose group showed a significant increase in SOD level and GSH content of brain tissue, and a significant decrease in MDA content of lung tissue (all P<0.05). The results of HE staining and hypoxia probe showed that Hemin had a significant protective effect on the damage of liver, heart, brain and lung tissues of mice with hypoxia, and the most obvious effect on that of the brain tissue.

Conclusion

Hemin has an effect of improvement on oxidative stress and inflammatory response caused by hypoxia, and has obvious protective effect on tissue damage caused by hypoxia.

当平原人群快速进入海拔超过2 500 m的低氧环境时，机体会出现明显的不适，如头疼、失眠、胃肠道反应、记忆力下降等。在高原环境下，缺氧是影响高原生命活动的重要因素，氧分压的降低使进入气管和肺泡的氧气含量减少，可明显影响机体的生理功能，如血气、血流动力学、各项生化指标以及主要脏器功能改变，同时，这些改变也会干扰药物在体内吸收、分布、代谢和排泄的药代动力学过程，进而可能对药物的临床疗效和安全性造成影响。本专题主要围绕高原对机体的影响展开研究和综述，并针对缺氧导致的机体损伤给予相应的药物治疗，明确药物治疗对各个器官的保护作用，旨在探究高原性缺氧对机体的损伤机制并筛选防治药物，对于保障高原人群健康、民族地区稳定及国防安全意义重大。

(中国人民解放军联勤保障部队第九四〇医院药剂科 王荣教授)

长期生活在平原的人们快速进入高原低氧环境后，导致机体组织和细胞中的氧气供应不足。如果超过机体代偿限度，就会产生一系列急性高原病，甚至造成高原肺水肿或脑水肿乃至死亡。血红素(Heme)是一种主要存在于动物血液和肌肉中的天然卟啉铁，2对Heme和不同的珠蛋白链组成一个四聚体，即血红蛋白。这4个亚单位中的每个亚基包含一个中心铁原子的卟啉环，可以结合1个氧分子。Heme对传递氧气、贮存肌红蛋白、绿色植物的光合作用发挥重要作用^[1]。氧气是合成Heme所必须的元素之一。氯化血红素(heme chloride，Hemin)是Heme的体外纯化形式，一般从动物血液中提取。Hemin是一种天然补铁剂，易吸收，无毒、无刺激性，是理想的抗贫血药和新型补铁剂，具有广泛的生物活性。Hemin具有抗贫血作用，还可参与氧的运输、红细胞的生成和成熟、清除体内过氧化氢、生成维生素A、生成抗体和药物在血液中转运等生理功能；在食品工业中应用为营养强化剂和发色剂等；在医药行业作为抗癌特效药和治疗铅中毒等^[2]。血红素加氧酶(heme oxygenase，HO)可分解和代谢Hemin，有HO-1、HO-2和HO-3这3种类型，其中HO-2主要在神经系统发挥作用^[3-4]。在生理条件下，富含鸟嘌呤的RNA和DNA与Hemin复合时，这些核酸的过氧化酶(单电子氧化、双电子氧化和氧转移)活性大大增强，与天然过氧化酶和P450单加氧酶活性相当^[5]。

Hemin具有多种药理活性，但其是否有抗高原性缺氧的作用鲜见报道。乙酰唑胺是预防和治疗急性高原病的推荐用药。本研究旨在通过给予小鼠Hemin，与阳性药乙酰唑胺进行对比，探究Hemin在急性缺氧条件下对小鼠各组织的保护作用。

1. 材料与方法

1.1. 动物

体重为18~22 g的SPF级健康雄性BALB/c小鼠购于北京斯贝福生物科技有限公司[合格证号：SCXK(京)2019-0010]。本研究已通过中国人民解放军联勤保障部队第九四〇医院医学伦理委员会批准(审批号：2021KYLL067)。

1.2. 试剂与仪器

Hemin(纯度≥97%)购自上海鸿儒科技发展有限公司；乙酰唑胺购自上海源叶生物科技有限公司；丙二醛(malondialdehyde，MDA)、谷胱甘肽(glutataione，GSH)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和蛋白质检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所；肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)的酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)试剂盒购自江苏酶免实业有限公司；小鼠IgG单克隆抗体、兔抗IgG二抗、哌莫硝唑和缺氧探针试剂盒(Hypoxiaprobe^TM-1 Plus Kit)均购自美国Hypoxiaprobe公司。

Microfuge22R台式冷冻离心机为美国Backman公司产品；全自动样品快速研磨仪为上海净信实业发展有限公司产品；Pannorramic DESK，P-MIDI，P250扫描仪为匈牙利3D Histech公司产品；SpectraMax@i3全自动荧光酶标仪为美国Molecular公司产品。

1.3. 方法

1.3.1. 常压密闭实验

将30只雄性BALB/c小鼠随机分为空白组，阳性药组，Hemin低、中和高剂量组，每组6只。乙酰唑胺作为阳性药，给药剂量为200 mg/kg。给药剂量参照文献[5]报道，急性毒性实验结果表明给予小鼠Hemin剂量为50 mg/kg，口服Hemin无任何不良反应，本研究设置Hemin低剂量(15 mg/kg)、中剂量(30 mg/kg)和高剂量(60 mg/kg)。每组腹腔注射3 d，第3天给药30 min后将小鼠放到250 mL广口瓶中(瓶中提前准备滤纸和5 g碱石灰)，用橡胶塞塞紧瓶口，记录小鼠开始缺氧的时间和死亡时间，统计各组小鼠的存活时间并计算与空白组相比存活时间的延长率。

1.3.2. 高原低压氧舱模拟缺氧模型

将36只雄性BALB/c小鼠适应饲养3 d后随机分为空白组、缺氧组、阳性药组和Hemin高剂量组，每组9只。各组腹腔注射3 d后，将小鼠置于低压低氧动物喂养舱中，匀速升高海拔至8 000 m模拟缺氧模型。缺氧24 h后，在实验舱进行第4次给药30 min后摘小鼠眼球取血于润有肝素的离心管中，每组随机取3只小鼠腹腔注射60 mg/kg哌莫硝唑，20~30 min后取小鼠的心、肝、脑、肺组织并固定，用于后面HE染色和缺氧探针的免疫组织化学实验。

1.3.3. Hemin对各组织氧化应激指标的影响

称取组织并用剪刀剪碎，按m꞉v=1꞉9的比例加入生理盐水，用快速研磨仪研磨后，分别以2 500 r/min和4 000 r/min离心10 min(按照说明书要求转速)后分装，于-80 ℃冰箱中冷冻，检测心、肝、脑和肺组织匀浆中GSH含量、SOD活力水平和MDA含量。

1.3.4. Hemin对小鼠血浆炎症因子的影响

用润有肝素的离心管收集各组小鼠的血液，于4 ℃离心机以3 000 r/min离心15 min，测定小鼠血浆中的TNF-α和IL-6水平。

1.3.5. HE染色

摘取小鼠组织洗净后置于4%多聚甲醛中固定，待组织充分固定后脱水、石蜡包埋和切片，用HE染色后，观察各组织病理变化。

1.3.6. 免疫组织化学

固定组织脱水、修整、石蜡包埋、切片、脱蜡和淬灭组织中内源性过氧化氢酶，抗原修复后加入蛋白阻断剂给背景染色。于室温下孵育60 min一抗、室温孵育30 min二抗后，进行显色、复染、乙醇脱水、透片和封片。最后用扫描仪进行全景扫描荧光图像。采用缺氧标志物哌莫硝唑探针检测空白组、缺氧组和Hemin高剂量组小鼠的心、肝、脑和肺组织低氧信号表达强度。

1.4. 统计学处理

采用SPSS 25.0统计软件进行数据分析。符合正态分布的计量资料采用均数±标准差( $\overline{x}$ ±s)表示，采用单因素方差分析LSD-t检验进行分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2. 结 果

2.1. Hemin对常压密闭小鼠存活时间的影响

与空白对照组相比，阳性药组、Hemin中和高剂量组小鼠的存活时间显著延长(均P<0.05，表1)，其中Hemin高剂量组较空白组存活时间的延长率大于阳性药组，效果最好。

表1.

不同剂量氯化血红素对常压密闭缺氧小鼠存活时间的影响(n=6， $\overline{\mathit{x}}$ ±s)

Table 1 Effects of different doses of heme chloride on survival time of hypoxia mice under atmospheric pressure (n=6, $\overline{\mathit{x}}$ ±s)

组别	剂量/(mg·kg-1)	存活时间/min	延长率/%
空白组	0	32.5±2.5	—
阳性药组(乙酰唑胺)	200	36.6±1.0*	12.6
Hemin低剂量组	15	33.3±1.5	2.5
Hemin中剂量组	30	36.5±2.3*	12.3
Hemin高剂量组	60	37.1±3.5*	14.2

与空白对照组比较，*P<0.05。Hemin：氯化血红素。

2.2. Hemin对低压缺氧小鼠血浆炎症因子的影响

缺氧组较空白组的IL-6水平显著升高了24.17%(P<0.05)；阳性药组较缺氧组有下降的趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)；Hemin高剂量组较缺氧组显著降低了19.33%(P<0.05，图1A)。缺氧组较空白组的TNF-α水平显著升高了23.35%(P<0.01)，Hemin高剂量组较缺氧组显著降低了17.75%(P<0.01，图1B)。

图1.

Hemin对小鼠血浆炎症因子IL-6(A)和TNF-α(B)水平的影响(n=6， $\overline{\mathit{x}}$ ±s)

Figure 1 Effects of Hemin on plasma inflammatory cytokines IL-6 (A) and TNF-α (B) in mice (n=6, $\overline{\mathit{x}}$ ±s)

*P<0.05, **P<0.01 vs the blank group; †P<0.05, ††P<0.01 vs the hypoxia group. Hemin: Heme chloride; IL-6: Interleukin-6; TNF-α: Tumor necrosis factor-α.

2.3. Hemin对低压缺氧小鼠氧化应激指标的影响

与空白组相比，缺氧组小鼠肝组织的SOD活力水平和GSH含量显著降低、MDA含量显著升高；心肌组织的SOD活力水平显著降低；脑组织的GSH含量显著降低、MDA含量显著升高；肺组织的MDA含量显著升高(均P<0.05，图2)，说明缺氧对小鼠各组织有不同程度的损伤。其中缺氧24 h对小鼠心肌组织的SOD活力水平降低了21.26%、脑组织的GSH含量降低了63.53%和MDA含量升高了169.01%。

图2.

Hemin对小鼠各组织SOD活力水平(A)、GSH(B)和MDA(C)含量的影响(n=6， $\overline{\mathit{x}}$ ±s)

Figure 2 Effect of Hemin on SOD activity level (A) and contents of GSH (B) and MDA (C) in mouse tissues (n=6, $\overline{\mathit{x}}$ ±s)

*P<0.05, **P<0.01 vs the blank group; †P<0.05, ††P<0.01 vs the hypoxia group. Hemin: Heme chloride; SOD: Superoxide dismutase; GSH: Glutataione; MDA: Malondialdehyde.

与缺氧组相比，阳性药组小鼠心肌组织SOD活力水平显著升高；脑组织SOD活力水平和GSH含量显著升高；肺组织GSH含量显著升高、MDA含量显著降低(均P<0.05，图2)，表明乙酰唑胺能够改善缺氧对组织的损伤。

与缺氧组相比，Hemin高剂量组小鼠的脑组织SOD活力显著增加了60.77%，GSH含量显著升高了117.91%，肺组织的MDA含量显著降低了43.85%，差异均有统计学意义(均P<0.05，图2)。从氧化应激指标来看，Hemin高剂量组对缺氧小鼠的各组织都有保护作用，且效果优于阳性药组。

2.4. Hemin对低压缺氧小鼠组织病理损伤的保护作用

如图3所示，空白组肝脏组织被膜完整，中央静脉内皮细胞较完整，肝细胞结构正常；缺氧组肝细胞排列紊乱，有明显点状坏死；阳性药组肝细胞排列较整齐；Hemin高剂量组中央静脉内皮细胞较完整，肝细胞结构基本正常。空白组心肌细胞基本正常，纤维排列整齐；缺氧组纤维排列不连续，有炎性浸润；阳性药组较缺氧组略有改善；Hemin高剂量组炎性浸润减轻，纤维排列变得整齐，对缺氧损伤改善明显。空白组脑组织皮质区域各细胞排列整齐；缺氧组细胞排列略不整齐，神经元数量减少；阳性药组和Hemin高剂量组神经元数量增加。空白组小鼠肺组织支气管的结构相对缺氧组纤毛排列整齐；缺氧组肺泡壁增厚，可见肺间质水肿，周围有明显的炎性浸润；阳性药组肺泡壁变薄，缺氧状况略有改善；Hemin高剂量组胞质均匀，对缺氧损伤改善明显。

图3.

各组小鼠组织HE染色

Figure 3 HE staining of tissues of mice in different groups

A: Liver tissue; B: Myocardium; C: Brain tissue; D: Lung tissue. The arrows indicate the sites of hypoxic injury in each tissue.

2.5. Hemin对低压缺氧小鼠组织的保护程度

如图4所示，缺氧组较空白组荧光强度增强。与缺氧组相比，Hemin高剂量组心肌组织的荧光强度显著下降了28.13%，脑组织荧光强度显著下降了37.11%，肺组织荧光强度下降了27.45%，差异均具有统计学意义(均P<0.05，表2)，肝组织荧光强度下降了2.69%，但差异无统计学意义(P>0.05)，表明Hemin对缺氧小鼠脑组织保护作用最强。

图4.

Hemin对缺氧小鼠肝(A)、心(B)、脑(C)、肺组织(D)的保护程度

Figure 4 Protective effect of heme chloride on liver (A), heart (B), brain (C), and lung (D) tissues in mice

表2.

各组组织缺氧探针信号强度量化表达(n=3， $\overline{\mathit{x}}$ ±s)

Table 2 Quantitative expression of hypoxia probe signal intensity in each group (n=3, $\overline{\mathit{x}}$ ±s)

组别	心肌组织	肝组织	脑组织	肺组织
空白组	18.38±3.06	35.81±4.52	38.08±7.04	44.87±15.51
缺氧组	55.04±10.28*	91.91±16.99*	53.80±9.33*	62.80±13.70*
Hemin高剂量组	39.56±17.54†	89.44±3.78	33.89±9.91†	45.56±11.80†

与空白组比较，*P<0.05；与缺氧组比较，†P<0.05。

3. 讨 论

乙酰唑胺作为常用预防和治疗急性高原病的药物，虽有明显药效，但长期使用会产生不良反应或者耐药性，因此开发现有药物的其他药理作用十分重要。模拟高原低压氧舱8 000 m缺氧24 h建立BALB/c小鼠缺氧模型，阳性药有效剂量为200 mg/kg。本研究结果显示常压密闭实验Hemin低、中和高剂量对小鼠的存活时间都能显著延长，Hemin具有剂量依赖性，而且Hemin高剂量组超过了阳性药组常压密闭小鼠的存活时间，结合实验结果，后续研究选择高剂量进行实验。

本研究结果显示：在缺氧小鼠血浆中IL-6和TNF-α水平显著升高，Hemin高剂量组能够显著降低炎症因子水平。说明Hemin可能具有抗炎作用，其作用机制可能与调节血浆中炎症因子水平相关。核转录因子-κB信号通路的上游基因和下游基因的改变可以调控缺氧导致小鼠产生炎症反应。TNF-α是核转录因子-κB信号通路的上游基因，表达水平上调可激活该通路，进而使IL-6等炎症因子水平升高^[6-8]。但Hemin的具体抗炎作用机制还有必要进一步深入研究。

本研究结果表明：Hemin可以改善小鼠的心、肝、脑和肺组织的氧化应激，使其SOD活力增强，GSH含量升高，MDA含量降低，对脑组织和肺组织的保护作用较强，同时各组织HE染色切片中发现病理损伤程度有了明显改善。在缺氧条件下，机体肝、心、脑和肺组织细胞中的线粒体能量代谢异常，并且活性氧增加，导致氧化应激和细胞凋亡等，从而损伤机体组织^[9-12]。Hemin可防治自由基引起的损伤，降低兴奋性氨基酸毒性，对重要器官缺氧缺血性损伤具有保护作用。同时，Hemin与羟基脲联合应用能增强人脐静脉内皮细胞和人外周单个核细胞中SOD-1和谷胱甘肽还原酶(glutathione reductase，GSR)以及谷胱甘肽过氧化物酶1(glutathione peroxidase 1，GPX1)的活性^[13]。Hemin进入不同的组织中能够选择性地与不同受体、转录因子和酶相结合，从而改变组织细胞活化状态、基因转录和代谢。此外，Hemin可以与哺乳动物转录因子Bach1特异性结合并调节其活性^[14]；同时，Hemin也是核受体REV-erb α和β的生理配体，与细胞代谢相关^[15]。

通过免疫组织化学的方法定量或者定位缺氧，本研究结果显示Hemin可缓解小鼠机体各组织的缺氧程度，并且对脑组织的保护程度最高。脑组织缺氧可能会发生一系列疾病，甚至导致死亡，目前尚无针对脑组织缺氧的治疗药物。Hemin具有神经保护作用，可显著降低S100B的表达，从而减轻血脑屏障损伤。Hemin能够通过增加神经球蛋白的表达，减少新生大鼠神经元凋亡，改善线粒体动力学，对七氟醚诱导的认知功能缺损有保护作用。

综上，本研究结果表明Hemin对低氧所致的氧化应激、炎症反应有明显的改善作用，对缺氧所致的组织损伤有明显的保护作用。但Hemin是否可以老药新用作为保护缺氧脑组织的药物仍需进行更深入的研究。

基金资助

国家自然科学基金(82173738)；中国人民解放军联勤保障部队第九四〇医院科研计划项目(2021yxky005)；医学科技青年培育计划拔尖项目(20QNPY070)。

This work was supported by the National Natural Science Foundation (82173738), the Hospital Scientific Research Plan Project of the 940th Hospital of Joint Logistics Support Force of Chinese People’s Liberation Army (2021yxky005), and the Medical Science and Technology Youth Training Program Excellence Project (20QNPY070), China.

利益冲突声明

作者声称无任何利益冲突。

作者贡献

郭茜文 实验操作，论文撰写及修改；尹紫悦 论文修改；程俊飞、张晓静 实验协助；王荣、李文斌 实验设计及论文指导。所有作者阅读并同意最终的文本。

原文网址

http://xbyxb.csu.edu.cn/xbwk/fileup/PDF/2023101437.pdf