自噬在草酸诱导人肾小管上皮细胞损伤中的作用

Abstract

Objective

To investigate the role of autophagy in oxalate-induced toxicity of human proximal renal tubular epithelial cell (HK-2).

Methods

HK-2 cells were exposed to oxalate (1 mmol/L) for 2 h and 3-methyladenine (3-MA) was used to inhibit autophagy. Then Western blotting was used to measure the expression of autophagy-related protein LC3II. Cell viability and cell apoptosis were measured by MTT assay and flow cytometry assay, respectively.

Results

Cytoplasmic vacuolization was observed in HK-2 cells after treating with oxalate for 2 h. However, 3-MA showed no effects on the formation of cytoplasmic vacuolization regardless of the dose at 1 or 5 mmol/L. The expression of LC3II protein was significantly increased in the HK-2 cells in the presence of oxalate (0.62±0.03 vs 0.35±0.02, P<0.05). The expression of LC3II protein in HK-2 cells was downregulated by 3-MA at both 1 and 5 mmol/L compared with the blank control (0.17±0.03 vs 0.35±0.02, 0.16±0.03 vs 0.35±0.02, both P<0.05). Oxalate-induced upregulation of LC3II was reversed by 3-MA only at the concentration of 5 mmol/L (0.47±0.04 vs 0.62±0.03, P<0.05) rather than 1 mmol/L (0.61±0.04 vs 0.62±0.03, P>0.05). Oxalate attenuated viability [(77.32±2.69)% vs 100%, P<0.05] and increased the apoptosis [(8.32±1.05)% vs (2.36±0.29)%, P<0.05] in HK-2 cells, and these effects were reversed by 3-MA only at the concentration of 5 mmol/L [(91.91±3.36)% vs (77.32±2.69)%, (3.45±0.21)% vs (8.32±1.05)%, respectively, both P<0.05] rather than 1 mmol/L [(80.48±3.41)% vs (77.32±2.69)%, (7.81±0.47)% vs (8.32±1.05)%, both P>0.05, respectively].

Conclusion

Autophagy of HK-2 cells is enhanced by oxalate at the concentration of 1 mmol/L. Inhibition of 3-MA-induced autophagy protects HK-2 cells from the oxalate-induced cytotoxicity.

肾小管上皮细胞损伤在草酸钙结石的形成过程中扮有重要角色^[1]。肾小管上皮细胞损伤后，细胞表面微绒毛结构出现破坏及功能丧失，细胞膜上透明质酸(hyaluronic acid，HA)和骨桥蛋白(osteopontin，OPN)等蛋白质异常表达，均增强了结石晶体对肾小管细胞膜的黏附性^[2]。草酸是草酸钙结石的主要成分，对人肾近曲小管上皮细胞HK-2具有损伤作用^[3-4]。因此深入研究草酸诱导肾小管损伤的保护机制，对预防草酸钙结石的形成有重要意义。近年来自噬(autophagy)在肾损伤中的作用受到学者的广泛关注，主要涉及药物毒性、缺血再灌注、脓毒血症等所致的急性肾损伤(acute kidney injury，AKI)以及糖尿病肾病、梗阻性肾病等所致的慢性肾脏病(chronic kidney disease，CKD)两大方面^[5-8]。自噬是否参与草酸致肾小管损伤的过程尚不清楚。本研究拟建立草酸致肾小管损伤模型，使用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)干预，初步探讨草酸对HK-2细胞自噬水平的影响，以及自噬在草酸诱导人肾小管上皮细胞损伤中的作用。

1. 材料与方法

1.1. 主要试剂和仪器

草酸购自美国Sigma公司，3-MA购自美国Selleckchem公司，LC3II抗体购自美国Proteintech公司，免疫组织化学试剂盒购自湖南艾佳生物有限公司。多功能酶标仪为美国Thermo公司产品，流式细胞仪为美国BD Pharmingen公司产品。

1.2. 细胞培养及分组

HK-2细胞株(人肾近曲小管上皮细胞)购自中国科学院细胞库。将HK-2细胞接种至装有无血清培养基K-SFM的培养瓶内，置于37 ℃，5% CO₂培养箱中培养。HK-2细胞生长至约80%融合状态时，按1꞉3比例进行细胞传代培养。取对数生长期的细胞进行实验。

选择1 mmol/L草酸干预HK-2细胞2 h建立细胞损伤模型，再分别予以1和5 mmol/L 3-MA处理细胞，同时设置对照组。分组如下：1)空白对照(Con)组；2)Con+3-MA (1 mmol/L)组；3)Con+3-MA (5 mmol/L)组；4)草酸(1 mmol/L)组；5)草酸+3-MA (1 mmol/L)组；6)草酸+3-MA (5 mmol/L)组。各组均置于37 ℃，5% CO₂培养箱中培养2 h。

1.3. 方法

1.3.1. 观察细胞的形态学改变

将贴壁生长的HK-2细胞用胰酶消化并制成细胞悬液，取2滴滴于载玻片上培养，待细胞贴壁生长后，按实验分组处理，再依次经PBS洗涤，95%乙醇固定，苏木精染色，伊红染色，脱水，封片，在显微镜下观察HK-2细胞的形态学改变。

1.3.2. 蛋白质印迹法检测LC3II蛋白

细胞按实验分组处理后，每组加入RIPA裂解液提取蛋白质，定量后上样(每孔40 μg)电泳，转膜，孵育抗体，曝光。扫描胶片图像，使用IPP6.0 图像分析软件分析图像灰度。

1.3.3. MTT法检测细胞存活率

取对数生长期生长状态良好的HK-2细胞接种于96孔板上，按实验分组处理后，每孔避光加入5 mg/mL的MTT溶液20 μL，继续孵育4 h。弃去培养液和药液，每孔加入二甲基亚砜150 μL，于微量振荡器上水平缓慢振荡1 min，待充分结晶沉淀后，用酶联检测仪检测波长570 nm处的吸光度(OD)值，并计算相对存活率(存活率=实验组OD值/对照组OD值×100%)。

1.3.4. 流式细胞术检测细胞凋亡

按实验分组处理后，用不含EDTA的胰蛋白酶消化液消化各组细胞，并置于EP管中以1 000 r/min离心5 min，收集细胞并重悬，先后加入Annexin V-FITC和碘化丙啶混匀，在室温、避光环境中充分反应10~15 min，1 h内通过流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。

1.4. 统计学处理

采用SPSS 18.0统计软件进行分析，计量资料以均数±标准差( $\overline{x}$ ±s)表示，在进行正态分布和方差齐性检验后，采用单因素方差分析(one-way ANOVA)处理符合正态分布且方差齐性的计量资料，多个样本之间的两两比较采用LSD-t检验。检验水准α=0.05，以P<0.05为差异有统计学意义。

2. 结 果

2.1. HK-2细胞形态学变化

在光学显微镜(×100)下观察到：1和5 mmol/L 3-MA处理后细胞无空泡化现象出现，而草酸组、草酸+3-MA (1 mmol/L)组及草酸+3-MA (5 mmol/L)组HK-2细胞质内均出现空泡化现象，且3组细胞空泡化程度无明显差异(图1)。

图1.

光学显微镜下HK-2细胞的形态学变化(HE，×100)

Figure 1 Morphological changes of HK-2 cells under optical microscope (HE, ×100)

A number of vacuoles form in the cytoplasm of cells (arrows) which were exposed to oxalate for 2 h.

2.2. HK-2细胞LC3II表达的改变

与Con组比较，3-MA(1和5 mmol/L)可下调HK-2细胞LC3II蛋白表达水平(分别P=0.0009，P=0.0007)，1 mmol/L草酸明显上调细胞LC3II蛋白的表达水平(P=0.0003)。与1 mmol/L草酸组比较，草酸+3-MA(1 mmol/L)组对细胞LC3II蛋白的表达水平无明显影响(P=0.8364)，而草酸+3-MA (5 mmol/L)组明显下调草酸诱导的细胞LC3II蛋白的表达水平(P=0.0062，图2)。

图2.

各组LC3II蛋白的表达

Figure 2 Expression of LC3II protein among different groups

A: Results of Western blotting; B: Histograrn of relative expression of LC3II protein in each group; *P<0.05 vs the Con group, †P<0.05 vs the oxalate group.

2.3. 自噬抑制对草酸致HK-2细胞损伤的影响

2.3.1. 细胞凋亡率

与Con组相比，Con+3-MA (1 mmol/L)和Con+3-MA (5 mmol/L)组细胞凋亡率差异无统计学意义(分别P=0.0675，P=0.1201)，草酸组细胞凋亡率明显上调(P=0.0007)。

与草酸组相比，草酸+3-MA (1 mmol/L)组细胞凋亡率差异无统计学意义(P=0.4848)，而草酸+3-MA (5 mmol/L)组细胞凋亡率明显下降(P=0.0014，图3)。

图3.

流式细胞术检测各组HK-2细胞凋亡率

Figure 3 Flow cytometry analysis was performed to assess apoptosis of HK-2 cells in each group

A: Results of flow cytometry. The total number of apoptosis of HK-2 cells in each group are the sum of early apoptotic cells (Q3) and late apoptotic cells (Q2). B: Histograrn of percentage of apoptotic cells in each group; *P<0.05 vs the Con group, †P<0.05 vs the oxalate group.

2.3.2. 细胞存活率

与Con组相比，Con+3-MA(1 mmol/L)及Con+3-MA (5 mmol/L)组HK-2细胞悬液OD值差异均无统计学意义(分别P=0.1449，P=0.1021)，草酸组细胞悬液OD值明显下降(P<0.05)。

与草酸组相比，草酸+3-MA (1 mmol/L)组细胞悬液OD值差异无统计学意义(P=0.1422)，而草酸+3-MA (5 mmol/L)组细胞悬液OD值明显上调(P<0.05，表1)。

表1.

各组HK-2细胞的OD值及细胞存活率

Table 1 OD values and cell survival rates of HK-2 cells among different groups (n=5, $\overline{\mathit{x}}$ ±s)

组别	D(570 nm)	相对存活率/%
Con组	0.440±0.011	100
Con+3-MA (1 mmol/L)组	0.436±0.009	98.51±2.06
Con+3-MA (5 mmol/L)组	0.431±0.014	97.38±3.18
草酸组	0.342±0.012*	77.32±2.69*
草酸+3-MA (1 mmol/L)组	0.356±0.015	80.48±3.41
草酸+3-MA (5 mmol/L)组	0.407±0.015†	91.91±3.36†

与Con组比较，*P<0.05；与草酸组比较，†P<0.05。

n=5， $\overline{\mathit{x}}$ ±s

3. 讨 论

草酸可以对肾小管上皮细胞造成损伤，而损伤的肾小管上皮细胞又为草酸钙晶体成核提供了有利条件^[1]，促进了草酸钙盐的沉积及泌尿系结石的发生。目前已有部分实验^[9-12]研究了一些分子、药物在草酸致肾小管上皮细胞损伤中的保护机制，但较少涉及自噬在其中的作用。本实验探讨了自噬在草酸诱导肾小管上皮细胞损伤中的作用，表明草酸可上调HK-2细胞自噬水平并对HK-2细胞造成损伤，而抑制自噬可减轻草酸对HK-2细胞的损伤，对HK-2细胞有保护作用。

细胞自噬是一种可以降解真核细胞内老化的蛋白质及损伤的细胞器以维持细胞内稳态的高度保守的调控机制。在饥饿、营养缺乏、组织缺血、氧化应激、药物、化学化工有毒物质等刺激的病理状态下，细胞可以在相对较短的时间内完成自噬体的诱导、形成，并通过自噬体与溶酶体结合，降解细胞内正常的蛋白质来维持细胞新陈代谢所必需的营养物质的供给。在介导哺乳动物细胞自噬发生的多个自噬相关基因中，LC3(Atg8同源基因)起关键作用^[13]，且LC3蛋白是目前Atg8同源蛋白中研究较为透彻的一个蛋白质^[14]。LC3蛋白包括细胞质型(LC3I)和膜型(LC3II)。当自噬激活时，LC3I将与自噬体膜上的磷脂以酰胺键结合形成LC3II^[15]。研究^[16]发现：在缺乏LC3II的情况下，细胞在自噬发生后将不能形成完整的自噬体结构，因此LC3II被认为是哺乳动物细胞自噬发生的标志蛋白质，且其表达量与细胞自噬水平存在正相关。本研究发现：LC3II/β-actin在 1 mmol/L草酸刺激HK-2细胞后明显上升，而细胞存活率明显下降，细胞凋亡明显增加，提示自噬可能参与了草酸诱导的人肾小管上皮细胞损伤。

3-MA可通过选择性抑制class III PI3K阻止自噬的激活^[17]。当自噬激活受到抑制后，细胞内LC3I无法向LC3II转变。在本实验中，5 mmol/L 3-MA较1mmol/L 3-MA能更有效地抑制草酸诱导HK-2细胞的自噬水平。当自噬水平受到抑制后，细胞存活率明显上升，细胞凋亡率明显下降，说明草酸诱导的细胞自噬促进了细胞的损伤与凋亡，而自噬抑制减轻了细胞的损伤与凋亡，具有保护作用。

此外，本研究通过光学显微镜观察HK-2细胞形态学，发现草酸组及草酸组分别加入1或5 mmol/L 3-MA时均可观察到HK-2细胞内空泡化现象无明显差异。细胞空泡化是细胞在受到外界病原体侵袭、接受化学物质或其他生物活性物质刺激时，为了适应环境而发生的一种形态学改变。细胞空泡化是一种明显且较常见的现象^[18]，并非自噬直接诱导的^[19]，而是与细胞应激反应关系密切^[18]。在本实验中，单用 1或5 mmol/L 3-MA处理细胞并无空泡化现象出现，说明HK-2细胞的空泡化现象可能是由草酸诱导，并与细胞自噬同时发生的一种现象，且可能与自噬水平的改变无明显关系。

综上所述，本实验验证了草酸对HK-2细胞自噬水平的影响，以及抑制自噬对草酸诱导肾小管上皮细胞损伤的保护作用。但草酸对细胞自噬的调控机制，以及自噬影响草酸诱导肾小管上皮细胞损伤、凋亡的调控机制等均有待进一步研究。

基金资助

湖南省卫生计生委科研计划(20180895)。

This work was supported by the Scientific Research Project of Hunan Health and Family Planning Commission of China (20180895).

利益冲突声明

作者声称无任何利益冲突。

原文网址

http://xbyxb.csu.edu.cn/xbwk/fileup/PDF/202103221.pdf