草酸钙结石形成过程中晶体-细胞相互作用的机制及影响因素

Abstract

Kidney stone is a disease with complex etiology and high incidence, and the most common chemical composition type of it is calcium oxalate stone. The formation of calcium oxalate stones includes crystal formation, crystal growth and aggregation, crystal interaction with renal tubular epithelial cells, and crystal invasion of renal interstitial extracellular matrix and so on. In these processes, crystal-cell interactions are essential for kidney crystal retention and kidney stone formation. Recently many studies have found that the interaction between crystal and renal tubular epithelial cells is closely related to various key binding molecules, endoplasmic reticulum stress of tubular cells, extracellular matrix proteins, and various lithotriptic drugs. Understanding the mechanism of crystal-cell interaction is of great significance for the prevention and early treatment of calcium oxalate stones.

肾结石是一种病因复杂、发病率较高的疾病，在医学飞速进展的今天，仍然是一个全球性的公共卫生问题，且发病率不断增加。健康人的肾脏会不断地形成晶体，但不会形成结石。结石形成有额外的机制来启动^[1]。肾结石是由无数的小晶体和有机物质黏合而成的。草酸钙是泌尿系结石中最常见的成分，约占80%，故对草酸钙结石的研究具有重要的临床意义^[2]。草酸钙结石的形成和大多数其他类型结石一样是通过结晶形成、晶体生长和聚集、晶体细胞附着(晶体-细胞相互作用的一般结果)，最后入侵肾间质细胞外基质来启动的^[3-7]。早在1978年，Finlayson等^[8]就提出晶体需要以某种固定形式在肾脏中积聚。这与对高草酸尿患者肾组织的组织学研究一致。在草酸钙肾结石形成早期，相对较小的草酸钙晶体会附着于肾小管上皮^[2]，两者相互作用，共同促进结石的形成。

1. 草酸钙晶体和肾小管上皮细胞之间相互 作用的关键结合分子

在晶体-细胞相互作用的动物实验中，Khan等^[2]最早提出尿路结石形成的两种主要机制，通常被描述为“自由粒子”(晶体在小管中形成兰德尔氏斑^[9])和“固定粒子”(结石在所谓的兰德尔氏斑^[10]上生长)。20世纪90年代初，Lieske等^[11]通过细胞研究，指出草酸钙晶体和肾小管上皮细胞之间的一些结合分子在结石形成中起关键作用。

1.1. 促进或抑制肾小管上皮细胞与草酸钙晶体结合的分子

对高草酸尿大鼠和肾结石患者的肾脏研究^[12]发现：在病理条件下肾小管上皮细胞过度表达与晶体有亲和力的细胞表面分子。这一结果启发研究人员去研究这些分子的本质。曼德尔集团研究了质膜磷脂在原代培养的大鼠内髓集合管(inner medullary late collecting duct，IMCD)细胞和连续培养的IMCD细胞中草酸钙晶体附着的可能作用^[13]；Bigelow等^[14]通过加入外源性磷脂脂质体(主要是磷脂酰丝氨酸)悬浮液或暴露于钙离子载体A23187来诱导IMCD细胞的膜脂组成改变。两种方法均证明磷脂脂质体在细胞表面的表达会明显增加肾小管上皮细胞与晶体的结合。An等^[15]研究证实一水草酸钙晶体附着在蛋白质和脂质双分子层的表面。

Lieske等^[16]探讨了骨桥蛋白在草酸钙晶体与野生型Madin-Darby犬肾(Madin-Darby canine kidney，MDCK)细胞结合中的作用，发现草酸钙晶体会刺激培养的肾小管上皮细胞的OPN基因表达和蛋白质分泌，但是将OPN添加到MDCK细胞会抑制晶体对于肾小管上皮细胞黏附和保留(OPN及相关产物在肾小管中特有，有利于在肾小管部位阻断草酸钙对肾小管上皮细胞的黏附)。OPN抗体、凝血酶、RGD多肽和束霉菌素(tunicamycin)可降低OPN在细胞表面的荧光强度，这些化合物可增强晶体-细胞的黏附^[16-18]。这些发现证实骨桥蛋白是一种晶体-细胞结合的抑制分子，而OPN抗体、凝血酶等则是潜在的晶体-细胞结合的细胞外基质分子。

Lieske等^[16]研究发现草酸钙晶体黏附于非洲绿猴肾上皮细胞BSC-1和野生型MDCK细胞。用带正电荷的化合物预孵育细胞后，晶体结合减少，表明晶体附着在带负电荷的细胞表面成分上^[19]。大多数细胞表面负电荷是由末端唾液酸残基引起的，通过研究唾液酸苷酶(神经氨酸苷酶)对晶体结合的作用，推测含唾液酸的细胞表面糖缀合物是肾脏细胞表面晶体结合的关键因素^[20]。除了唾液酸外，糖胺聚糖对细胞表面的整体负电荷也有较大的作用^[21]，糖胺聚糖如硫酸软骨素和硫酸肝素是细胞表面结合的糖缀合物(如蛋白聚糖和糖脂)的多糖侧链^[22]。这些分子均被认为是潜在的晶体结合分子。

1.2. 不同结合分子间的联系及作用

在晶体与肾小管上皮细胞的不同黏附分子中，细胞周围的透明质酸起关键作用，而不同的肾小管上皮细胞与晶体结合分子间也存在竞争或辅助等复杂关联^[23]。

1.2.1. 磷脂酰丝氨酸和透明质酸

Wesson等^[24]研究表明：在一些情况下，细胞表面对晶体结合的敏感性增强，钙离子载体A23187和磷脂脂质体悬浮液处理细胞时晶体结合度更高，前者增加细胞内的钙浓度，后者改变质膜的磷脂组成。磷脂酰丝氨酸参与了这两种机制。透明质酸的合成也依赖于钙依赖的信号转导，在不同类型的细胞中，A23187可以刺激透明质酸的合成^[25]。这些证据表明：在一定的条件下，磷脂可作为透明质酸的受体^[26]，并且这两种分子共同存在时将促进晶体-细胞间的黏附。

1.2.2. 唾液酸和透明质酸

唾液酸对于维持透明质酸包膜细胞的晶体结合能力至关重要^[27]。Verkoelen等^[28]发现细胞表面唾液酸有利于草酸钙晶体黏附于MDCK细胞上，而唾液酸经神经氨酸酶处理后草酸钙晶体结合显著减少；Verhulst等^[23]的研究也发现：经唾液酸酶处理后的细胞外基质会降低透明质酸与表达CD44的细胞的结合能力，以及引起晶体外壳的坍塌。

1.2.3. 细胞外基质分子和透明质酸

肾小管发育或伤口愈合过程通常发生于基底外侧膜的细胞外基质分子，如胶原蛋白、层粘连蛋白、纤维连接蛋白和骨桥蛋白^[29-30]，这些细胞外基质分子可能会暂时出现在肾小管管腔表面。细胞外基质分子与晶体有亲和力，且它们在细胞表面的表达通常伴随着富含透明质酸的肾小管上皮细胞表面被膜(这种被膜已被证实可增强晶体-细胞的黏附作用^[23])的存在，细胞外基质分子可能参与这些被膜的保留，从而辅助透明质酸在晶体-细胞中的作用^[30]。

2. 肾小管上皮细胞内质网应激对晶体-细胞相互作用的影响

肾小管上皮细胞内质网应激氧化机制对于晶体-细胞的相互作用有重要的影响^[31]。有关肾结石的蛋白质-蛋白质相互作用网络分析^[3]显示：这些蛋白质在内质网翻译后蛋白质修饰的过程中富集。体外研究表明：内质网应激标志物Bip和CHOP表达上调，蛋白激酶R样内质网激酶(protein kinase RNA-like ER kinase，PERK)和活化转录因子6(activating transcription factor 6，ATF6)被激活，XBP-1 mRNA被剪接^[32]，内质网可通过PERK-真核起始因子2α(eukaryotic initiation factor 2 subunit alpha，eIF2α)通路诱导过度自噬，而抑制过度自噬能减少肾小管晶体累积^[33]。另外，内质网应激特异性蛋白质caspase-12在一水草酸钙肾结石晶体诱导的凋亡细胞中被激活^[34]。而内质网应激诱导剂衣霉素促进了晶体细胞的黏附，降低了细胞活力，并下调参与晶体形成蛋白质的表达。使用内质网应激抑制剂治疗，可逆转衣霉素和草酸钙晶体的上述效果^[3]。这些结果均表明内质网应激和晶体-细胞相互作用密切相关。

2.1. 内质网应激有助于晶体的形成及沉积

为了解内质网应激对晶体-细胞相互作用的影响，Yang等^[4]用原子吸收法分析了经衣霉素处理的HK2细胞黏附晶体的钙浓度，结果表明：衣霉素和草酸钙诱导的内质网应激可影响骨桥蛋白和基质Gla蛋白(matrix Gla protein，MGP)等肾结石晶体相关蛋白质的表达，降低细胞活力，促进晶体的形成。由此可知，抑制内质网应激可以减少晶体的形成。动物实验研究^[35]发现：叶绿基甲萘醌抑制MGP的表达和功能，并减少细胞内晶体沉积，从而保护细胞。另外，在褪黑素抑制内质网应激和细胞凋亡的机制研究^[36]中发现：褪黑素对草酸诱导的内质网应激和细胞凋亡的保护作用部分依赖于AMP活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)激活的HK-2细胞，即细胞内质网应激时可通过AMPK通路激活HK-2细胞途径促进晶体的形成及沉积。

2.2. 内质网应激促进晶体-细胞的黏附

体内外研究^[37]发现：内质网应激标志物Bip/GRP78和CHOP在草酸钙暴露后表达增加，并伴随PERK、XBP1和ATF6内质网应激信号通路的激活。Yang等^[4]研究了内质网应激对晶体-细胞相互作用的影响，发现内质网应激导致细胞活力降低，影响与晶体形成相关的分泌蛋白质的表达，增加晶体-细胞黏附。而内质网应激抑制剂可以逆转细胞活力，减少晶体-细胞黏附^[38]。

3. 细胞外基质蛋白在草酸钙结晶与肾小管 上皮细胞黏附过程中的作用

细胞附着在细胞外基质中，细胞外基质包含多种黏附蛋白，这些黏附蛋白与细胞外基质内接触的细胞密切相关^[39]。在肾小管上皮细胞和草酸钙晶体相互作用的过程中，细胞外基质蛋白起重要作用^[40]，这些细胞外基质蛋白包括胶原蛋白I型、IV型和纤维连接蛋白等。Narula等^[41]在细胞外基质蛋白对氧化钙毒性的衰减研究中，使用扫描电子显微镜评估细胞-晶体相互作用的形态变化，证实细胞外基质蛋白对于细胞-晶体的相互作用有明显影响。

Kohri等^[42]通过免疫染色与抗IV型胶原蛋白抗体检查研究了含钙晶体和肾小管上皮细胞的相互作用，发现当肾小管上皮细胞和草酸钙晶体混合时会形成团块，含钙晶体被吸附在黏液腺和铸状材料上，而这些材料与抗IV型胶原蛋白抗体可相互作用，表明肾小管上皮细胞膜中的胶原蛋白可作为泌尿结石形成的基质。而Khan等^[43]在研究兰德尔斑块与胶原纤维和膜小泡的实验中发现：肾结石的晶体沉积始于膜囊泡诱导的核化，并通过在胶原蛋白框架中进一步添加外围晶体而生长，这初步验证了胶原纤维在晶体-细胞相互作用过程中的机制，也阐述了胶原纤维在肾结石形成中起关键作用。

纤维连接蛋白是一种细胞外基质蛋白，是细胞外基质的重要组成成分，广泛存在于细胞表面、细胞外液、结缔组织及各种实质器官基底膜上的大分子物质。研究^[44]发现纤维蛋白是肾结石基质中的关键蛋白质成分。纤维连接蛋白参与了肾结石特别是草酸钙肾结石的早期发展过程。Khamchun等^[45]发现纤维连接蛋白在草酸钙结晶、生长、聚集、肾小管上皮细胞黏附和细胞外基质侵袭的调节中都产生了重要作用，其证据包括序列分析显示纤维连接蛋白中有3个钙结合域和6个草酸结合域，免疫荧光研究证实了纤维连接蛋白与草酸钙晶体的结合。钙离子和草酸盐亲和力测定发现：在与纤维连接蛋白共同孵育后，钙离子和草酸盐离子均出现明显消耗。这些证据既表明纤维连接蛋白是草酸钙结晶形成、晶体生长和黏附肾小管上皮细胞的抑制剂，亦表明其可作为草酸钙晶体聚集和入侵细胞外基质的促进剂。

4. 各类排石药物对草酸钙结石的晶体-细胞相互作用的影响

随着对肾结石疾病研究的不断增多和认知的不断提升，国内外研发了不少促进排石及溶石的药物，这些药物对于肾结石疾病有不同程度的疗效。通常认为，结石长径<0.6 cm且位于肾内时考虑药物治疗，对于早期结石，药物治疗加上健康宣教的效果显著，这引发了很多学者对于排石药物在早期结石中作用机制的研究，并发现不同药物对草酸钙结石的晶体-细胞相互作用有不同影响。

4.1. 植物药对晶体-细胞相互作用的影响

近年有学者^[46]在“排石颗粒”的主药连钱草的体外实验及动物实验中发现：连钱草体外通过促进磷酸钙、草酸钙晶核形成，抑制草酸钙晶体生长、聚集以及抑制草酸钙晶体与肾小管上皮细胞之间的黏附，预防草酸钙结石形成。此外，曹迪等^[47]通过体外实验发现：石荠苧总黄酮可延长结晶形成的诱导时间，降低成核和聚集速率，降低结晶的密度，从而降低结晶与肾上皮细胞的亲和力，促进结晶随尿液排出。王涌泉等^[48]研究金钱草注射液和提取液对草酸钙肾结石模型大鼠的抑制作用，发现金钱草能抑制羟乙酸和乙醛酸向草酸的转化以减少草酸的形成，并减少肾小管上皮细胞在乙二醇诱石过程中的崩解、坏死及细胞向管腔内排出一些膜性小囊或电子致密小体(可促进晶体形成及聚集)，证明金钱草抑制草酸钙晶体形成和生长，保护肾小管上皮细胞。除以上3种植物药之外，还有多种中药对于草酸钙结石形成有明显抑制作用，这些药物的作用机制是否包括影响晶体-细胞相互作用还未知，但可以肯定的是，排石植物药能通过影响晶体-细胞的相互作用来达到排石目的。

4.2. 非植物药对晶体-细胞相互作用的影响

由于柠檬酸钙能够抑制草酸钙晶体的生长，柠檬酸盐在防止肾结石形成方面起重要作用。Grohe等^[49]采用微观和仿真技术相结合的方法研究了柠檬酸盐-草酸钙的相互作用，发现柠檬酸盐与草酸钙中的Ca²⁺表面的静电相互作用能减少草酸钙晶体在肾小管上皮细胞表面的黏附。Sutthimethakorn等^[50]研究高尿酸尿对细胞蛋白质组、细胞内ATP、组织修复能力和肾小管上皮细胞的草酸钙晶体结合能力的影响，发现高浓度尿酸能促进晶体-细胞的相互作用，从而促进草酸钙结石的形成。因此，降低尿酸的排石药物能对草酸钙结石产生积极疗效。此外，一些体内外实验^[51-53]证明：酒石酸钾、羟基柠檬酸、苄丙酮香豆素等药物可通过抑制草酸钙晶体的形成及聚集来抑制草酸钙结石的形成。这些药物是否对晶体-细胞的相互作用有影响尚待进一步研究。

5. 结 语

肾结石的形成是一个复杂的过程，草酸钙结石是最常见的肾结石类型。肾结石的形成关键取决于晶体在肾中的保留^[27]。而晶体在肾中的保留离不开晶体-细胞的相互作用。草酸钙晶体是通过晶体-细胞黏附的关键结合分子、肾内质网应激、细胞外基质蛋白等，与肾小管上皮细胞之间产生相互作用，最终使草酸钙晶体在肾中得以保留、蓄积并形成肾结石，而一些排石药物能通过影响晶体-细胞的相互作用来治疗草酸钙结石，这在许多细胞实验和动物实验中得到了证实。了解这些机制在预防草酸钙肾结石形成及结石早期治疗中有重要意义，特别对于伴随钙代谢异常、髓质海绵肾^[54]等容易导致肾结石复发的患者。这些研究有助于预防肾结石的发生、复发，然而受伦理道德等方面的限制，人体研究存在局限性，针对这些机制作出的预防结石形成的研究成果有限。未来可通过模拟人体病理生理环境来研究晶体-细胞的相互作用，进一步探索肾结石形成的机制。

基金资助

湖南省自然科学基金(2020JJ4848)。

This work was supported by the Natural Science Foundation of Hunan Province, China (2020JJ4848).

利益冲突声明

作者声称无任何利益冲突。

作者贡献

邓志军 构思和起草文章，查阅、分析文献；谭靖 构思及修改文章，对文章的文字表达及知识性内容作批评性审阅；张锐、曾嘉、尹光明、蒋先镇 对文章的文字表达及知识性内容作批评性审阅。所有作者阅读并同意最终的文本。

原文网址

http://xbyxb.csu.edu.cn/xbwk/fileup/PDF/202205555.pdf