Abstract
目的
对比幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，Hp)阳性及阴性胃癌和癌前病变组织中Wnt信号相关蛋白[Wnt3、β-连环蛋白(β-catenin)、基质金属蛋白酶-7(matrix metalloproteinase-7，MMP-7)]的表达，探讨Wnt信号通路参与胃癌形成的机制及其与Hp之间的关系。
方法
收集长沙市第一医院病理科2018年1月至2020年4月保存完整的已经病理确诊的石蜡标本，分为胃癌组(n=57)、癌前病变组(n=84)和慢性浅表性胃炎组(n=25)，各组标本均用改良Giemsa染色检测Hp感染后再分成Hp阳性亚组和Hp阴性亚组，采用免疫组织化学方法检测各组织标本Wnt3、β-catenin、MMP-7的表达。
结果
Wnt3、β-catenin、MMP-7在胃癌组和癌前病变组均呈高表达，Wnt3、MMP-7高表达于细胞质，β-catenin呈细胞膜向细胞质及细胞核转移的趋势，表现为“核易位”特点。胃癌组Wnt3、β-catenin、MMP-7表达的阳性率高于癌前病变组和慢性浅表性胃炎组，且随分化程度的恶化，呈逐步升高趋势，差异均有统计学意义(均 P<0.05)；同时，Wnt3、β-catenin、MMP-7在胃癌组和癌前病变组的Hp阳性亚组中的表达均明显高于Hp阴性亚组，差异均有统计学意义(均P<0.05)。
结论
Wnt信号通路的异常激活参与了胃癌前病变以及胃癌的发生、发展，并与Hp感染密切相关。同时，Wnt3、β-catenin和MMP-7有可能成为胃癌早期诊断的分子标志物及判断胃癌恶性程度的指标。
Keywords: Wnt信号通路, Wnt3, 胃癌, 癌前病变, 幽门螺杆菌, 免疫组织化学
Abstract
Objective
To compare the expression of the Wnt signaling-associated proteins (Wnt3, β-catenin, MMP-7) in gastric cancer and precancerous lesions with positive and negative Helicobacter pylori (H.pylori, Hp) infection, and to further explore the mechanisms underlying the Wnt signaling pathway involving in the formation of gastric cancer and its relationship with Hp infection.
Methods
The complete paraffin samples with pathologically confirmed diagnosis, who came from the First Hospital of Changsha from January 2018 to April 2020, were collected. All samples were randomly divided into a gastric cancer group (n=57), a precancerous lesion group (n=84), and a chronic superficial gastritis group (n=25). Improved Giemsa staining was used to detect Hp infection, and according the results of Hp infection the above groups were divided into a Hp positive subgroup and a negative subgroup. The expressions of Wnt3, β-catenin and MMP-7 were examined with immunohistochemistry.
Results
The Wnt3, β-catenin, and MMP-7 were highly expressed in the gastric cancer group and the gastric precancerous lesion group. The Wnt3 and MMP-7 were highly expressed in cytoplasm, and β-catenin showed a tendency of cell membrane transferring to cytoplasm and nucleus, which was characterized by “nuclear translocation”. The positive rates of the Wnt3, β-catenin, and MMP-7 expressions in the gastric cancer group were higher than those in the precancerous lesion group and the chronic superficial gastritis group (all P<0.05), which showed a gradually increasing trend with the deterioration of differentiation degree. In addition, the expressions of Wnt3, β-catenin, and MMP-7 in the Hp positive subgroup in the gastric cancer group and the precancerous lesion group were higher than those in the Hp negative subgroup (all P<0.05).
Conclusion
Aberrant activation of Wnt signaling pathway is involved in the occurrence and development of precancerous lesions and gastric cancer, and which is related with Hp infection. Meanwhile, the Wnt3, β-catenin and MMP-7 may be used as molecular markers for early diagnosis of gastric cancer and indicators to judge the degree of differentiation and malignancy of gastric cancer.
Keywords: Wnt signal pathway, Wnt3, gastric cancer, precancerous lesions, Helicobacter pylori, immunohistochemical method
胃癌是全球最常见的消化道恶性肿瘤之一，其发病率及病死率均高居消化道恶性肿瘤的第2位[1]。中国胃癌患者的早期诊断仅占少数，大部分患者诊断时已达中晚期，因此诊断和治疗后的5年生存率很低[2]。近年来，对该病的早期诊断和有效治疗成为了众多医疗工作者的研究热点。
根据公认的Correa模型[3]，胃组织从慢性浅表性胃炎进展至萎缩性胃炎、肠上皮化生、异型增生，最后转变为胃癌。幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，Hp)感染是诱发和促进这一过程的主要因素之一。Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)信号通路在胚胎发育、成熟细胞稳态、细胞增殖与分化中都起到了重要的作用，其异常激活可能参与胃癌的发生、发展[4]。2009年Ooi等[5]研究证实：超过70%的胃癌患者存在核因子-κB、Wnt/β-catenin和增殖干细胞3种致癌途径的失调，从而导致细胞炎症因子的增加、细胞凋亡异常、上皮细胞异常增殖/分化和上皮细胞的转化，尤其是在30%~50%的胃癌组织和多种胃癌细胞系中发现了Wnt信号通路的异常激活。Wnt/β-catenin信号通路是细胞中一条重要的、保守的信号转导途径，参与了胚胎发育、细胞增殖、分化与凋亡等生物学过程的调控。在正常状态下，该信号通路中β-catenin通过骨架蛋白Axin与酪蛋白激酶1α(casein kinase 1α，CK1α)、结肠腺瘤样息肉病蛋白(adenomatous polyposis coli，APC)、糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3β，GSK3β)共同构成降解复合体，通过其降解复合体生成与降解的动态平衡，维持细胞的生理状态。同时，β-catenin与E-钙黏蛋白(E-cadherin)在细胞膜结合，形成E-cadherin/β-catenin复合体，通过细胞间的黏附作用以稳定上皮细胞与细胞间的完整性。在病理状态下，Wnt配体可结合卷曲蛋白受体及低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6，导致β-catenin磷酸化被抑制而逃避泛素蛋白酶复合体系统的降解，随后β-catenin不断在细胞质中积累并向细胞核移位，进而结合转录因子T细胞因子/淋巴细胞增强因子，从而激活下游靶基因[细胞周期蛋白D1(cyclin D1)、c-myc、胃泌素、基质金属蛋白酶-7(matrix metalloproteinase-7，MMP-7)等]过表达，参与肿瘤的形成[6-7]。
本研究分析2018年至2020年在长沙市第一医院(以下简称我院)收集的胃镜下胃黏膜活检的石蜡标本和手术胃标本，通过检测并对比胃癌、胃癌前病变和慢性浅表性胃炎中Hp阳性和阴性患者间Wnt信号通路中的3个重要蛋白Wnt3、β-catenin和MMP-7的表达情况，旨在探讨Wnt信号通路参与胃癌形成的机制及其与Hp之间的联系。
1. 材料与方法
1.1. 标本收集及分组
回顾性收集我院病理科2018年1月1日至2020年4月30日保存完好(包括胃镜下胃黏膜活检及术后胃标本)并经病理确诊的胃癌石蜡标本170例，利用随机数字生成工具，随机选取上述170例胃癌标本中的57例(胃癌组)，其中低分化腺癌32例、中分化腺癌16例、高分化腺癌9例。同时，随机收集同时段胃癌前病变标本84例(肠化胃黏膜48例、异型增生36例)作为癌前病变组，慢性浅表性胃炎25例作为慢性浅表性胃炎组进行对照。
1.2. Hp 检测及分组
所有石蜡标本均采用改良Giemsa萨染色法检测Hp感染。阳性标准：镜下可见Hp呈淡蓝色或蓝色，细菌形态为弧形或杆状。根据结果，将随机收集的胃癌组、胃癌前病变组和慢性浅表性胃炎组标本再分为Hp阳性亚组和阴性亚组。
1.3. 主要试剂
兔抗人Wnt3多克隆抗体购自美国Abcam公司；小鼠抗人β-catenin单克隆抗体购自美国Proteintech公司；小鼠抗人MMP-7单克隆抗体购自美国Origene公司；即用型EnVisionTM FLEX/HRP二抗购自丹麦Dako公司。
1.4. 免疫组织化学检测及结果判定
采用免疫组织化学(以下简称免疫组化)染色法检测各组Hp阳性亚组及阴性亚组的组织标本Wnt3、β-catenin、MMP-7的表达。将组织切片烤片；用二甲苯浸泡，脱蜡和乙醇水化；PBS浸洗；在柠檬酸盐缓冲液中进行抗原修复；冷却后用PBS浸洗；采用3%H2O2去离子水消除内源性过氧化物酶的活性；PBS浸洗；山羊血清封闭；滴加Wnt3抗体(1꞉150比例滴加)、β-catenin抗体(1꞉5 000 比例滴加)和MMP-7抗体(1꞉150比例滴加)(阴性对照用PBS代替一抗)；在4 ℃下过夜；PBS浸洗；滴加结合了过氧化物酶分子和抗兔及小鼠免疫球蛋白的羊二抗；PBS浸洗；滴加DAB显色剂，在显微镜下控制染色，终止显色反应；Harris苏木精复染数秒后用自来水冲洗；乙醇、二甲苯脱水透明；中性树胶封片；在光学显微镜下观察并拍照。所有切片用Olympus光学显微镜进行观察并采集图像。在低倍镜及高倍镜下观察，对比各组Hp阳性、Hp阴性亚组中低分化腺癌、中分化腺癌、高分化腺癌、肠化胃黏膜、异型增生胃黏膜及慢性浅表性胃炎的3种蛋白质的表达。参照Axiotis标准[8]，在高倍镜(×400)下读片，每张切片随机选取10个不重复的视野进行观察，按阳性细胞占比及着色强度进行综合评分。阳性细胞占比计分如下：<10%计0分，10%~40%计1分，41%~70%计2分，>70%计3分。阳性细胞着色程度计分如下：不着色计0分，浅黄色或黄色计1分，棕黄色计2分，黄褐色计3分。将阳性细胞着色程度与阳性细胞占比的相加结果划分为4个等级，其中0~1分为阴性(-)，2分为弱阳性(+)，3~4分为阳性(++)，5~6分为强阳性(+++)。
1.5. 统计学处理
采用SPSS 19.0统计学软件进行数据分析，所有计量资料以均数±标准差( ±s)表示，多组间比较采用方差分析，组内两两比较采用LSD-t检验；计数资料以百分比形式表示，采用χ2检验；以P<0.05为差异有统计学意义。
2. 结 果
2.1. 胃癌及癌前病变Wnt3、β-catenin和MMP-7的表达
免疫组化染色结果显示：Wnt3、β-catenin、MMP-7在胃癌组及胃癌前病变组中均呈高表达，表达强度在阳性(++)和强阳性(+++)之间。Wnt3、MMP-7呈细胞质阳性表达(图1~2)；慢性浅表性胃炎组中，β-catenin主要表达于细胞膜上，而胃癌组及胃癌前病变组中，β-catenin则在细胞质中积累后转运至细胞核内，呈现出“核易位”特点(图3)。
图1.
慢性浅表性胃炎组、胃癌组及癌前病变组Wnt3的表达(免疫组化染色，×100)
Figure 1 Expression of Wnt3 in the chronic superficial gastritis group, the gastric cancer group, and the precancerous lesion group (immunohistochemistry staining, ×100)
A: Expression of Wnt3 in the chronic superficial gastritis group; B: Expression of Wnt3 in poorly differentiated adenocarcinoma in the gastric cancer group; C: Expression of Wnt3 in moderately differentiated adenocarcinoma in the gastric cancer group; D: Expression of Wnt3 in well differentiated adenocarcinoma in the gastric cancer group; E: Expression of Wnt3 in the atypical hyperplasia in the precancerous lesion group; F: Expression of Wnt3 in the gastric intestinal metaplasia in the precancerous lesion group.
图2.
慢性浅表性胃炎组、胃癌组及癌前病变组MMP-7的表达(免疫组化染色，×100)
Figure 2 Expression of MMP-7 in the chronic superficial gastritis group, the gastric cancer group and the precancerous lesion group (immunohistochemistry staining, ×100)
A: Expression of MMP-7 in the chronic superficial gastritis group; B: Expression of MMP-7 in the poorly differentiated adenocarcinoma in the gastric cancer group; C: Expression of MMP-7 in moderately differentiated adenocarcinoma in the gastric cancer group; D: Expression of MMP-7 in well differentiated adenocarcinoma in the gastric cancer group; E: Expression of MMP-7 in the atypical hyperplasia in the precancerous lesion group; F: Expression of MMP-7 in gastric intestinal metaplasia in the precancerous lesion group.
图3.
慢性浅表性胃炎组、胃癌组及癌前病变组β-catenin的表达(A~F：免疫组化染色，×100；a~f：免疫组化染色，×200)
Figure 3 Expression of β-catenin in the chronic superficial gastritis group, the gastric cancer group, and the precancerous lesion group (A-F: Immunohistochemistry staining, ×100; a-f: Immunohistochemistry staining, ×200)
A-F: Expression of β-catenin in the chronic superficial gastritis group (A), the poorly differentiated adenocarcinoma in the gastric cancer group (B), the moderately differentiated adenocarcinoma in the gastric cancer group (C), the well differentiated adenocarcinoma in the gastric cancer group (D), the atypical hyperplasia in the precancerous lesion group (E) and the gastric intestinal metaplasia in the precancerous lesion group (F); a-f: Local amplification is respectively corresponded to the black frame of A-F, which shows that β-catenin has tendency of transferring from cell membrane to cytoplasm and nucleus in the chronic superficial gastritis group, the gastric cancer group and the precancerous lesion group.
胃癌组和癌前病变组3种蛋白质阳性率均显著高于慢性浅表性胃炎组(均P<0.05)。同时，胃癌组3种蛋白质的阳性率也显著高于癌前病变组(均P<0.05)。在胃癌组标本中，高分化腺癌、中分化腺癌及低分化腺癌Wnt3阳性率分别为77.78%(7/9)、81.25%(13/16)和87.50%(28/32)；β-catenin阳性率分别为77.78%(7/9)、81.25%(13/16)和90.63%(29/32)；MMP-7阳性率分别为66.67%(6/9)、75.00%(12/16)和84.38%(27/32)，随着分化程度的降低，3种蛋白质的阳性率升高，差异均有统计学意义(均P<0.05，表1)。
表1.
Wnt3、β-catenin和MMP-7在慢性浅表性胃炎组、胃癌组及癌前病变组中的表达
Table 1 Expression of Wnt3, β-catenin and MMP-7 in the chronic superficial gastritis group, the gastric cancer group and the precancerous lesion group
| 组别 | n | Wnt3 | β-catenin | MMP-7 | ||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| (-)/例 | (+)/例 | 阳性率/% | (-)/例 | (+)/例 | 阳性率/% | (-)/例 | (+)/例 | 阳性率/% | ||
| 慢性浅表性胃炎组 | 25 | 20 | 5 | 20.0 | 23 | 2 | 0.08 | 21 | 4 | 0.16 |
| 胃癌组 | ||||||||||
| 低分化腺癌 | 32 | 4 | 28 | 87.50*† | 3 | 29 | 90.63*† | 5 | 27 | 84.38*† |
| 中分化腺癌 | 16 | 3 | 13 | 81.25*† | 3 | 13 | 81.25*† | 4 | 12 | 75.00*† |
| 高分化腺癌 | 9 | 2 | 7 | 77.78*† | 2 | 7 | 77.78*† | 3 | 6 | 66.67*† |
| 癌前病变组 | ||||||||||
| 异型增生 | 36 | 14 | 22 | 61.11* | 17 | 31 | 64.58* | 13 | 23 | 63.89* |
| 肠上皮化生 | 48 | 18 | 30 | 62.50* | 15 | 21 | 58.33* | 18 | 30 | 62.50* |
与慢性浅表性胃炎组比较，*P<0.05；与癌前病变组比较，†P<0.05。
2.2. 胃癌及胃癌前病变Wnt、β-catenin和MMP-7表达与 Hp 感染的关系
2.2.1. Hp感染在胃癌和癌前病变组织中显著增高
57例胃癌标本中有42例呈现Giemsa染色阳性，其中低分化腺癌24例、中分化腺癌12例、高分化腺癌6例；84例胃癌前病变标本中有46例呈现Giemsa染色阳性，其中肠化胃黏膜25例、异型增生21例(表2)。综上所述，胃癌组及癌前病变组Hp感染率分别为73.7%(42/57)、54.8%(46/84)，而对照组Hp感染率为24%(6/25)。胃癌组Hp感染率明显高于癌前病变组和对照组，而癌前病变组Hp感染率又明显高于对照组，差异均具有统计学意义(均P<0.05)。
表2.
Wnt3、β-catenin和MMP-7在所有 Hp 阴性及阳性亚组中的表达
Table 2 Expression of Wnt3, β-catenin and MMP-7 in all negative (-) or positive (+) Hp infection subgroups
| 组别 | n | Wnt3 | β-catenin | MMP-7 | |||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| (-)/例 | (+)/例 | (-)/例 | (+)/例 | (-)/例 | (+)/例 | ||
| 慢性浅表性胃炎组 | 25 | ||||||
| Hp(+) | 6 | 3 | 3 | 4 | 2 | 3 | 3 |
| Hp(-) | 19 | 17 | 2 | 19 | 0 | 19 | 2 |
| 胃癌组 | 57 | ||||||
| Hp(+) | 42 | 3 | 39 | 4 | 38 | 5 | 37 |
| Hp(-) | 15 | 6 | 9 | 4 | 11 | 7 | 8 |
| 癌前病变组 | 84 | ||||||
| Hp(+) | 46 | 16 | 30 | 14 | 32 | 13 | 33 |
| Hp(-) | 38 | 16 | 22 | 18 | 20 | 18 | 20 |
2.2.2. Hp感染与Wnt3、β-catenin、MMP-7表达
在42例胃癌组和46例癌前病变组的Hp阳性亚组中，Wnt3、β-catenin、MMP-7表达的阳性率分别为92.86%(39/42)和65.22%(30/46)、90.48%(38/42)和69.57%(32/46)、88.10%(37/42)和71.74%(33/46)；15例胃癌组和38例癌前病变组Hp阴性亚组，Wnt3、β-catenin、MMP-7表达的阳性率分别为60.00%(9/15)和57.89%(22/38)、73.33%(11/15)和52.63%(20/38)、53.33%(8/15)和52.63%(20/38)。Wnt3、β-catenin、MMP-7在胃癌组及癌前病变组Hp阳性亚组中的表达高于Hp阴性亚组，差异均有统计学意义(均P<0.05，表2)。
3. 讨 论
胃癌是临床常见的恶性肿瘤之一，其发生、发展是一个由多因素、多基因和多步骤协同参与的演变过程。众多学者[9-10]认为，胃癌的发生和进展是由炎症应激、致瘤蛋白的激活、表观遗传机制、局部微环境和宿主遗传易感性共同决定的，其中Hp的慢性感染为主要诱发因素之一。
Hp是目前已知的能在胃内定植的微生物，作为胃癌的I类致癌因子，其慢性持续感染可诱导Correa模式进展，导致胃黏膜细胞恶性转化并最终进展为胃癌。同时，根除Hp可对上述癌前病变进行有效逆转，从而降低胃癌的发生风险。关于Hp参与胃癌发生、发展的机制，学者们[11-13]认为Hp感染可能作为始动因子产生多种毒力因子[细胞毒素相关基因A(cytotoxin-associated gene A，CagA)、空泡毒素A(vacuolating cytotoxin A，VacA)、Cag致病岛等]作用于胃上皮细胞，激活胃上皮细胞内的多种异常活动信号，如核因子κB信号途径、细胞外信号调节激酶/丝裂原激活蛋白激酶途径、磷脂酰肌醇3-激酶蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白途径等，进而影响各种细胞功能，导致炎性细胞因子产生增加、凋亡率改变、上皮细胞增殖和分化，最终导致上皮细胞致瘤转化。
本研究显示：胃癌组Hp感染阳性率为73.7%，癌前病变组为54.8%，而慢性浅表性胃炎组Hp感染阳性率为24%，说明Hp感染与胃癌和癌前病变的发生、发展密切相关。本研究的结果与之前其他学者[14]关于约70%的胃癌患者与Hp感染密切相关的报道相似。同时，免疫组化染色结果显示：慢性浅表性胃炎组Wnt3、MMP-7呈阴性表达，β-catenin正常表达于细胞膜上；而在胃癌组和癌前病变组中，Wnt3、MMP-7高表达于细胞质，β-catenin表达呈细胞膜向细胞质及细胞核转移的趋势，表现为“核易位”特点。3种蛋白质在胃癌组的表达阳性率高于癌前病变组，后者则显著高于慢性浅表性胃炎组。本研究的数据还显示：这些蛋白质在Hp阳性亚组中的表达明显高于Hp阴性亚组。本研究不仅支持胃癌存在Wnt信号通路的异常激活的论点，而且提示Wnt信号通路在致瘤转化过程的早期就开始发挥作用(即癌前病变的发生)，Hp感染具有积极作用，其可能通过调控Wnt信号通路参与胃癌前病变发生及其癌变进程。
胃癌往往由于早期症状不典型而发展为进展期胃癌，从而错过最佳手术时期，其早期转移及高侵袭特性是导致胃癌病死率居高不下的重要原因。细胞的黏附和运动的变化被认为是决定肿瘤侵袭和转移的关键，上皮间质转化[15](epithelial mesen-chymal transition，EMT)的异常活化被认为是包括胃癌在内的肿瘤进展的主要途径。E-cadherin作为细胞连接和极性所必需的主要蛋白质，其下调标志着EMT进程的发生，该过程中上皮细胞经历了表型修饰和失去极性，转化为间充质细胞，从而获得迁移和侵袭的能力。由于Wnt信号通路的激活，β-catenin在细胞质积累并向细胞核移位，E-cadherin/β-catenin复合体解体，细胞间黏附作用及细胞的完整性遭到破坏，因此Wnt/β-catenin被认为是EMT的调控信号，其组件的突变将导致胃癌的起始和扩散[15-16]。同时，MMP-7作为MMP家族成员之一，是Wnt信号通路的下游靶基因，其对细胞外基质细胞的相互连接起着重要的控制作用，参与基底膜和细胞外基质分解过程，从而造成肿瘤侵袭、转移[17-18]。本研究还发现：在所有胃癌标本中，高分化腺癌、中分化腺癌及低分化腺癌Wnt3阳性率分别为77.78%、81.25%和87.50%，β-catenin阳性率分别为77.78%、81.25%和90.63%，MMP-7阳性率分别为66.67%、75.00%和84.38%，3种蛋白质的阳性率随着胃癌的分化程度恶化呈现出逐步升高趋势。结果提示Wnt3、β-catenin和MMP-7具有反映胃癌浸润、转移的潜能，因此其可作为判断胃癌恶性程度的预测因子。
综上所述，Wnt3作为Wnt信号通路的配体，可启动Wnt信号通路级联反应激活，从而参与胃癌前病变以及胃癌的发生、发展，下调或抑制Wnt3可能成为逆转胃癌前病变及治疗胃癌的潜在方向。同时，Wnt3、β-catenin和MMP-7有可能成为胃癌早期诊断的分子标志物及判断胃癌的分化恶性程度的指标。
基金资助
湖南省卫生健康委员会科研计划项目(B2019134)。
This work was supported by the Scientific Research Plan Project of the Health Commission of Hunan Province, China (B2019134).
利益冲突声明
作者声称无任何利益冲突。
原文网址
http://xbyxb.csu.edu.cn/xbwk/fileup/PDF/202106575.pdf
参考文献
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