麻醉药物对新西兰兔钟基因Clock和Bmal1表达的影响

Abstract

Objective

To evaluate the effect of anesthetic drugs on the expression of circadian gene Clock and Bmal1 in the brain of New Zealand rabbits, and to explore their change pattern.

Methods

A total of 90 New Zealand rabbits were randomly divided into 5 groups (n=18 in each group): A normal saline group (1 mL/h saline, group S), a propofol group [600 µg/(kg·min^-1) propofol, 1 mL/h, group P], a 10% lipid group (1 mL/h lipid, group F), a dexmedetomidine group [1 µg/(kg·min^-1) dexmedetomidine, 1 mL/h, group D), a sevoflurane (SEV) group (2.5% SEV, SEV group). Inhaled and intravenous anesthetic drugs were stopped after 24 h. Experimental animals were killed at 0, 24, and 72 h after anesthesia, and their brain tissues were isolated. Western blotting was performed to measure the Clock and Bmal1 protein expression in the brain of rabbits.

Results

At 0 and 24 h after anesthesia, compared with the group S, the levels of Clock and Bmal1 proteins were decreased significantly in the group P, the group D, and the group SEV (all P<0.05). At 72 h after anesthesia, compared with the group S, the levels of Clock and Bmal1 proteins showed no significant changes in the group P, the group D, and the SEV group (all P>0.05). Compared with the group S, the levels of Clock and Bmal1 proteins at all time points showed no significant changes in the group F (all P>0.05).

Conclusion

Anesthetic SEV, propofol, and dexmedetomidine can inhibit the expression of clock gene Clock and Bmal1 protein in the brain fissues of the New Zealand rabbits, and the suppression effect continues for at least 24 h after anesthesia, whereas the suppression decreases significantly at 72 h after anesthesia.

全身麻醉(以下简称全麻)是外科手术中常用的且安全性较高的一种麻醉方式。然而，在临床麻醉工作中常常观察到患者术后出现神经心理学的改变，包括焦虑、抑郁、失眠、学习记忆能力下降和认知功能障碍等。以往研究^[1-2]报道：全麻药物可以影响生物钟基因Per2、Dbp、Arc、Egr1、Krox20和NGFI-B的表达，干扰生物钟节律，从而导致机体功能紊乱甚至疾病。Clock和Bmal1作为重要钟基因(clock gene)，其编码蛋白Clock和Bmal1形成的异二聚体Clock-Bmal1在节律起博器中起转录活化子的作用^[3]。全麻药物是否对钟基因Clock和Bmal1的表达产生影响，目前尚不清楚。本实验通过检测七氟烷(sevoflurane，SEV)、丙泊酚和右美托咪定麻醉后新西兰兔Clock和Bmal1蛋白的表达水平，研究全麻药物对生物钟节律的影响。

1. 材料与方法

1.1. 材料与试剂

Clock抗体羊抗兔抗体和Bmal1兔抗兔抗体购自美国Santa Cruz公司；发光液、标志物等由北京普利莱基因技术有限公司提供；丙泊酚、10%脂肪乳购自爱尔兰Corden Pharma S.P.A公司；右美托咪定购自江苏恒瑞医药股份有限公司(2 mL/200 μg)；SEV购自美国Abbott公司；PVDF膜购自美国Millipore公司。

1.2. 动物选择和分组

成年清洁级新西兰大白兔90只，雌雄不限，体重2.0~2.5 kg，由郑州大学实验动物中心提供。所有动物均在每天上午8点至10点进行试验操作。将大白兔随机分为5组(每组18只)：生理盐水组(1 mL/h，S组)、丙泊酚组[600 µg/(kg·min^-1)，1 mL/h，P组)、10%脂肪乳组(1 mL/h，F组)、右美托咪定组[1 µg/(kg·min^-1)，1 mL/h，D组)、SEV组(吸入2.5% SEV)^[4]。24 h后每组再分为3个亚组(每个亚组6只)：0、24和72 h组。实验结束后，处死大白兔，分离脑组织进行检测和分析。

1.3. 标本检测和数据处理

采用蛋白质印迹法测定Clock和Bmal1蛋白的表达水平。取标本放在研钵内加液氮研磨至混悬液，以12 000 g 离心5 min提取，然后将提取液进行定量。采用SDS-PAGE凝胶电泳，使用加样器上样，每孔上样量为50 μg，恒压(200 V)电泳 45 min。转膜：恒压100 V，时间60 min。转膜结束后，用脱脂奶粉封闭1 h，孵上一抗，于4 ℃下摇动孵育过夜。然后选择相应的二抗，于室温下孵育1 h。二抗孵育结束后曝光显影。采用AIC.AlphaView软件对蛋白质印迹法图片进行灰度分析。

1.4. 统计学处理

所有数据均采用SPSS 12.0统计学软件进行处理。对数据进行正态性检验、方差齐性检验。正态分布的计量资料以均数±标准差( $\overline{x}$ ±s)表示，组间比较采用方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2. 结 果

2.1. 不同时间点各组新西兰兔麻醉后脑组织中Clock蛋白的表达水平

与S组比较，SEV组、P组和D组新西兰兔麻醉后0和24 h脑组织中Clock蛋白的表达水平均明显降低，差异均有统计学意义(均P<0.05)；而麻醉后72 h，与S组比较，SEV组、P组和D组中Clock蛋白的表达水平无明显改变，差异均无统计学意义(均P>0.05)；与S组相比，F组中Clock蛋白的表达水平在各个时间点差异均无统计学意义(均P>0.05)；与F组相比，P组新西兰兔麻醉后0和24 h，脑组织中Clock蛋白的表达水平均明显降低，差异均有统计学意义(均P<0.05)；而麻醉后72 h后，脑组织中Clock蛋白的表达水平无明显改变，差异无统计学意义(P>0.05；图1，表1)。

图1.

蛋白质印迹法检测Clock蛋白的表达水平

Figure 1 Expression level of the Clock protein by Western blotting

表1.

不同时间点各组Clock蛋白的相对表达水平( $\overline{\mathit{x}}$ ±s ， n=6)

Table 1 Relative expression level of Clock protein in each group at different time points ( $\overline{\mathit{x}}$ ±s, n=6)

组别	0 h	24 h	72 h
S组	198.1±12.4	204.2±16.9	105.3±8.2
F组	217.3±14.9	185.9±12.6	114.7±6.2
P组	108.5±10.3*†	115.1±8.7*†	120.4±5.1
D组	112.9±8.6*	103.8±8.3*	110.6±10.4
SEV组	121.4±7.7*	108.2±6.3*	106.4±9.6

与S组比较，*P<0.05；与F组比较，†P<0.05。

2.2. 不同时间点各组新西兰兔麻醉后脑组织中Bmal1蛋白的表达水平

与S组比较，SEV组、P组和D组新西兰兔麻醉后0和24 h，脑组织中Bmal1蛋白的表达水平均明显降低，差异均有统计学意义(均P<0.05)；而麻醉后72 h，与S组比较，SEV组、P组和D组中Bmal1蛋白的表达水平无明显改变，差异均无统计学意义(均P>0.05)；与S组相比，F组中Bmal1蛋白在所有的时间点的表达水平无明显改变，差异均无统计学意义(均P>0.05)；与F组相比，P组新西兰兔麻醉后0和24 h，脑组织中蛋白Bmal1的表达水平明显降低，差异均有统计学意义(均P<0.05)；而麻醉后72 h后，脑组织中蛋白Bmal1的表达水平无明显改变，差异无统计学意义(P>0.05；图2，表2)。

图2.

蛋白质印迹法检测Bmal1蛋白的表达水平

Figure 2 Expression level of the Bmal1 protein by Western blotting

表2.

不同时间点各组Bmal1蛋白的相对表达水平( $\overline{\mathit{x}}$ ±s ， n=6)

Table 2 Relative expression level of Bmal1 protein in each group at different time points ( $\overline{\mathit{x}}$ ±s, n=6)

组别	0 h	24 h	72 h
S组	201.7±16.3	218.4±17.2	119.5±7.2
F组	220.9±18.4	235.7±16.8	121.4±5.1
P组	118.1±12.3*†	113.6±7.5*†	115.3±6.8
D组	110.7±6.9*	120.5±8.4*	110.7±11.2
SEV组	105.2±9.4*	123.7±13.8*	124.6±10.4

与S组比较，*P<0.05；与F组比较，†P<0.05。

3. 讨 论

机体的生命活动包括血压、体温、激素水平、血中免疫细胞的数量、睡眠觉醒周期循环等均按照一定的时间顺序发生振荡性变化，这种变化的节律称为生物节律^[5]。生物节律紊乱可引起多种疾病，如焦虑、抑郁、失眠、代谢紊乱、各种神经退行性病变和癌症等^[6]。生物节律是由钟基因所调控的。目前，已经发现的钟基因包括Arc，Krox20，NGFI-B，Bmal1、2，Clock，Per1、2、3，Cry1、2和Dbp 等^[7]。其中，Clock和Bmal1作为非常重要的钟基因，其表达的Clock和Bmal1蛋白形成的杂二聚体可作为正向调节因子，通过结合到钟基因Per、Cry等的启动子E-box元件上，激活这些基因^[8-9]。随后这些基因表达的蛋白多聚化，并转移至细胞核；而其作为负向调节因子可抑制Clock:Bmal1杂二聚体的转录活性，进而抑制钟基因Per和Cry的活性，从而形成节律性环路^[10-11]。钟基因Clock和Bmal1就是通过这种“转录-翻译-抑转录”反馈环输出节律^[12]。

已有研究^[13]报道：钟基因的转录和翻译受多种因素的影响。葡萄糖水平的高低能影响大鼠母钟(位于下丘脑视交叉上核)和外周组织中钟基因的表达。间断缺氧如呼吸睡眠暂停综合征可通过炎症机制来影响钟基因的表达^[14]。交感神经兴奋释放的儿茶酚胺也有可能影响钟基因的表达^[15]。也有学者^{[1, 4]}发现：使用SEV麻醉后，SD大鼠海马钟基因Per2、Dbp、Arc、Egr1、Krox20和NGFI-B的表达发生明显改变。Yuko等^[2]发现：丙泊酚和右美托咪定可显著影响大鼠钟基因Arc、Dbp、Egr1、Egr2、NGFI-B、Per2和Tef的表达。然而，目前关于麻醉药物对钟基因Clock和Bmal1影响的研究仍然较少。

为了探讨麻醉药物对钟基因Clock和Bmal1表达的影响，本实验采用新西兰兔作为研究对象，观察SEV、丙泊酚和右美托咪定麻醉后不同时间点Clock 和Bmal1蛋白表达水平。结果表明：在麻醉后0和24 h，与S组相比，SEV组、P组和D组新西兰兔脑组织中蛋白Clock和Bmal1的表达水平明显降低，而F组中Clock和Bmal1蛋白的表达水平无明显改变；与F组比较，P组中蛋白Clock和Bmal1的表达水平明显降低；在麻醉后72 h，与S组比较，F组、SEV组、P组和D组新西兰兔脑组织中Clock和Bmal1蛋白的表达水平无明显变化。这说明麻醉剂SEV、丙泊酚和右美托咪定抑制了钟基因Clock和Bmal1的表达，而这种抑制作用一直持续到麻醉苏醒后24 h。然而在麻醉后72 h，SEV、丙泊酚和右美托咪定这种抑制作用明显减弱，钟基因Clock和Bmal1的表达基本恢复正常。同时，也说明在麻醉剂丙泊酚中，抑制钟基因Clock和Bmal1表达的是丙泊酚本身，而非其溶剂脂肪乳。当外界环境发生变化时，昼夜节律的波动将发生明显的相位移动，这种特异反应称为生物钟的重设定^[16]。本研究揭示了新西兰兔在经历麻醉后钟基因Clock和Bmal1表达的节律性发生了一系列变化，首次证实了麻醉剂SEV、丙泊酚和右美托咪定影响了钟基因Clock和Bmal1的表达。这为临床上预防和治疗患者术后生理睡眠改变和神经生理障碍提供了必要的实验依据与思路。

此外，本实验有3个方面需要注意：1)由于昼夜光照能够影响生物的节律性^[17-18]，因此为了降低昼夜变化对钟基因的影响，所有的实验均应在相同的时间点开始和结束。2)在本实验中，麻醉后72 h麻醉剂对钟基因的抑制作用明显减弱，而临床上患者在麻醉后可出现长期的神经心理学改变，这可能是因为临床麻醉中使用了多种麻醉药物，抑制作用叠加的结果。另外，人与动物的病理、生理的差别也是不可忽视的因素。3)本实验选择的时间点较少且不够紧凑，所发现的麻醉后钟基因Clock和Bmal1的表达变化规律不够详细，有待进一步深入研究。

综上所述，麻醉药物SEV、丙泊酚和右美托咪定抑制了新西兰兔脑组织中钟基因Clock和Bmal1的表达，这种抑制作用一直持续至麻醉后24 h。然而，在麻醉后72 h，该抑制作用明显减弱。这提示麻醉药物可引起生物钟系统的紊乱，至于由此引起的病理、生理改变，有待于以后的实验进行进一步的探讨。

利益冲突声明

作者声称无任何利益冲突。

原文网址

http://xbyxb.csu.edu.cn/xbwk/fileup/PDF/202108809.pdf