奥氮平通过抑制载脂蛋白A5分泌导致非酒精性脂肪性肝病

Abstract

目的

奥氮平是最常用第2代抗精神病药，若长期服用会显著增加发生非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)的风险，但其发病机制不明。肝内脂肪过度沉积是NAFLD的病理基础，且与肝内TG代谢障碍密切相关。载脂蛋白A5(apolipoprotein A5，ApoA5)是体内TG代谢的关键调节因子，促进肝细胞内TG蓄积，参与NAFLD发病。然而，奥氮平是否通过ApoA5诱发NAFLD尚无报道。本研究探讨ApoA5是否参与奥氮平相关NAFLD的发病。

方法

从动物实验、细胞实验及ApoA5基因敲低实验3个层次上进行探讨。将6周龄雄性C57BL/6J小鼠随机分为对照组、低剂量组、高剂量组，分别给予10% DMSO、3 mg/(kg·d)奥氮平、6 mg/(kg·d)奥氮平。干预8周后，测定各组小鼠的血脂4项、肝转氨酶2项和ApoA5水平。HepG2细胞分为对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组，分别给予0.1% DMSO、25 μmol/L奥氮平、50 μmol/L奥氮平、100 μmol/L奥氮平干预24 h。对100 μmol/L奥氮平预处理的HepG2细胞分别转染ApoA5 siRNA或scrambled siRNA(阴性对照)。采用油红O染色观察肝组织和肝细胞中的脂滴；HE染色观察肝组织脂质沉积情况；实时PCR检测ApoA5 mRNA表达水平；蛋白质印迹法检测ApoA5蛋白质表达水平。

结果

3或6 mg/(kg·d)的奥氮平干预后，各组小鼠体重差异无统计学意义(P>0.05)，血浆TG、ALT和AST水平呈剂量依赖性升高，血浆ApoA5水平呈剂量依赖性降低(均P<0.05)；但各组小鼠血浆胆固醇(HDL-C、LDL-C、TC)水平差异均无统计学意义(均P>0.05)。肝组织中ApoA5蛋白质水平呈剂量依赖性升高(均P<0.05)，但各组ApoA5 mRNA表达差异无统计学意义(P>0.05)。对照组小鼠肝组织结构完整，肝细胞形态规则，细胞内仅见少量散在脂滴；给予3或6 mg/(kg·d)奥氮平的小鼠肝细胞内可见大量脂肪沉积，细胞呈气球样变，充盈着大量的脂滴空泡，细胞核位于细胞边缘，红色脂滴数量明显增多，且高剂量组更明显。25、50、100 μmol/L的奥氮平干预HepG2细胞24 h后，细胞内脂滴数量明显增多和体积明显增大，且给药剂量越高变化越明显；细胞中ApoA5蛋白质水平呈剂量依赖性升高(P<0.05)，但各组ApoA5 mRNA表达差异无统计学意义(P>0.05)。与转染scrambled siRNA的HepG2细胞相比，转染ApoA5 siRNA的HepG2细胞内脂滴的数量明显减少，体积明显缩小。

结论

奥氮平短期干预，虽不显著增加小鼠体重，但可直接诱发高TG血症和NAFLD；奥氮平通过抑制肝脏ApoA5分泌(但不影响肝脏ApoA5合成)，诱导NAFLD发病，提示ApoA5分泌障碍是奥氮平相关NAFLD发病的关键机制及干预靶点。

精神分裂症是一种严重的精神疾病，其治疗手段主要是抗精神病药。第2代抗精神病药因具有作用谱广、锥体外系反应少等优点，已基本取代第1代抗精神病药，成为治疗精神分裂症的首选药物。然而，患者服用第2代抗精神病药尤其是奥氮平后，普遍存在脂代谢异常，突出表现为TG代谢紊乱、非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)发病风险显著增加^[1]。NAFLD是一种与胰岛素抵抗和遗传易感密切相关的代谢应激性肝损伤，疾病谱包括非酒精性脂肪肝、酒精性脂肪性肝炎、肝硬化和肝细胞癌^[2]。NAFLD是全球最常见慢性肝病，也是中国第一大慢性肝病。该病可使其他慢性肝病恶化，严重者导致肝硬化失代偿、肝细胞癌或移植肝复发，还可增加发生2型糖尿病和心血管病的风险^[3]。药物是NAFLD的重要诱因，而奥氮平是导致NAFLD的主要药物，但目前该药致NAFLD的机制尚不清楚。

肝细胞内脂肪过度沉积是NAFLD发生的病理基础，其典型的病理特征表现为镜下肝细胞内脂滴显著增加。脂滴的主要成分是TG(脂肪实质也是TG)，肝细胞内TG代谢(合成和水解)正常是维系脂滴稳态、防止脂肪变性的保障。TG水解障碍将造成脂肪过度沉积，脂滴数量增加、体积变大，诱发肝脂肪变性，并最终导致NAFLD^[4]。TG代谢受多种因素影响，而载脂蛋白A5(apolipoprotein A5，ApoA5)是调节TG代谢的关键因子^[5]。有研究^[6-7]发现：ApoA5上调肝细胞内TG、促进脂滴形成，是NAFLD的正性调控因子。我们既往的研究^[8]显示：治疗奥氮平相关脂代谢异常的二甲双胍恰是通过ApoA5途径发挥降脂作用的。上述证据提示，ApoA5可能参与奥氮平相关NAFLD的发病。本研究旨在探讨ApoA5对奥氮平相关NAFLD发病的确切作用及其机制。

1. 材料与方法

1.1. 材料

C57BL/6J小鼠购于湖南斯莱克景达实验动物公司；奥氮平购自美国MCE公司，用0.1% DMSO溶液溶解，配置成100 mmol/L母液储存，使用时用DMEM培养基稀释成相应浓度；人HepG2细胞购自美国模式培养物集存库；DMEM培养基和胎牛血清购自美国Hyclone公司；DMSO、油红O粉、小鼠ApoA5 ELISA试剂盒购于美国Sigma公司；油红O染色试剂盒和HE染色试剂盒购于德国Merck公司；人ApoA5 siRNA及scrambled siRNA由长沙安吉行生物科技有限公司构建；lipofectamine 3000 转染试剂盒、RNA提取试剂盒、cDNA反转录试剂盒及SYBR绿色荧光染料均购于美国Thermo Fisher公司；PCR引物由北京擎科新业生物技术有限公司合成；RIPA裂解液购于上海碧云天生物技术有限公司；BCA蛋白质定量检测试剂盒购于北京康为世纪生物科技有限公司；ApoA5抗小鼠单抗、ApoA5抗人单抗分别购于美国CST和美国Santa Cruz公司；内参tubulin单抗和HRP标记二抗购于美国Proteintech公司。

1.2. 方法

1.2.1. 动物分组

SPF清洁级6周龄雄性C57BL/6J小鼠，体重18~22 g，共18只，适应性喂养1周后，被随机分为对照组、低剂量组、高剂量组，每组6只。低剂量组、高剂量组给予分别3、6 mg/(kg·d)奥氮平，对照组给予等体积的10% DMSO溶液，均采取灌胃给药的方式。干预8周，期间每周称重。

1.2.2. 标本采集和生化指标的检测

干预8周后，禁食6 h，麻醉后处死小鼠。采集血标本，检测血脂4项、肝转氨酶2项和ApoA5水平。血脂4项包括TG、TC、HDL-C、LDL-C，肝转氨酶2项包括ALT、AST。ApoA5水平采用ELISA法检测。采血后迅速摘取小鼠肝脏，并予以生理盐水灌注清洗。取部分肝组织，用4%的多聚甲醛固定，进行脱水、包埋处理后切片；取另一部分肝组织，于液氮中冷冻后置于-80°C冰箱冻存，用于后续检测。实验动物使用符合中南大学动物管理委员会管理条例(审批号：2021364)。

1.2.3. 细胞分组和干预

人HepG2细胞用含有胎牛血清的DMEM培养基培养。传代后将细胞分为4组：对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组，分别给予0.1% DMSO溶液、25 μmol/L奥氮平、50 μmol/L奥氮平、100 μmol/L奥氮平，干预24 h。

1.2.4. ApoA5基因敲低实验

对奥氮平(100 μmol/L)预处理的HepG2细胞行ApoA5基因敲低实验。采用lipofectamine 3000转染试剂盒进行细胞转染：1)转染前1天，将适量HepG2细胞接种于6孔板中，用不含抗生素的培养基培养；当细胞融合度为70%~90%时准备转染。2)用Opti-MEN培养基稀释lipofectamine 3000。3)用Opti-MEN培养基稀释siRNA，制备ApoA5 siRNA或scrambled siRNA(阴性对照)预混液。4)向已稀释的lipofectamine 3000中加入siRNA预混液(1꞉1)，在室温下孵育15 min，制备siRNA脂质体复合物。5)将siRNA脂质体复合物加入细胞，置于含5% CO₂的培养箱中孵育48 h。

1.2.5. 油红O染色

采用油红O染色观察肝组织和肝细胞中的脂滴。对小鼠肝脏行6 μm冰冻切片。根据标准油红O染色方案对肝组织冰冻切片进行染色：用60%异丙醇洗涤后，采用油红O染色溶液染色30 min，再分别用60%异丙醇、蒸馏水洗涤，最后以苏木精复染。在显微镜下采集图像，计算阳性染色面积占总切片面积百分比，采用Image J软件计算脂滴体积。

制备油红O染色液：用0.5 g油红O粉溶于100%异丙醇100 mL制成原液，再用水(原液与水的体积比为6꞉4)稀释并过滤。用PBS洗涤各组HepG2细胞2次后，移至4%甲醛溶液中，在37 ℃下固定0.5 h，再用PBS洗涤3次，用油红O染色液在37 ℃下染色30 min，60%异丙醇脱色，在相差显微镜下观察脂滴。每孔添加100%异丙醇提取油红O染色的脂滴，于520 nm处测量吸光度值，采用GraphPad Prism软件进行分析。

1.2.6. HE染色

采用HE染色观察肝组织脂质沉积情况。将肝组织置于10%甲醛溶液中在4 ℃下过夜固定，用乙醇脱水进行石蜡包埋，切成6 μm厚切片，在60 ℃下烘烤2 h。将切片浸入二甲苯和梯度酒精中脱蜡后，置于苏木精中对细胞核进行染色，再以1%盐酸乙醇分化。随后，置于HE染色液中染色，再行梯度乙醇脱水、透明，以中性树脂封片，移至光学显微镜下观察。所有切片均纳入计数，每张切片随机选取5个视野(400×)，每个视野保证肝细胞数20~40个，采用Image J软件计数。

1.2.7. 实时PCR

采用实时PCR检测ApoA5 mRNA表达水平。采用RNA提取试剂盒，从小鼠肝组织或HepG2肝细胞中提取总RNA。采用cDNA反转录试剂盒将RNA (2 μg)反转录为cDNA。应用实时PCR检测小鼠肝组织和HepG2肝细胞中ApoA5 mRNA表达水平。人ApoA5基因正向引物为：5'-GCCAGCGACTTCA-GGCTTT-3'，反向引物为：5'-AGCTTGCTCAGAA-CCTTGCC-3'；鼠ApoA5基因正向引物为：5'-TCCT-CGCAGTGTTCGCAAG-3'，反向引物为：5'-GAAG-CTGCCTTTCAGGTTCTC-3'。用SYBR绿色荧光染料定量PCR扩增产物。采用GAPDH作为内参基因，计算ApoA5 mRNA的相对表达水平。实验重复3次，取平均值。

1.2.8. 蛋白质印迹法

采用蛋白质印迹法检测ApoA5蛋白质表达水平。将小鼠肝组织或HepG2细胞用PBS清洗3次，加入RIPA裂解液，在低温下离心后收集上清液，提取总蛋白质。采用BCA蛋白质定量检测试剂盒测定蛋白质浓度，加入上样缓冲液和PBS稀释后行蛋白质变性。每孔上样50 μg蛋白质，行SDS-PAGE、PVDF转膜，移至5%脱脂牛奶中，在室温下封闭1h，加入抗ApoA5、抗tubulin的一抗，于4 ℃下孵育过夜，加入HRP二抗于室温下孵育2 h。采用Pierce^TM ECL发光试剂显影，Image J V1.8.0软件分析蛋白质条带灰度值，以tubulin为内参蛋白质，计算目的蛋白质ApoA5的相对表达水平。实验重复3次，取平均值。

1.3. 统计学处理

采用GraphPad Prism软件(8.0版)进行数据分析。计量资料以均数±标准差( $\overline{x}$ ±s)表示，2组比较采用t检验，3组以上比较采用单因素方差分析结合Tukey’s多重比较。P<0.05为差异有统计学意义。

2. 结 果

2.1. 奥氮平对小鼠血脂的影响

3或6 mg/(kg·d)的奥氮平干预8周后，各组小鼠体重差异无统计学意义(P>0.05)，血浆TG水平呈剂量依赖性升高(均P<0.05)；但各组小鼠血浆胆固醇(HDL-C、LDL-C、TC)水平差异均无统计学意义(均P>0.05，表1)。

表1.

各组小鼠的体重、血脂和转氨酶(n=6， $\overline{\mathit{x}}$ ±s)

Table 1 Body weight, blood lipids, and transaminase of mice in each group (n=6, $\overline{\mathit{x}}$ ±s)

组别	体重/g	TG/(mmol·L-1)	TC/(mmol·L-1)	HDL-C/ (mmol·L-1)	LDL-C/ (mmol·L-1)	ALT/(U·L-1)	AST/(U·L-1)
对照组	18.76±2.19	0.40±0.15	1.60±0.13	1.46±0.19	0.33±0.05	29.20±3.22	50.52±5.30
低剂量组	19.02±2.52	0.70±0.17*	1.63±0.15	1.45±0.17	0.38±0.07	65.57±13.90*	112.76±11.58*
高剂量组	19.59±2.86	1.09±0.19*†	2.18±0.20*†	1.42±0.13	0.39±0.08	103.17±25.05*†	170.53±19.87*†

与对照组比较，*P<0.05；与低剂量组比较，†P<0.05。

2.2. 奥氮平对小鼠肝功能的影响

3或6 mg/(kg·d)的奥氮平呈剂量依赖性升高转氨酶ALT和AST的水平(均P<0.05，表1)，提示奥氮平短期干预可损害小鼠肝功能。油红O染色结果显示：对照组小鼠肝细胞仅见少量散在脂滴；给予3或 6 mg/(kg·d)奥氮平的小鼠肝细胞内红色脂滴数量明显增多，且高剂量组脂滴数量显著多于低剂量组，部分脂滴融合为大脂滴(图1)。HE染色结果显示：对照组小鼠肝组织结构完整，肝细胞形态规则；给予3或6 mg/(kg·d)奥氮平的小鼠肝细胞内可见大量脂肪沉积，细胞呈气球样变，充盈着大量的脂滴空泡，细胞核位于细胞边缘，尤以高剂量组明显(图1)。

图1.

小鼠肝组织HE染色和油红O染色

Figure 1 HE and oil red O staining of liver tissues in mice

2.3. 奥氮平对小鼠血浆ApoA5水平及肝组织中ApoA5表达的影响

对照组、低剂量组、高剂量组小鼠血浆ApoA5水平分别为(101.46±23.56)、(83.74±16.25)、(62.48±11.78) ng/mL，奥氮平呈剂量依赖性地降低小鼠血浆ApoA5水平，组间比较差异均有统计学意义(均P<0.05)。相关性分析结果显示：血浆ApoA5水平与TG水平呈显著负相关(r=-0.855，P<0.001；图2)，且多元回归分析表明：第8周时小鼠血浆ApoA5与TG独立相关(P=0.029，表2)。给予3或6 mg/(kg·d)奥氮平干预的小鼠肝组织中ApoA5蛋白质水平呈剂量依赖性地升高(P<0.05)，但各组ApoA5 mRNA表达差异均无统计学意义(均P>0.05，图3)。

图2.

奥氮平干预小鼠血浆ApoA5水平与TG水平的相关性

Figure 2 Correlation between plasma ApoA5 levels and TG levels in olanzapine-treated mice

表2.

奥氮平干预小鼠血浆TG水平的多元回归分析

Table 2 Multiple regression analysis of independent contributors to plasma triglyceride levels in olanzapine-treated mice

自变量	未标准化系数	标准化系数	标准误	P
体重	-0.059	0.282	0.222	0.514
TC	0.435	0.466	0.359	0.236
HDL-C	-0.750	-1.068	0.703	0.259
LDL-C	-0.498	-0.439	0.406	0.230
ApoA5	-0.706	-0.762	0.004	0.029

图3.

小鼠肝组织中 ApoA5 mRNA(A)和ApoA5蛋白质(B)的表达

Figure 3 Expression of ApoA5 mRNA(A) and ApoA5 protein (B) in liver tissues of mice

*P<0.05 vs the control group; † P<0.05 vs the low-dose group.

2.4. 奥氮平对HepG2细胞中脂滴数量和ApoA5表达的影响

25、50、100 μmol/L的奥氮平干预HepG2细胞24 h后，油红O染色结果显示细胞内脂滴数量明显增多和体积明显增大，且给药剂量越高变化越明显(图4)；细胞中ApoA5蛋白质水平呈剂量依赖性升高(P<0.05)，但各组ApoA5 mRNA表达差异均无统计学意义(均P>0.05，图5)。

图4.

奥氮平增加HepG2细胞中脂滴的数量和体积

Figure 4 Olanzapine increases the number and volume of lipid droplets in HepG2 cells

A: Control group; B: Low-dose group; C: Medium-dose group; D: High-dose group.

图5.

奥氮平上调HepG2细胞中ApoA5蛋白质的表达水平(A)，但并不影响 ApoA5 mRNA的表达水平(B)

Figure 5 Olanzapine up-regulates the expression levels of ApoA5 protein (A) in HepG2 cells, but does not affect the expression levels of ApoA5 mRNA (B)

*P<0.05 vs the control group; †P<0.05 vs the low-dose group; ‡P<0.05 vs the medium-dose group.

2.5. 沉默 ApoA5 基因对HepG2细胞内脂滴的影响

转染ApoA5 siRNA的HepG2细胞中ApoA5蛋白质的表达水平较转染Scrambled siRNA的HepG2细胞明显下降(图6A)，表明siRNA成功地敲低了细胞ApoA5基因的表达水平。与转染scrambled siRNA的HepG2细胞相比，转染ApoA5 siRNA的HepG2细胞内脂滴的数量明显减少，体积明显缩小(图6B)。

图6.

转染 ApoA5 siRNA的HepG2细胞中ApoA5蛋白质的表达水平明显下降(A)，且脂滴的数量明显减少，体积明显减小(B)

Figure 6 Expression levels of ApoA5 protein in HepG2 cells transfected with ApoA5 siRNA decrease significantly (A) and the number and volume of lipid droplets decreases significantly (B)

*P<0.05 vs the scrambled siRNA group.

3. 讨 论

奥氮平是治疗精神分裂症的一线药物，但长期服用此药可导致肥胖和脂代谢紊乱，增加发生NAFLD的风险。既往关于奥氮平相关NAFLD机制的研究主要聚焦在奥氮平引起的中枢神经系统改变。传统观点认为，奥氮平相关NAFLD发生源于该药“中枢脱靶效应”(或称“中枢途径”)，表现为服药者多食少动(体质表型为肥胖)。其机制在于：1)该药作用于饱中枢和摄食中枢，抑制饱感、促进摄食，导致脂质合成增加；2)患者服药后镇静少动、能耗减少，导致脂质分解减少。最终，服药者出现脂代谢紊乱，临床表现为高脂血症和NAFLD^[1]。然而，本研究显示：奥氮平短期干预，虽不显著增加小鼠体重，但可导致高TG血症和NAFLD；奥氮平体外干预HepG2细胞，导致脂滴显著增加，诱发细胞脂肪变性。这提示除中枢途径外，奥氮平可直接作用于肝，导致肝TG代谢紊乱、肝内脂肪过度沉积，最终诱发NAFLD。换而言之，外周途径(肝)参与奥氮平相关NAFLD发病，是奥氮平短期内致脂代谢紊乱的重要途径。

为揭示奥氮平相关NAFLD的发病机制，我们选择ApoA5作为关键因子，其理由在于：ApoA5通过抑制肝内TG水解，导致脂肪过度沉积和脂滴大量蓄积，最终诱发NAFLD^[6-7]。人ApoA5编码基因位于染色体11q23，其蛋白质由343个氨基酸组成，分子量约39 kD。ApoA5是肝特异性表达的分泌型蛋白质，在肝细胞内质网合成后，该蛋白质被分泌至胞外、进入血液循环，分布于血浆脂蛋白颗粒上^{[5, 8]}。

ApoA5是TG代谢的关键因子，但其在肝内、外调节TG代谢的作用相反。早期研究^[5]显示：敲除小鼠ApoA5基因后，血浆TG水平升高达4倍，而过表达ApoA5基因后，小鼠血浆TG水平降低达65%。人ApoA5基因表达缺陷，可导致严重高TG血症^[9]。人血浆ApoA5水平与TG水平呈显著负相关^[10]。肝外(血液)ApoA5是血浆TG的负性调控因子。但后期研究发现：肝内的ApoA5抑制TG水解、促进脂滴形成，是NAFLD的促进因子。相关证据如下：1)NAFLD患者肝组织的ApoA5表达上调，与肝组织TG含量和脂滴数量呈正相关^[6]；2)激光共聚焦显微镜下可见肝细胞内ApoA5定位于脂滴外层，抑制脂滴TG水解^[7]；3)ApoA5基因沉默后，肝细胞内TG减少、脂滴消失，而ApoA5过表达显著增加肝细胞内TG和脂滴^[6-7]。

本研究动物实验结果显示：奥氮平短期干预可成功诱发小鼠高TG血症，血浆ApoA5水平显著降低，且血浆ApoA5水平与TG水平呈显著负相关。结合既往研究^[5-8]结论ApoA5是血浆TG代谢负性调控因子，笔者认为奥氮平可能通过降低小鼠血浆ApoA5水平，诱发高TG血症。本研究还发现：奥氮平短期干预导致小鼠发生NAFLD，小鼠肝ApoA5蛋白质水平明显升高，而ApoA5 mRNA表达水平差异无统计学意义。体外实验同样显示：奥氮平干预HepG2肝细胞后，ApoA5蛋白质表达显著上调，但ApoA5 mRNA表达无显著变化。而采用siRNA敲低HepG2细胞ApoA5基因可有效消除奥氮平致细胞脂肪变性作用，这提示奥氮平通过ApoA5途径诱发NAFLD。

那么，如何解释奥氮平所致肝内、外ApoA5结果的不一致呢？换而言之，奥氮平如何影响ApoA5代谢，诱发TG代谢紊乱，最终导致高TG血症和NAFLD呢？鉴于ApoA5在肝内、外调节TG作用不同——肝内抑制TG水解(促进脂肪变性)、肝外促进TG水解(降低血浆TG)，而ApoA5是肝脏特异性表达的分泌性蛋白，故ApoA5的正常分泌意义重大：既可减少肝内ApoA5滞留，避免脂解障碍所致NAFLD；又可保证肝外ApoA5充足，促进血液TG水解、防止高TG血症^[6-7]。因此，我们推测，奥氮平通过抑制肝细胞ApoA5分泌(表现为小鼠血浆ApoA5水平降低)，而不是抑制肝细胞ApoA5合成(表现为小鼠肝组织和体外肝细胞中ApoA5 mRNA表达水平无显著改变)，导致ApoA5分泌障碍、滞留肝细胞(表现为小鼠肝组织和体外肝细胞中ApoA5蛋白质水平显著升高)，抑制肝内TG水解，促使脂肪过度沉积，最终诱发NAFLD。

综上，本研究首次证实：奥氮平短期干预，虽不显著增加体重，但可直接诱发高TG血症和NAFLD，其机制源自该药抑制肝脏分泌ApoA5。本研究将为奥氮平相关脂代谢紊乱的防治提供线索和干预靶点。

基金资助

国家自然科学基金(81974281)；湖南省自然科学基金(2020JJ2052)；中国心血管健康联盟进阶基金(2019-CCA-ACCESS-2020JJ2052)。

This work was supported by the National Natural Science Foundation (81974281), the Natural Science Foundation of Hunan Province (2020JJ2052), and the Chinese Cardiovascular Association-Access Fund (2019-CCA-ACCESS-2020JJ2052), China.

利益冲突声明

作者声称无任何利益冲突。

作者贡献

李蓉 实验的设计与操作，论文的撰写与修订；朱文强 实验的设计与操作；黄飘飘 实验材料的准备；丁晨 对实验数据的统计学分析；汤雅新、连平安 实验数据的收集；黄贤圣 实验的设计和指导，论文的修改。所有作者阅读并同意最终的文本。

原文网址

http://xbyxb.csu.edu.cn/xbwk/fileup/PDF/202206730.pdf