近红外荧光显影技术在口腔癌诊疗中的应用进展

Abstract

The preliminary screening of oral cancer mostly depends on the experience of clinicians, The surgical margin of tumor is mostly based on physical examination and preoperative imaging examination. It lacks real-time and objective intraoperative evaluation methods. Indocyanine green (ICG), as a safe and pollution-free organic fluorescent pigments, combined with near-infrared fluorescence imaging can be applied in the screening of early oral cancer, the determination of tumor resection margins, sentinel lymph node biopsy, cervical lymph node dissection, targeted chemotherapy, and other aspects. Near-infrared fluorescence imaging may become a key link in the early diagnosis and accurate treatment for oral cancer in the future.

口腔癌是全球六大常见恶性肿瘤之一^[1-2]，具有侵袭性强的生物学特性，易转移和复发，其诊治现状不容乐观。口腔癌的早期发现、及时诊断和精准治疗已经成为口腔颌面外科和头颈外科医生的共识。目前活体组织检查(以下简称活检)是诊断口腔癌的金标准；但是初步筛查口腔癌高危人群多依赖临床医生的临床经验，术中病灶切缘的确定多以体格检查及相关影像学检查为参考依据，缺乏实时且客观的评估方法。近红外荧光显影技术是一种新兴的辅助显影技术，具有非侵入性、分析速度快、无化学污染、仪器操作简单、测量准确度高、分析成本低等优点^[3-6]。近红外荧光显影技术在口腔癌的早期筛查和辅助治疗方面有很好的临床应用前景。本文主要以吲哚菁绿(indocyanine green，ICG)为例介绍近红外荧光显影技术的发展历程、应用进展、优势、不足以及未来的研究方向。

1. ICG与近红外荧光显影技术

1800年，Herschel在进行太阳光谱可见区的红外能量测量中发现近红外光谱区。近红外线是介于可见光与中红外光之间的电磁辐射波(700~2 526 nm)，是人们在吸收光谱中所发现的第1个非可见光区，根据其波长范围又可分为短波近红外光谱区域(700~1 100 nm)和长波近红外光谱区域(1 101~2 500 nm)^[7]。限于当时技术和设备的欠缺，该技术未得到重视和发展。直到20世纪新的近红外仪器不断涌现，近红外荧光显影技术才得到飞速发展，目前已广泛应用于化工、农业、医药及环境等领域^[8]。近红外荧光显影技术所使用的荧光染料根据性质可分为无机材料(贵金属、半导体量子点等)和有机材料(菁类、BODIPY类、罗丹明类、方酸类、卟啉类等)，根据其特异性又可以分为非特异探针、靶向探针和智能探针。

ICG是目前医学领域应用最广的有机近红外荧光材料之一，它的光谱吸收高峰约为800 nm，属于短波近红外光谱区域，是一种带负电、两亲性的荧光物质，可以与血浆蛋白相结合形成纳米粒子^[9]。它可以通过肿瘤的高渗透长滞留效应在肿瘤组织中积聚，或者通过与肿瘤靶向分子[如基质细胞衍生因子-1(stromal derived factor-1]结合进而靶向肿瘤细胞^[10]。在近红外荧光的显影下，IGC所结合的组织可与周围组织准确区分。目前ICG近红外荧光显影技术已用于血管显影、淋巴结显影、肿瘤显影以及靶向荧光探针等多方面，其临床应用涉及心内科、皮瓣外科、乳腺外科、肝胆外科及泌尿外科等多个学科^[11]。

2. 近红外荧光显影技术在口腔癌中的临床应用

目前ICG近红外荧光显影技术已应用于口腔癌的多个方面，尤其是早期口腔癌的筛查、肿瘤切缘的确定、前哨淋巴结的活检、颈部淋巴结的清扫以及靶向化学药物治疗(以下简称靶向化疗)5个方面。

2.1. 早期口腔癌及癌前病变的初步筛查

世界卫生组织(WHO)将早期诊断和预防作为口腔癌防治的主要目标。社会经济因素、公众意识不足以及初级卫生保健中心的漏诊是影响患者发病率和病死率的主要因素。对有高危因素(吸烟、酗酒、嚼槟榔、HPV阳性等)的人群进行常规口腔癌筛查可以有效降低患者的病死率。在临床工作中，医生根据患者的临床表现(口腔出血、疼痛、溃疡等症状)、相关病史(烟、酒、槟榔等不良嗜好，HPV感染，反复口腔溃疡史，不良口腔卫生习惯等)及体格检查(肿块、黏膜白斑、红斑、纤维化、张口度等)结果筛查高危人群，然后选择可疑患者进行活检。然而即使对于经验丰富的专业人员，使用常规方法进行口腔癌的早期诊断仍极具挑战性，因而寻找一种客观且适合大范围筛选的廉价检查方法具有重要意义。

传统的口腔癌辅助成像技术包括计算机断层扫描术(CT)、磁共振(MRI)和彩色超声波检查等。CT和MRI昂贵且特异性较低，而彩色超声波检查通常仅用于评估口腔癌的淋巴结转移情况，一般不用于原发灶的检测，因此三者皆不宜作为早期口腔癌的筛查手段。荧光成像是一种具有高分辨率和灵敏度的实时成像技术，可能更适用于口腔癌的筛查工作。目前用于口腔癌诊断实验的近红外荧光可分为内源性荧光和外源性荧光^[12]。其中内源性荧光又称自体荧光，其原理是相对于正常组织病变组织的荧光值缺失或增加，但此方法只能区分病变组织和正常组织，并不能将肿瘤组织与其他病变(如炎性组织)区分开来^[13]。外源性荧光又分为非靶向性和靶向性荧光。目前报道较多的非靶向性荧光有ICG和血卟啉单甲醚(hematoporphyrin monomethyl ether，HMME)等。张现军等^[14]研究证实HMME介导的荧光光谱法在早期口腔癌诊断中具有极高的效能，该方法用两种参数判断早期口腔癌的受试者工作特征曲线下面积分别为0.979和0.976。在肿瘤细胞或肿瘤微环境中会过度表达某些抗原和代谢产物，外源性靶向荧光材料可通过与特定抗体结合，进而靶向肿瘤部位并富集，从而在近红外仪器上成像。如使用ICG标记的抗Podoplanin抗体和手持式检测设备进行近红外显影，可以对口腔癌病灶进行半定量分析和实时成像^[15]。Pogue等^[16]将小麦胚芽凝集素与异硫氰酸荧光素耦联物(wheat germ agglutinin FITC conjugate，WGA-FITC)结合，研发出靶向癌细胞糖基化改变的局部成像药物。在一项纳入64个癌症样本的临床研究^[16]中，利用WGA-FITC可将癌症细胞全部检测出来，其灵敏度为100%，特异度为84%。然而，目前这些研究的样本量过小，其特异度有待进一步提高。此外，因纳米材料的制备需要足够的技术和资金支持，故目前很难在筛查工作中广泛开展^[17]。

2.2. 肿瘤安全切缘的确定

随着精准治疗外科时代的到来，外科医生应在保证彻底切除肿瘤的同时进行口腔功能的保留或修复。中国临床肿瘤学会的指南^[18]建议口腔癌手术应至少保证5 mm的安全切缘。目前外科医生对于安全切缘的确定通常依赖于手术前的临床检查(视觉和触觉)和医学影像评估，以“四点法＋基底”或“八点法＋基底”等方法切除肿瘤组织进行快速病理切片检查，此方法耗时长，准确性较差。尽管采取众多措施切除肿瘤，但口腔癌仍有6%~40%的局部复发率^[19]。

改良术中肿瘤切缘的实时评估技术是降低口腔癌局部复发率的直接手段。研究人员以近红外荧光技术为基础设计出不同评估口腔癌切缘的方法。Brouwer de Koning等^[20]利用近红外漫反射光谱直接照射舌癌标本，可根据肌肉和肿瘤组织的不同成像像素将两者准确区分，但此方法对于浸润较深的口腔癌的显像能力欠佳。van Keulen等^[21]将新型荧光标记抗体(panitumumab-IRDye800)应用于口腔癌的切缘(距肿块<5 mm)检测，结果表明此抗体检测肿瘤边缘具有95%的灵敏度和89%的特异度。Wang等^[22]评估了不同剂量(0.50、0.75和1.00 mg/kg)ICG在不同时间点(1、6和24 h)的荧光成像质量，结果表明0.75 mg/kg为最佳剂量，术后6 h为最佳手术时间。近红外荧光显影技术确定口腔癌安全切缘的精确度仍需进一步研究。

2.3. 前哨淋巴结活检术

对于早期口腔癌患者是否需要进行颈部淋巴结清扫的问题仍有很大争议。为了在降低漏诊率的同时减少过度治疗，中国临床肿瘤学会的指南^[18]推荐对于部分早期口腔癌(cT_1-2N₀M₀)患者可以行前哨淋巴结活检术，然后根据前哨淋巴结的快速病理结果决定手术方案。目前用于口腔癌前哨淋巴结定位的方法主要有CT和PET/CT、彩色超声波检查、放射性同位素、纳米碳、亚甲蓝、ICG等。其中影像学检查一般用于术前评估，放射性同位素具有辐射性且需要放射科技术人员的协助，寻找一种成本低、耗时短且安全性高的术中实时检测手段已迫在眉睫。

经近红外荧光导航的肿瘤手术操作简便且效应时间短，已逐渐成为提高外科手术准确性的有效方法。在术中需要进行前哨淋巴结荧光造影时，首先需要行颈部切口，翻开颈阔肌皮瓣，然后将一定浓度的ICG溶液在肿瘤周围进行多点注射，约5 min后可于荧光造影仪器上观察到显影淋巴结。目前的研究证明ICG在口腔癌前哨淋巴结活检中的灵敏度和特异度较高^[23-24]，但灵敏度却说法不一，高达100%^[24]，低至50%^[23]。在一项来自日本的II期多中心前瞻性研究^[25]中，18名早期口腔癌患者依据ICG引导下的前哨淋巴结活检术，有选择性地进行了颈部淋巴结清扫术，其5年总生存率为83.3%，5年无病生存率为76.7%。未来可通过优化ICG荧光显影的操作流程、浓度及剂量等方法进一步提升此技术的灵敏度。有研究指出可以通过ICG与亚甲蓝、ICG与放射性同位素^[26]、ICG与薄层CT^[27]联合的方法来提高此技术的灵敏度。目前前哨淋巴结活检术在乳腺癌中的应用效果已得到临床肯定，然而对于口腔癌的前哨淋巴结活检仍需循证医学验证，相关指南也仅推荐此法在有经验的机构施行^[28]。此外，口腔癌淋巴结引流规律性较差，其前哨淋巴结可能出现在I区或II区，甚至出现跳跃性转移或对侧转移。如果通过扩大颈部伤口来寻找显影淋巴结，则增加了手术创伤；如不扩大伤口，则可能造成检测结果的假阴性^[29]。尽管如此，近红外荧光显影技术仍为口腔癌前哨淋巴结活检术的推广提供了可能。

2.4. 术中颈部淋巴结的清扫

颈部淋巴结转移是口腔癌患者的独立预后因子，因此，临床对原发灶分期偏晚或颈部淋巴结已有转移表现的患者实行颈部淋巴结清扫已达成共识。颈部淋巴结清扫术的成功取决于区域淋巴结的彻底清扫和术后并发症的预防。在手术中，隐匿于肌肉间隙和血管后方的小淋巴结往往难以切除，而过于彻底的清扫会导致并发症乳糜漏、出血、感染副神经损伤等的发生率增加。

近红外荧光引导技术是一种基于注射ICG等荧光物质的术中实时成像技术，用于协助外科医生的手术操作，如淋巴结清扫的导航和术后并发症的预防，目前该技术已应用于甲状腺癌、胃癌和口腔癌等的淋巴结清扫术中^[30-31]。Christensen等^[32]在术中采用ICG近红外荧光显影技术指导颈部淋巴结清扫手术，所切取的淋巴结数量明显高于未采用此技术的对照组。然而，此技术所带来的生存获益尚未得知，有待进一步研究。Chan等^[33]在颈部淋巴结清扫结束后，先在肿瘤周围的4个象限处注射0.25 mL的ICG溶液(2.5 mg/mL)用于寻找Ib~III区的淋巴管漏口，在胸导管的两侧分别注射1.0 mL的ICG溶液(2.5 mg/mL)用于寻找IV~V区的淋巴管漏口，然后对于出现淋巴管漏的部位进行预防性的结扎或用生物胶封闭，以减少术后乳糜漏的发生。尽管针对近红外荧光技术在口腔癌淋巴结清扫的临床研究尚不多见，但该技术该技术仍为口腔癌的彻底切除和减少并发症提供了新的技术手段。

2.5. 协同或辅助化疗药物进行精准治疗

精准治疗不仅体现在肿瘤外科领域，也体现于肿瘤放射治疗和化学治疗领域。以往行化疗时，通常会静脉注射足量的化疗药物以保证肿瘤区域的有效药物浓度，在减灭肿瘤细胞的同时也会带来严重的不良反应。在肿瘤部位进行局部特异性纳米药物输送/释放是降低化疗不良反应的有效方法，此技术已应用于肝癌^[34]、乳腺癌^[35]、肺癌^[36]和脑胶质瘤^[37]中。目前随着纳米药物的兴起，近红外荧光染料在口腔癌中的应用也逐渐增多，以下列举近红外荧光显影技术在口腔癌化疗中的3种用途。

1)利用近红外荧光染料的光动力和光热效应，联合特定化疗药物进行靶向化疗^[38-40]。ICG在近红外激光诱导下活性氧量子产率高，同时具有光动力效应和光热效应，因此可用于肿瘤的光动力治疗和辅助型光热治疗。Xiong等^[40]构建出一种内含ICG、阿霉素和外接SDF-1抗体的纳米药物。他们先利用SDF-1及其特异性受体CXCR4(stromal derived factor receptor 4，CXCR4 )相互作用使纳米药物在肿瘤区域富集，然后使用近红外荧光照射让光热材料迅速加热，产生的热量可以增加细胞的新陈代谢和膜通透性，从而增加肿瘤细胞对纳米材料的吸收，最后释放阿霉素杀死肿瘤细胞。Wang等^[38]构建了一种人血清白蛋白-吲哚菁绿-顺铂(HSA-ICG-DDP NPs)纳米粒子。他们利用富含半胱氨酸的分泌型酸性蛋白(SPARC)所介导的内吞作用增强肿瘤细胞和成纤维细胞对HSA-ICG-DDP NPs的摄取，然后通过近红外光诱导的ICG光热效应来裂解ICG-DDP的配位键，从而精准地在肿瘤部位释放顺铂(DDP)。实验证明这些纳米材料都具有较好的抗肿瘤效果和生物相容性，具有一定的临床应用前景。

2)将近红外荧光染料作为一种靶向荧光探针，用于检测特定靶向药物的靶向性和治疗效果^[41-42]。Zhu等^[41]利用低毒性硒化银的近红外荧光现象，将硒化银-西妥昔单抗纳米探针通过尾静脉注射到有舌癌的裸鼠中，结果显示该组裸鼠的舌癌组织与周围正常组织之间有明显的荧光对比度，且在舌癌组织中的显像时间更长，说明此纳米探针可特异性聚集于舌癌部位。该技术可用于评估药物的生物分布和肿瘤部位的蓄积浓度，便于实时监测治疗效果及制订个性化的治疗方案。

3)近红外荧光显像技术可在动脉内化疗期间进行肿瘤原发灶的血管评估^[43]。部分晚期口腔癌患者对全身化疗可能出现耐药，动脉内化疗可以增加肿瘤的化疗药物浓度。计算机体层血管成像(computed tomography angiography，CTA)是评估肿瘤营养血管的首选方法。但是对于装有金属牙、钛板、钛钉的患者，CTA的成像效果欠佳，而ICG荧光成像可弥补CTA的不足，两者互相结合可提供更为准确的评估结果。

3. 结 语

口腔癌的发病率逐年上升，其病死率与延迟诊断、治疗水平密切相关。ICG近红外荧光成像技术作为一种新型的辅助治疗方式，具有非侵入性、荧光可视化、高分辨率、廉价、高安全系数和快速的优点，可应用于口腔癌诊疗过程中的各个方面。此技术可以协助早期口腔癌的人群筛查；可对确诊为早期口腔癌(cT_1-2N₀M₀)的患者施行前哨淋巴结定位术，既有助于降低隐匿淋巴结漏诊率又可减少过度治疗；可辅助外科医生在术中快速、准确地确定肿瘤切缘；可指导外科医生进行相对彻底的颈部淋巴结清扫术，避免并发症(乳糜漏)的发生；还可利用其光热或光动力效应协同或辅助化疗药物进行精准治疗。

尽管目前大多数的实验仍处于细胞水平或动物水平，但是研究表明ICG近红外荧光显像技术具有潜在的临床应用前景，值得深入研究。笔者相信随着科技的不断发展，此技术将会广泛应用于口腔癌的临床诊疗过程中。

基金资助

湖南省科技厅重点研发计划(2018SK2120)；湖南省卫生健康委员会科研课题(B2019092)。

This work was supported by the Key Research and Development Plan of Science and Technology Department of Hunan Province (2018SK2120) and the Scientific Research Project of Hunan Provincial Health Commission (B2019092), China.

利益冲突声明

作者声称无任何利益冲突。

原文网址

http://xbyxb.csu.edu.cn/xbwk/fileup/PDF/202103316.pdf