阿司匹林通过调控Wnt/β-catenin信号通路抑制兔耳增生性瘢痕的生长

Abstract

Objective

Steroidal anti-inflammatory drugs have certain side effects in the treatment of hypertrophic scar, and the scar recurrence is easy after withdrawal of steroid anti-inflammatory drugs. Finding reliable alternative drugs is an effective means to improve this defect. Aspirin, a traditional non-steroidal anti-inflammatory drug, is safe for topical use and has anti-inflammatory effects similar to those of steroidal anti-inflammatory drugs, which may have similar effects on the treatment of hypertrophic scar. This study aims to investigate the inhibitory effect of aspirin on the proliferation of hypertrophic scar in rabbit ears and the underlying mechanism.

Methods

The rabbit ear hypertrophic scar models were prepared. The rabbits were randomly divided into a normal skin group (group A), a blank control group (group B), a 0.9% NaCl group (group C), a 0.2% aspirin group (group D), a 0.5% aspirin group (group E), a 2% aspirin group (group F), and a triamcinolone acetonide group (group G). Macroscopic observation of hyperplasia was performed 8 weeks after local injection of the scar, followed by collecting the scar tissue samples for HE staining, Masson staining, and immunohistochemistry, respectively to assess the proliferation of fibroblasts and collagen fibers, and calculate the hypertrophic index, microvessel density, and immunohistochemical score.

Results

All rabbit ear hypertrophic scar models were successfully constructed. In groups B and C, the hypertrophic scar edge was irregular, with reddish protruding epidermis, significant contracture and hard touch. In group D, E, and F, with the increase of aspirin administration concentration, the scar became thinner and gradually flat, the proliferation of fibrocytes and collagen fibers was weakened, and the hypertrophic index was gradually decreased (P<0.05). Immunohistochemistry showed that the expression of β-catenin was decreased in the group D, E and F in turn, and the immunohistochemical score was gradually decreased (P<0.05). There was no significant difference in hypertrophic index, microvessel density, and immunohistochemical score (all P>0.05).

Conclusion

Local injection of aspirin can reduce the generation of hypertrophic scar in a dose-dependent manner within a certain concentration range; aspirin inhibits the growth of hypertrophic scar in rabbit ears by inhibiting Wnt/β-catenin signal pathway; 2% aspirin and 40 mg/mL triamcinolone acetonide have similar curative efficacy on hypertrophic scar.

增生性瘢痕(hypertrophic scar，HS)是机体对创伤愈合过程中异常反应形成的病理性瘢痕，可出现不同程度的瘙痒、疼痛症状，常导致机体局部外观及功能异常^[1]。HS生成机制较为复杂，其产生过程主要由炎症主导。创伤及多种促炎因素(包括局部张力、缺氧、感染及遗传等)刺激导致瘢痕异常增生，形成HS及瘢痕疙瘩^[2]。目前多种手段(包括手术、药物、加压等)相结合治疗病理性瘢痕的疗效仍不如意，减轻炎症是目前HS防治的主要策略之一^[3]。已证实^[4-6]类固醇类激素如曲安奈德(triamcinolone acetonide，TAC)对异常HS有良好的治疗效果，但类固醇激素会降低机体免疫力，容易导致伤口感染及不愈合，在长期使用过程中也可能出现皮肤萎缩或毛细血管扩张等局部及全身不良反应^[7]，这在一定程度上限制了类固醇激素的应用。因此，寻找毒副作用轻微的替代药物是解决这一问题的关键。类固醇激素及非甾体抗炎药均能通过抑制相对应酶的活性而减少炎症介质前列腺素E2及血栓素的合成，从而抑制炎症反应。类固醇激素主要作用于炎症介质合成路径上游的磷脂酶A2，而非甾体抗炎药作用于路径中下游的环氧合酶。两者抗炎方式类似，而抗炎反应可有效抑制HS的增生，那么，两者分别治疗HS是否有相近的疗效？本实验拟构建兔耳HS模型，观察阿司匹林对HS的疗效，并初步分析阿司匹林治疗HS的可能机制。

1. 材料与方法

1.1. 材料

1.1.1. 动物

14只2至3月龄的新西兰大白兔购自中南大学湘雅三医院动物实验中心，体重(2.3±0.2) kg，雌雄不限。本实验获得中南大学湘雅三医院动物伦理委员会批准(审批号：2018sydw0267)。

1.1.2. 主要仪器和试剂

切片机购于浙江金华益迪试验器材公司，切片刀购于莱卡显微系统(上海)贸易有限公司，包埋机购自常州中威电子仪器公司，显微镜购自美国Motic公司。

石蜡及中性树胶购自美国Sigma公司，苏木精、PBS(pH7.2~7.6)、伊红、Masson染色试剂盒、枸橼酸盐缓冲液购自美国Wellbio公司，二步法试剂盒及DAB试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司，阿司匹林购自华中海威基因科技有限公司，TAC购自上海通用药业股份有限公司。

1.2. 方法

1.2.1. 建立兔耳HS模型

将14只大白兔喂养10 d后，随机选取12只于耳朵腹面制造HS模型。将兔固定于手术台，刮除兔耳腹侧兔毛，于耳缘静脉注射3%的戊巴比妥钠(30 mg/kg)麻醉。选取每只兔耳的4处区域，每处区域间隔大于1 cm，呈正方形，大小约1 cm×1 cm，用记号笔标记(图1A)。消毒，铺无菌巾单，切除标记区域兔耳全层皮肤及皮下软组织至软骨面，制成目标伤口(图1B)，注意避开兔耳腹侧血管。使用干净纱布覆盖固定。术后第3天，拆开伤口敷料，消毒，敞开创面待其自然愈合。

图1.

兔耳瘢痕模型构建

Figure 1 Establishment of rabbit ear scar model

A: Before the surgery. B: Set up the wound. C: Scar healed on the 20th day after surgery.

1.2.2. 分组及给药

手术第20天，兔耳伤口全部覆盖上皮。将2只未造模兔分为A组，为正常皮肤组，造模成功的12只随机分为6组(2只/组)，即B组为空白对照组，C组为0.9% NaCl组，D组为0.2%阿司匹林组，E组为0.5%阿司匹林组，F组为2%阿司匹林组，G组为TAC组。

给药方法：A组，不予处理；B组不予注射，为空白对照；C组注射0.9% NaCl作为对照；D组注射0.2%阿司匹林；E组注射0.5%阿司匹林；F组注射2%阿司匹林；G组注射40 mg/mL的TAC原液。注射方法：选用2 mL的注射器，在HS边缘外的正常皮肤处均匀选取4个点，由瘢痕边缘向瘢痕中心基底部均匀注射。每个进针点给药0.2 mL，每处瘢痕共给药0.8 mL，1次/周，共给药8次。

1.2.3. HS外观观察

每次给药前后观察各组瘢痕外观，如瘢痕的颜色及性状，并拍照记录兔耳HS的外观改变。

1.2.4. 取材

所有兔于第8次治疗后第3天统一取标本。于兔耳缘静脉注射3%的戊巴比妥钠，麻醉后消毒，铺巾，切取各组兔耳瘢痕组织标本，洗净。

1.2.5. 病理组织切片制作

将组织标本快速固定于40%的甲醛中，脱水后浸蜡包埋，切成厚4 μm的薄片，每只兔耳取6张切片等分为3份，分别进行HE染色、Masson染色及免疫组织化学检测。

1.2.6. HE染色

将切片于二甲苯溶液中脱去石蜡，然后依次降阶梯浸泡于不同浓度(依次为100%、95%、85%、75%)乙醇中，每级5 min，再于蒸馏水中浸洗；用苏木精染色1 min，水洗，PBS返蓝；然后用伊红染色 1 min，水洗，以梯度(95%、100%)乙醇脱水后，置于二甲苯中透明，用中性树胶封片。

1.2.7. Masson染色

将切片脱去石蜡至水化，甩干，滴加核染液覆盖整个切片标本3~5 min。用自来水冲洗，蒸馏水浸泡，再在PBS中浸泡5~10 min，使细胞核返蓝。去除切片上残留的水，滴加浆染液覆盖整个切片标本 2 min，洗净。用分色液定色30 s，弃液。滴加复染液覆盖整个标本6~8 min，再用无水乙醇洗净，吹干、透明、封片。

1.2.8. 免疫组织化学检测

取切片于60 ℃烤30~60 min；重复2次脱蜡，逐级降阶梯浸泡于100%、95%、85%、75%乙醇溶液中，每级5 min。后用蒸馏水浸洗5 min，再浸泡于pH值为6.0的缓冲液中，加热，沸腾后停止，间断煮15 min修复抗原。冷却15 min后拿出，放置于室温。使用PBS溶液洗涤3 min，此步骤重复3次。随后加入3%的双氧水中10 min，用PBS冲洗3 min，此步骤重复3次。孵育一抗：滴加适当稀释的一抗(β-catenin)，置于4 ℃冰箱中12 h。使用PBS冲洗3次，5 min/次。再孵育二抗：滴加50~100 μL抗-兔、兔-IgG抗体-HRP多聚体于37 ℃孵育30 min，后予PBS洗涤3次，5 min/次。DAB显色：滴加50~100 μL DAB工作液，置于室温下1~5 min，然后使用蒸馏水冲洗；再次用苏木精染约8 min，水洗，返蓝；最后于60%、80%、100%的乙醇中逐级脱水，每级5 min，脱水完成后，透明、封片。

1.2.9. 结果观察及指标测定

测定瘢痕指数(hypertrophic index，HI)：HE染色后将切片置于光镜下观察，HI=软骨面到兔耳瘢痕最突出点距离/软骨面到周围正常皮肤距离。

测定微血管密度：在低倍显微镜下锁定HE染色切片中血管明显的区块。选定后，在200倍镜下观察微血管数量。取5个不同视野下的数据求平均数。

免疫组织化学评分：将免疫组织化学染色切片置于光镜下进行计分，分为阳性细胞占比与颜色反应强度两种计分方式，以评估各组β-catenin蛋白的含量。阳性细胞占比为0记0分，0~<10%记1分，10%~<50%记2分，50%~<80%记3分，80%~100%记4分。免疫组织化学染色后无反应记0分，淡黄色记1分，深棕黄色记2分，棕褐色记3分。两者之和为总分。每组中每张切片随机选取5个不重叠的视野计算总分，求平均数。

1.3. 统计学处理

所有数据均采用SPSS 19.0统计软件进行分析。服从正态分布的计量资料用均数±标准差( $\overline{x}$ ±s)表示，多组比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2. 结 果

2.1. 瘢痕大体观察

兔耳造模成功后瘢痕区呈红色，突出于表皮(图1C)。首次给药后8周，A组为正常皮肤；B、C两对照组HS边缘不规则，淡红色，显著突出表皮，并有明显挛缩，触之质硬；C组可见HS突出于皮肤表面，质硬，颜色较B组浅；D组HS厚度变薄，轻微挛缩，色泽与正常肤色差异不明显；E组HS平整，且色泽较正常肤色淡，质软；G组HS平软，色淡，如正常肤色(图2)。

图2.

给药8周后兔耳增生性瘢痕外观

Figure 2 Hypertrophic scar in rabbit ears 8 weeks after administration

A: Normal skin group; B: Blank control group; C: 0.9% NaCl group; D: 0.2% aspirin group; E: 0.5% aspirin group; F: 2% aspirin group; G: Triamcinolone acetonide group.

2.2. HE染色观察

在镜下，A组结构清晰，角质层排列均匀，成纤维细胞数量较少，胶原纤维排列整齐，且大致与角质层走向平行；B组和C组可见角质层明显增厚且不均匀，成纤维细胞大量增生，排列紊乱不规则，伴有微血管增生；D组成纤维细胞数目明显减少，角质层仍有明显增厚，但对比于C组，角质层较为均匀；E组成纤维细胞数目进一步减少，角质层增厚情况有所改善，排列较均匀；F组角质层明显变薄，与正常皮肤对比无显著差异，且厚度较均匀，成纤维细胞数量进一步减少，更接近于正常皮肤；G组成纤维细胞数目与F组接近，但角质层较F组厚，也厚于正常皮肤(图3)。

图3.

治疗8周后兔耳增生性瘢痕组织HE染色

Figure 3 HE staining of hypertrophic scar tissues of rabbit ears 8 weeks after treatment

With the increase of aspirin concentration, the number of fibroblasts in scar tissues decreases and the cuticle becomes flat.

2.3. HI

A、B、C、D、E、F、G组的平均HI分别为1.05、3.36、3.47、2.70、2.30、1.52、1.45。在3个阿司匹林组中，F组的治疗效果最优，其次是E组及D组(P<0.05)，F组与G组疗效差异无统计学意义(P>0.05，表1)。

表1.

各组瘢痕指数、微血管密度、免疫组织化学评分比较(n=8， $\overline{\mathit{x}}$ ±s)

Table 1 Comparison of hypertrophic index, microvascular density, and immunohistochemical score among groups (n=8, $\overline{\mathit{x}}$ ±s)

组别	瘢痕指数	微血管密度	免疫组织化学评分
正常皮肤组(A组)	1.05±0.04	18.05±2.80	3.00±0.53
空白对照组(B组)	3.36±0.29*	28.08±3.02	6.875±0.35*
0.9%NaCl组(C组)	3.47±0.22*	27.25±1.28§	6.875±0.35*
0.2%阿司匹林组(D组)	2.70±0.28*†‡	16.50±0.93†‡	6.00±0.53*†‡
0.5%阿司匹林组(E组)	2.30±0.39*†‡§	13.25±0.71†‡	5.13±0.64*†‡§
2%阿司匹林组(F组)	1.52±0.13*†‡§¶	8.58±1.62†‡§	4.13±0.35*†‡§¶
TAC组(G组)	1.45±0.18*†‡§¶	8.35±1.63†‡§	3.88±0.35*†‡§¶

与正常皮肤组比较，*P<0.05；与空白对照组比较，†P<0.05；与0.9% NaCl组比较，‡P<0.05；与0.2%阿司匹林组比较，§P<0.05；与0.5%阿司匹林组比较，¶P<0.05。

2.4. 微血管密度

在瘢痕组织中可见血管增生，在200倍镜下B组HS组织血管增生显著，F组使用2%阿司匹林后，血管数量锐减(P<0.05)，F组与G组血管数量差异无统计学意义(P>0.05，表1)。

2.5. Masson染色观察

Masson染色可见瘢痕组织中红色为角质层，蓝色为胶原纤维。在镜下，A组可见角质层平整均匀，胶原纤维有序，量适中，较为规整；B组及C组角质层厚度增加，不均匀，胶原纤维增粗，数量显著增加，相对紧密，排列错乱无章，呈涡旋或绳索状；在3个阿司匹林组中，随着浓度的增加，角质层厚度逐渐减小，胶原纤维减少且变细，排列逐渐规整，胶原纤维数量也相对减少；与F组比较，G组胶原纤维平整，排列情况无明显差异，但角质层仍明显增厚(图4)。

图4.

治疗8周后兔耳增生性瘢痕组织Masson染色

Figure 4 Masson staining of hypertrophic scar tissues of rabbit ears 8 weeks after treatment

With the increase of aspirin concentration, the number of collagen fibers in scar tissues decreases and the collagens are arranged in a smooth manner.

2.6. 免疫组织化学检测结果

A组免疫组织化学评分最低，B及C组评分最高，β-catenin含量最丰富。随着阿司匹林浓度增高，D、E、F组总分呈下降趋势(P<0.05)，β-catenin的含量逐渐减少。F组与G组β-catenin的表达未见明显差异(P>0.05；表1，图5)。

图5.

免疫组织化学测定治疗8周后兔耳增生性瘢痕组织β-catenin的表达

Figure 5 Expression of β-catenin in hypertrophic scar tissues of rabbit ears was determined by immunohistochemistry 8 weeks after treatment

With the increase of aspirin concentration, the expression of β-catenin decreases gradually.

3. 讨 论

HS是发生在皮肤上的一类纤维增生性疾病，遗传性、系统性或局部因素均可影响HS的形成，如单核苷酸多态性、外周血激素水平和局部张力等。研究^[2]表明大多数表浅的损伤并不会导致病理性瘢痕产生，而当损伤到达网状层时，才有可能造成瘢痕异常增生。在皮肤损伤后的炎症增殖过程中，由于成纤维细胞的活化，细胞外基质合成增多，过量细胞外基质尤其是Ⅰ型和Ⅲ型胶原沉积，导致HS形成^[3]。胶原沉积是伤口愈合的必经阶段，因此对于HS的治疗主要在于保持胶原分泌与降解的平衡。类固醇激素治疗HS主要是通过其抗炎反应而起作用的^[8]；其次，类固醇激素也可通过减少成纤维细胞增殖、胶原蛋白的合成及糖胺聚糖的产生来抑制瘢痕增生^[9]。

β-catenin主导的Wnt/β-catenin信号通路在HS生成过程中扮演重要角色^[10-11]，该信号通路可能参与组织纤维化、肿瘤及机体退行性病等的发生^[12-13]。在非再生性器官中，此信号通路一般为静止状态，在机体受伤后启动，随后参与创伤愈合的纤维化过程。在正常皮肤中，此信号通路可保持表皮干细胞的稳定，保证表皮的代谢平衡^[14]，而当皮肤局部受损时，其加快组织纤维化过程^[15]。抑制该信号通路可加快创面修复，避免瘢痕的生成^[16]。β-catenin蛋白增多是该通路起作用的关键。β-catenin在细胞核中与cyclinD、COX等^[17]基因结合，启动目标基因的转录和表达。阿司匹林可下调β-catenin/Tcf响应基因的转录活性^[18]，降低核β-catenin水平^[19]。毫摩尔级浓度的阿司匹林即可促进β-catenin的磷酸化，加快其分解从而对该通路产生抑制效应，此作用呈浓度依赖性^[20]。

本研究观察到在局部注射阿司匹林后，HS组织变薄，颜色变淡。阿司匹林浓度越高，瘢痕组织的外观情况就越接近于正常皮肤，在镜下角质层排列更均匀，且厚度明显减小；原有的旋涡状及条索状胶原纤维排列消失，取而代之以平整疏松的纤维排列，成纤维细胞数量明显减少；胶原纤维增生受到抑制。这说明阿司匹林可减少HS形成过程中这两种关键产物的增生。HI的结果也表明局部注射阿司匹林对HS的形成及增生具有明显的抑制作用，且此作用呈浓度依赖性。局部注射阿司匹林后，瘢痕组织微血管数目明显减少，说明阿司匹林对瘢痕组织的血管增生有抑制作用，注射40 mg/mL TAC与2%的阿司匹林可起到同样的效应。免疫组织化学结果显示：局部注射阿司匹林后，β-catenin蛋白表达明显减少，Wnt/β-catenin信号通路受到明显抑制。阿司匹林浓度越高，β-catenin蛋白的表达减少越明显，Wnt/β-catenin信号通路的表达越弱，瘢痕的治疗效果越好。这说明阿司匹林浓度的增加可使Wnt/β-catenin信号通路转导减弱，并导致HS生成减少，提示阿司匹林浓度是影响HS疗效的重要因素。

目前临床上用于治疗HS的非甾体类一线药物为TAC，其单独注射最佳剂量推荐为40 mg/mL^[5]，对HS有一定的治疗效果，但存在停药后HS复发率高，激素对局部皮肤不良反应多进而导致患者依从性差等问题。阿司匹林作为一种常用药物，价格更为低廉，便于获取，在浓度不超过2%时暂未发现对皮肤有刺激作用的报道，可作为治疗HS的良好替代品。这一发现为HS的治疗提供了新的思路。

兔耳HS模型最初在1997年由Morris建立，并被不断地完善和修改，是目前公认的HS动物模型^[21]。但由于兔的生理和免疫系统与人可能不同，该模型同样具有局限性。因为瘢痕疙瘩仅在人体中形成，所以兔耳瘢痕模型主要用于HS的研究，而对于瘢痕疙瘩的研究，目前仍然缺乏有效的动物模型。本实验验证了阿司匹林在兔耳HS模型中对HS的抑制作用，但在人体中是否有相同的作用，以及阿司匹林是否能作用于瘢痕疙瘩并对瘢痕疙瘩的治疗产生一定的效果，仍需进一步探讨。

综上，局部注射阿司匹林可减少HS的产生，且在一定给药浓度范围内其抑瘢作用呈剂量依赖关系；阿司匹林通过抑制Wnt/β-catenin信号通路抑制兔耳HS生长；2%阿司匹林与40 mg/mL曲安奈德对HS有近似的疗效。

基金资助

海南省院士创新平台专项(ysptzx202028)。

This work was supported by the Innovation Platform for Academinicians of Hainan Province, China (ysptzx202028).

利益冲突声明

作者声称无任何利益冲突。

作者贡献

林志琥 数据统计，文章撰写和修订；韩笑、张孟瑶 数据收集整理；徐家钦、李海红 初稿审阅、修改；周建大、谢慧清 写作方向指导。所有作者阅读并同意最终的文本。

原文网址

http://xbyxb.csu.edu.cn/xbwk/fileup/PDF/202206698.pdf