结核分枝杆菌抗原Rv2654重组蛋白的表达和纯化及其诱导的免疫应答特征

Abstract

目的

随着卡介苗的保护效应日趋减弱，以及结核分枝杆菌耐药株的广泛存在，全球尚缺乏控制结核病的有效疫苗，全球结核病发病率和病死率仍然较高。本研究旨在分析结核分枝杆菌抗原Rv2654重组蛋白在诱导小鼠细胞免疫和体液免疫应答中的作用，评价其作为抗结核病候选疫苗的潜力。

方法

在细菌的对数生长期加入诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-beta-D-thiogalactoside，IPTG)诱导细菌表达Rv2654重组蛋白，用亲和层析纯化，蛋白质印迹法鉴定Rv2654重组蛋白。采用ELISA方法检测不同人群血清与Rv2654重组蛋白的免疫反应性。以Rv2654重组蛋白免疫昆明小鼠，采用细胞因子磁珠阵列法检测小鼠外周血Th1/Th2类细胞因子水平，并以流式细胞术分析小鼠脾T、B淋巴细胞亚群分布。

结果

成功表达Rv2654重组蛋白，以Rv2654重组蛋白作为抗原的ELISA结果显示其与卡介苗接种者或活动期结核患者血清均有反应性。Rv2654重组蛋白免疫小鼠可促进小鼠外周血IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-4、IL-6和IL-10等多种细胞因子表达(均P<0.05)，流式细胞术结果显示Rv2654重组蛋白可显著刺激CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞分化为效应T细胞，这种作用在联合卡介苗应用时更为明显，Rv2654重组蛋白也能刺激小鼠B细胞活化增殖并向记忆细胞分化。

结论

Rv2654重组蛋白可诱导小鼠的细胞免疫应答，而且与卡介苗接种者和活动性肺结核患者血清有较好的结合能力，有望作为结核病免疫学预防和诊断类疫苗的候选抗原。

结核分枝杆菌(Mycobacterium Tuberculosis，M.tb)是导致结核病(tuberculosis，TB)的病原体。据2020年WHO的TB研究报告，全世界每年约有996万新病例发生，至少有300万人死于该病，发展中国家的发病率和病死率明显高于发达国家^[1]。中国是TB高发国家之一，2019年中国的TB新发人数为83.3万人，每年约占世界TB新发人数的8.9%^[2]。近年来逐渐增多的耐多药TB(multi-drug resistant tuberculosis，MDR-TB)和广泛耐药TB(extensively drug resistant tuberculosis，XDR-TB)对全世界防治TB造成了极大的障碍和困扰，也给患者家庭带来了极大的经济与心理负担^[3]。目前临床上防控TB的最有效措施仍然是注射卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin，BCG)，而BCG也是目前唯一被WHO批准用于预防TB的疫苗。虽然BCG对儿童有很好的预防结核作用，但对成年人的保护作用有限^[4]。因此，从TB的特异性诊断、预防和控制其传播流行环节以及提高疗效等角度考虑^[5]，筛选更加有效的TB候选疫苗已经成为WHO和相关从业人员必须面对和亟需解决的重大科研课题。

DNA芯片技术分析表明M.tb H37Rv标准菌株有一段基因片段在BCG的基因序列中缺失^[6]，这些片段被命名为缺失序列(region of deletion，RD)，该序列所编码的蛋白质产物是TB新疫苗的候选区域。目前共发现了16个缺失区域，分别命名为RD1~16，其中RD13区域编码产物是Rv2654蛋白^[7]，其在M.tb中具有较高的特异性^[8]，引起了许多研究者的关注，但以前的研究^{[5, 9]}多局限于Rv2654诊断TB的方面。考虑到Rv2654基因序列是BCG基因组的缺失基因，其编码的蛋白质产物诱导的免疫应答可能会填补BCG诱导的保护性免疫的部分缺陷，该蛋白质产物可以作为新的诊断标志物，即Rv2654可能是研发新的TB候选疫苗的靶点之一。本课题组的前期研究从M.tb H37Rv中成功克隆了Rv2654基因，构建重组质粒并转染大肠埃希菌，获得了能表达Rv2654重组蛋白的工程菌E.coli BL21(DE3)-Pet32a-Rv2654。本研究拟用E.coli BL21(DE3)-Pet32a-Rv2654表达Rv2654重组蛋白，并通过动物实验和临床TB患者血清检测重组蛋白的免疫原性和免疫反应性，探讨Rv2654蛋白作为TB候选疫苗的潜力。

1. 材料与方法

1.1. 菌株、培养基和试剂

用于表达重组蛋白的工程菌株E.coli BL21(DE3)-Pet32a-Rv2654由本课题组在前期工作中构建完成。LB培养液于实验室自配，诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-beta-D-thiogalactoside，IPTG)购自上海生工生物工程有限公司。结核抗体检测试剂盒由中国疾病预防控制中心传染病预防控制所万康林教授提供。考马斯亮蓝快速染色液(Cat. No: p1300)、低分子量蛋白质标志物(14.4~97.4 kD)、脱脂奶粉(Cat. No: PR1400)、聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)(Cat. No: ISEQ00010)和兔抗人-IgG(Cat. No: SA201)均购自北京索莱宝科技有限公司。细胞因子检测试剂盒(Cat: 560484)和流式细胞实验用的单克隆抗体试剂盒都购自美国BD公司。

1.2. 实验动物

32只雄性昆明小鼠，10周龄，体重(22.50±0.58) g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司。

1.3. 临床资料

收集2015年1月1日至8月31日就诊于湖南省胸科医院的呼吸道疾病患者或健康体检者的血清标本。标本来自：1)100例健康体检者，其中男54例，女46例，年龄(67.47±12.04)岁；2)100例经肺部CT扫描和痰培养阳性确定的肺结核患者，其中男58例，女42例，年龄(62.50±13.04)岁；3)100例通过临床症状、肺部CT扫描和痰培养阴性排除结核的其他呼吸道疾病患者，包括肺炎链球菌感染者15例、支原体感染者36例、衣原体等感染者5例、非结核性肺部炎症患者44例，其中男66例，女34例，年龄(68.50±13.04)岁。所有血清样本均在湖南省胸科医院检验科完成相关检测后收取，血清收集后储存于-20 ℃冰箱备用。所有患者签署知情同意书。本研究获得湖南省胸科医院医学伦理委员会批准(批准号：KY-2013043001)。

1.4. 重组蛋白的表达、纯化和鉴定

将工程菌E.coli BL21(DE3)-Pet32a-Rv2654在LB培养液中培养到OD值达到1.0时，取100 µL菌液加入10 mL LB培养液，并加入氨苄青霉素使其终浓度为100 µg/µL，置于摇床中震荡培养至OD值0.6~0.8时加入浓度为1 mol/L的IPTG 1 μL，继续诱导培养4 h，经高速冷冻离心机离心后收集菌体。以20 mmol/L Tris-HCl洗涤沉淀3次，再用结合缓冲液稀释、重悬菌体，并于冰浴条件下采用超声破碎细菌，用镍琼脂糖凝胶(Ni-NTA)亲和层析对上清液进行纯化，纯化产物作考马斯亮蓝染色和蛋白质印迹法分析。蛋白质印迹法的步骤如下：取一定量蛋白质经SDS-PAGE后，将蛋白质在200 mA电流条件下转入预先用甲醇激发的PVDF膜中，将1꞉2 000稀释的抗His标签鼠单克隆抗体与PVDF膜在室温下孵育2 h。用含有1%吐温-20的PBS(PBST)洗涤3次后，用1꞉4 000辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗鼠IgG在室温下孵育1 h，然后再洗涤3次，在化学发光成像系统中观察条带并拍照保存。

1.5. ELISA法检测重组蛋白与结核患者血清反应性

取上述纯化的10 µL Rv2654重组蛋白(2.5 µg/µL)作为包被抗原，分别加入100例健康体检者、100例痰培养阳性的TB患者和100例痰培养阴性的其他呼吸道疾病患者血清中，以ELISA间接法检测其反应性抗体，并且用结核抗体诊断试剂盒检测结果作对照，分析重组蛋白的血清反应性。

1.6. 细胞因子磁珠阵列法检测细胞因子的表达

将32只10周龄雄性昆明小鼠按每组8只随机分为4组：Rv2654重组蛋白组、Rv2654重组蛋白+BCG组、BCG组和PBS组。分别以200 µg/mL的Rv2564重组蛋白、200 µg/mL的Rv2564重组蛋白和同样浓度的BCG的1꞉1乳化混合液、200 µg/mL的BCG以及 1 mol/L的PBS各0.25 mL，于第1、8、22、36和50天对相应组的小鼠作皮下多点注射。最后一次注射后第2天摘除小鼠眼球，留取血液于EP管并收集血清。按Th1/Th2细胞因子检测试剂盒说明书的细胞因子磁珠阵列法操作，检测Th1类细胞因子IL-2、IFN-γ、TNF-α和Th2类细胞因子IL-4、IL-6、IL-10的浓度。

1.7. 流式细胞术检测免疫细胞

采血后，以颈椎脱臼法处死小鼠，取其脾脏后，用匀浆器匀浆，过滤获取单细胞悬液。用Hank's液洗涤细胞2次，将洗涤后的细胞悬液缓慢加入小鼠淋巴细胞分离液的液面之上，以2 000 r/min离心20 min，分离并洗涤小鼠脾细胞后，用细胞计数池计数并调整细胞浓度为1×10⁶个/mL。按以下方案染色。

B细胞检测：第1管加入CD19-PE-percp-cy5.5、CD45R-PEcyTM7、CD138-APC-MAB，第2管加入CD19-PE-percp-cy5.5，第3管加入CD45R-PEcyTM7，第4管加入CD138-APC-MAB。

T细胞检测：第1管加入CD3-APC-cy7、CD4-BV510、CD8-FITC、CD62L-PE、CD44-BV421，第2管加入CD3-APC-cy7，第3管加入CD4-BV510，第4管加入CD8-FITC，第5管加入CD62L-PE，第6管加入CD44-BV421。

标记的细胞在FACSCalibur流式细胞仪(Becton Dickinson，San Jose，CA，USA)上进行检测，并使用FlowJov10软件分析数据。

1.8. 统计学处理

采用SPSS 20.0统计软件对数据进行分析，计量资料采用均数±标准差( $\overline{x}$ ±s)表示，两组比较采用t检验，多组比较采用单因素方差分析，率的比较采用χ²检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2. 结 果

2.1. 重组蛋白的表达、纯化和鉴定结果

表达的重组Rv2654蛋白经Ni-NTA树脂纯化柱纯化，SDS-PAGE结果显示分离的目的蛋白分子量大约为31 kD(图1A)。洗脱液中随着咪唑浓度增加，杂蛋白质逐渐减少，当洗脱液中咪唑浓度为50 mmol/L时可获得纯化的Rv2654重组蛋白。利用临床TB患者血清(稀释度1꞉80)进行蛋白质印迹法分析，结果显示在分子量大约为31 kD的位置有单一特异性条带(图1B)，进一步证明Rv2654重组蛋白表达成功。

图1.

Rv2654蛋白的表达与纯化

Figure 1 Expression and purification of Rv2654 protein

A: Rv2654 protein was expressed by E.coli strain, then was purified on a Ni-NTA resin purification column. After elution with imidazole, Rv2654 protein was concentrated and performed SDS-PAGE. 1: Bacterial lysate; 2: Penetration liquid; 3: 20 mmol/L imidazole eluent; 4: 50 mmol/L imidazole eluent; 5-8: 300 mmol/L imidazole eluent; M: Marker. B: Monoclonal antibody with His-tag from mouse (dilution 1꞉ 2 000) was used by Western blotting.

2.2. Rv2654蛋白可被TB患者血清识别

采用Rv2654重组蛋白以及结核抗体检测试剂盒对临床血清样本进行检测，结果显示：活动性TB患者、非结核性呼吸道疾病患者、健康体检者血清Rv2654重组蛋白反应性抗体阳性检出率分别为72%，39%，31%，而采用结核抗体检测试剂盒的检出率为77%，33%，34%(表1)。提示Rv2654重组蛋白和结核抗体检测试剂盒都能结合BCG接种过的个体(所有人群)或活动性肺结核患者血清中的反应性抗体，对这些个体中的反应性抗体有一定的诊断作用；且Rv2654对活动性肺结核患者的抗体检出率与试剂盒的检出率差异无统计学意义(P>0.05)。

表1.

不同检测对象血清中反应性抗体的检测结果

Table 1 Test results of reactive antibodies in serum of different samples

检测对象	检测方法	检测结果
		+	-	阳性率/%
健康体检者	试剂盒ELISA	34	66	34
	Rv2654-ELISA	31	69	31*
非TB呼吸道疾病 患者	试剂盒ELISA	33	67	33
	Rv2654-ELISA	39	61	39*
TB患者	试剂盒ELISA	77	23	77
	Rv2654-ELISA	72	28	72*

与试剂盒ELISA阳性率比较，*P>0.05，Rv2654-ELISA指以Rv2654为包被抗原的ELISA。

2.3. Rv2654蛋白诱导小鼠的Th1和Th2免疫应答

采用CBA法检测小鼠血清细胞因子水平，发现Rv2654联合BCG刺激小鼠后可促进IFN-γ、TNF-α、IL-2分泌，同时还使IL-4、IL-6和IL-10表达水平升高。Rv2654重组蛋白单独使用或联合BCG均显著促进IL-4、IL-6和IL-10的表达(均P<0.05，图2)。

图2.

细胞因子磁珠阵列法检测小鼠外周血中的细胞因子

Figure 2 Detection of cytokines in the peripheral blood of mice by cytokine magnetic bead arrays *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001.

2.4. Rv2654蛋白增加小鼠记忆T细胞、记忆B细胞 及浆细胞的比例

Rv2654蛋白联合BCG可显著刺激CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞分化成效应T细胞，单独注射Rv2654蛋白也能诱导较多的CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞转化成记忆T细胞，但刺激效果不如Rv2654重组蛋白联合BCG(60.4% vs 38.2%，51.9% vs 9.97%，均P<0.05；图3A)。

图3.

流式细胞术检测小鼠体内淋巴细胞亚群分布特征

Figure 3 Distribution of lymphocyte subsets in mice detected by flow cytometry

A: T cell tubes were stained with CD3-APC-cy7, CD4-BV510, CD8-FITC, CD62L-PE, and CD44-BV421 monoclonal antibodies. B cell tubes were stained with CD19-PE-percp-cy5.5, CD45R-PEcyTM7, and CD138-APC-MAB monoclonal antibodies. CD3⁺CD4⁺CD8^-CD62L^- subpopulations increase in all 3 groups except PBS. Rv2654 protein combined with BCG group is particularly obvious. Rv2654 protein combined with BCG can significantly stimulate CD4⁺T and CD8⁺T cells to differentiate into effector and memory T cells. B: There is a significant increase in the number of B cells in the Rv2654 group, the BCG group, and the Rv2654+BCG group (all CD19⁺ cells).

无论是单独注射Rv2654蛋白、BCG还是Rv2654蛋白+BCG均可显著诱导CD19⁺CD45R⁺CD138^-的B细胞数量明显增多，Rv2654重组蛋白组和BCG组的结果差异无统计学意义(P>0.05)，两组的CD19⁺CD45R⁺CD138^-B细胞数量都低于Rv2654+BCG组，但高于PBS组(图3B)。

3. 讨 论

由于BCG缺失了一段M.tb基因组序列以及耐药M.tb的不断增加，因此造成了BCG预防效果不断降低^[10]的局面；H37Rv标准菌株的RD13区域编码的Rv2654蛋白是众多受到关注的结核候选疫苗蛋白中的一员。本研究利用纯化重组蛋白作蛋白质印迹时发现：1꞉2 000稀释的抗His标签鼠IgG单抗能很好地结合Rv2654重组蛋白，加入羊抗鼠IgG后可看到特征性的分子量31 kD的蛋白条带，表明目的蛋白成功表达。以此重组蛋白为包被抗原的ELISA法结果进一步证实了Rv2654重组蛋白的这一特性。我们认为，Rv2654重组蛋白之所以能与部分健康体检者血清和非结核性呼吸道疾病患者血清结合，是因为这些个体大多数都接种过BCG，尽管Rv2654基因是BCG的缺失基因，其编码产物仍然可能与BCG存在共同抗原而引起交叉反应。一些新研发的TB诊断性疫苗之所以没被推广应用的一个原因就是疫苗与受检者血清反应性较差，从此角度看，Rv2654蛋白可作为筛选诊断类疫苗的参考标志分子。

Rv2654蛋白免疫小鼠后，被检测的细胞因子表达均出现了不同程度的上调，可能是由于IFN-γ、TNF-α和IL-2属于Th1类细胞因子，与IL-4、IL-6、IL-10等Th2类细胞因子之间是相互抑制的。我们推测重组蛋白同时诱导了Th1和Th2类免疫应答，但在细胞因子水平还未出现应答的倾向性。M.tb属于胞内寄生菌，细胞免疫对抗M.tb感染具有十分重要的作用^[10]。IFN-γ可上调节NK细胞和CD8⁺T细胞的活性，因此Rv2654蛋白促进IFN-γ分泌导致细胞免疫应答效应增强。Rv2654蛋白还有效提高TNF-α和IL-2的表达，其中TNF-α可促进CD4⁺Th0细胞向CD4⁺Th1细胞亚群分化^[11-12]，后者可介导细胞免疫，提高CD8⁺T细胞和NK细胞的抗结核效应。本研究观察到Rv2654蛋白可增加IL-4、IL-6和IL-10细胞因子的表达水平，这些细胞因子主要由CD4⁺Th2细胞分泌，可介导体液免疫应答，但它们介导的体液免疫对机体的保护效果还有待研究。IL-6可抑制巨噬细胞活性^[13-15]，IL-10可降低IL-2的分泌而抑制巨噬细胞，使M.tb得以在巨噬细胞内寄生^[16]。Rv2654蛋白能同时诱导Th1型和Th2型细胞因子表达，表明其对机体免疫系统的作用可能很复杂。本研究发现Rv2654诱导的Th2型细胞因子主要以IL-6为主，IL-6在胞内病原体感染中有其独特的特点，既能诱导Th2型免疫应答，又能促进胞内病原体产生免疫逃逸，Th2类细胞因子水平的升高可能是疫苗注射后的应激性增高。

流式细胞术检测进一步发现Rv2654蛋白联合BCG时可显著刺激CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞分化成效应T细胞和记忆性T细胞。CD62L分子主要表达于初始CD4⁺T或CD8⁺T细胞，消失可作为CD4⁺T或CD8⁺T细胞活化的表面标志之一；CD44则主要表达于记忆性的CD4⁺或CD8⁺T细胞。Rv2654蛋白单独或联合BCG刺激后的小鼠CD44⁺CD62L^-T细胞数量和比例明显增多，提示这群细胞是主要的记忆性T细胞，同时也参与T淋巴细胞的归巢^[17]。Rv2654蛋白刺激后能迅速动员CD4⁺T细胞，说明Rv2654蛋白有较强的免疫原性，CD8⁺T细胞亚群的变化情况与CD4⁺T相似，但由于CD8⁺T细胞的数量较少，因此变化趋势不如CD4⁺T细胞显著。在对B细胞亚群的分析中，本研究选择B细胞的共同标志物CD19、CD45R和CD138，由于CD45R表达于除浆细胞外的绝大多数B细胞^[18]，而CD138是浆细胞特征性标志^[19]，在实验中注射Rv2654蛋白或联合BCG处理后CD19⁺CD45R⁺CD138^-的B细胞数量明显增多，CD19⁺CD45R⁺CD138⁺的B细胞比例却非常低，从该结果推测在免疫应答的效应期，诱导B细胞分化成浆细胞产生抗体的能力相对较弱，因此浆细胞数量较少。

综上所述，本研究初步探讨了Rv2654蛋白免疫小鼠产生免疫应答的特点，发现Rv2654蛋白有良好的免疫原性和抗原性，其诱导的免疫应答以细胞免疫应答为主，对活动性肺结核患者外周血的良好反应性提示Rv2654蛋白有望成为研发新型结核疫苗的候选抗原。Rv2654蛋白诱导的体液免疫应答发挥的究竟是抗M.tb感染作用还是免疫逃逸作用，尚需进一步研究。

基金资助

国家“十二五”科技重大专项基金(2012ZX10005010-003)；湖南省自然科学基金(2020JJ4768)。

This work was supported by the National Science and Technology Major Special Projects during the 12th Five-Year Plan Period (2012ZX10005010-003) and the Natural Science Foundation of Hunan Province (2020JJ4768), China.

利益冲突声明

作者声称无任何利益冲突。

原文网址

http://xbyxb.csu.edu.cn/xbwk/fileup/PDF/202109925.pdf