心磷脂变化参与非酒精性脂肪性肝病相关线粒体功能障碍的发生和发展

Abstract

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是最常见的肝疾病之一，其发生常伴随着线粒体功能障碍。心磷脂作为线粒体内膜的特殊脂质，其任何改变都有可能引起一系列线粒体相关疾病。心磷脂含量的变化、心磷脂重构后脂肪酸侧链的组成变化及心磷脂重构酶的含量改变在NAFLD相关线粒体功能障碍的发生和发展中发挥着重要的作用。

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是成人及儿童中最常见的肝疾病之一，影响着全球范围内很大比例的人口^[1]。近期一项研究^[2]通过系统回顾和荟萃分析，评估了近10年中国NAFLD的现状，结果显示中国NAFLD患病率为29.2%。预计到2030年，中国将成为全球NAFLD患病率增长最快的国家，达到3.1458亿例^[3]。而NAFLD作为肝细胞癌的主要病因之一^[4]，其患者发生肝细胞癌的风险比正常人群要高出2~3倍^[5]。

研究^[6]证明线粒体功能障碍与NAFLD息息相关。心磷脂作为线粒体内膜的特殊脂质，在NAFLD线粒体功能障碍中起着重要的作用。本文主要论述心磷脂在NAFLD线粒体功能障碍的机制研究中的进展，以期为NAFLD的治疗干预提供新的方法。

1. NAFLD与线粒体功能障碍

NAFLD的疾病谱包括单纯性脂肪变性、非酒精性脂肪肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)、肝纤维化、肝硬化及隐源性肝硬化、末期肝病等^[7-8]，其中NASH的组织学特征是脂肪变性伴坏死性炎症改变，与纤维化进展、肝硬化、肝癌的高风险相关^[9]。氧化应激、炎症、线粒体功能障碍和胰岛素抵抗都参与了NAFLD发病的病理、生理过程^[10]。而线粒体功能障碍在NAFLD的病理、生理中起着关键的作用^[6]。Sanyal等^[11]通过透射电子显微镜观察肝活检组织切片，发现相较于正常肝，患有NASH的线粒体展现出超微结构的损伤，另外在线粒体内部还可见许多亚晶状包涵体(Pessayre等^[6]也曾提到)。该研究在微观结构上证明了NASH存在线粒体的异常。此外，Lotowska等^[12]在NASH儿童肝样本中也得到了一致的结论。

2. 心磷脂与NAFLD线粒体的功能障碍

线粒体是真核生物进行氧化代谢的部位，也是糖类、脂肪和氨基酸最终氧化而释放能量的场所。因为其内膜上含有丰富的蛋白质(包括呼吸链酶复合体)及大量心磷脂(cardiolipin，CL)，所以承担着复杂的生化反应。而CL的重要性主要来自于它拥有与线粒体蛋白质、酶、代谢物载体相互作用的独特能力，以及能够维持线粒体内膜(inner mitochondrial mem-brane，IMM)的流动性和渗透稳定性^[13]。

线粒体呼吸链上的酶复合体I、复合体III、复合体IV和复合体V都需要CL来维持他们的最佳活性。复合体II在ATP的合成过程中参与氧化磷酸化，但没有参与质子梯度的形成，故没有证据表明CL与其结合。但Schwall等^[14]利用复合体II重组成不同脂质成分的纳米级脂质双层，第一次证实了磷脂环境(尤其是CL的存在)对呼吸链复合体的酶活性及组装至关重要。因此，CL的生物合成与线粒体的呼吸和能量生成相关，CL异常会破坏线粒体的能量动力学。而在上述过程中，CL是如何被调节的尚不清楚。

由于CL在线粒体的生物能量学方面起着重要作用，CL的任何改变都有可能引起一系列线粒体相关疾病，如因编码Tafazzin的基因突变造成CL酰基组成变化而导致的Barth综合征^[15]；CL过氧化、CL含量减少、分子种类改变所导致的心力衰竭^[16]和糖尿病^[17]。同样地，NAFLD患者存在线粒体功能障碍，不仅表现在微观结构中线粒体结构的损伤，还在组织学上证明了NAFLD患者存在线粒体脂质过氧化改变，如Sanyal等^[11]通过免疫组织化学染色剂3-硝基酪氨酸来评估肝脂质过氧化，结果显示正常肝只有少量被染色，而脂肪肝及NASH可见明显染色，表明NAFLD患者脂质过氧化活跃。

2.1. CL的含量

目前研究人员主要通过给大鼠喂养胆碱缺乏(choline-deficient，CD)的饮食制作NAFLD动物模型。Petrosillo等^[18]研究发现：CD大鼠复合体I的活性显著降低，同时采用高效液相色谱法对CD大鼠线粒体膜磷脂进行分析，相较于对照组，实验组CL的水平下降了38%，而过氧化CL显著增加，即NAFLD大鼠线粒体复合物I的活性与CL含量呈正相关；且通过向CD大鼠线粒体外源性地添加CL几乎可以恢复该酶复合体的活性，而这种作用不能被其他磷脂取代，更不能被过氧化CL所取代。这与Sanyal等^[11]的实验结果一致，因此有理由认为CD大鼠肝线粒体中观察到的复合体I活性的缺陷，可能归因于CL的氧化损伤所导致的线粒体CL含量下降。复合体I的活性是线粒体呼吸链的限速步骤，也是调控氧化磷酸化的重要因素，同时复合体I被认为是线粒体氧自由基产生的重要场所^[19]。而CD小鼠肝线粒体中复合体I的损伤可能增加电子传递链的电子泄漏，产生更多的活性氧(reactive oxygen species，ROS)，ROS与IMM的磷脂、酶和膜受体相关的多不饱和脂肪酸的侧链及核酸等大分子物质发生脂质过氧化反应，从而使ROS诱导的线粒体膜损伤循环持续，进而引起肝细胞损伤，最终导致NAFLD。

2.2. CL重构及重构酶

CL的生物学功能被认为取决于其脂肪酸侧链组成，CL脂肪酸侧链以不饱和脂肪酸为主，这种独特的特性并非来源于CL的从头合成，而是来源于CL的重构过程。CL的重构从脱酰化即去除一个酰基生成单溶血心磷脂(monolysocardiolipin，MLCL)开始，已知有3种酶参与了MLCL的再酰化，即单溶血心磷脂酰转移酶1(monolyso-cardiolipin acyltransferase 1，MLCLAT1)^[20]、酰基辅酶A꞉溶血心磷脂酰基转移酶1(acyl-CoA꞉lysocardiolipin acyltransferase 1，ALCAT1)^[21]和Tafazzin^[22]。CL重构也被认为是导致线粒体功能障碍相关疾病的原因^[23]。

Jha等^[24]通过对脂质的系统分析，发现健康的CL[四亚油酰基-CL(tetralinoleoyl-CL，L4CL)及其前体三亚油酰基-MLCL]在NAFLD中减少，而不健康的CL(富含单不饱和脂肪酸、油酸和棕榈酸)在NAFLD中增加。这个研究证实了NAFLD存在CL含量的变化，也从侧面提出不同酰基链组成的CL分子功能可能不同。

2.2.1. ALCAT1

在人体中，CL酰基链以双不饱和酰基链亚油酸链(C18꞉2)为主，磷脂的脂肪酸侧链组成可以通过改变膜流动性、膜内压力梯度和偶极电位影响膜蛋白^[25]，高C18꞉2含量是CL与蛋白质相互作用的首选^[26]。因此，CL脂肪酸侧链组成的变化可以影响其与膜蛋白的作用，从而影响线粒体功能。正常条件下的CL重构可以取代受损的脂肪酸侧链，而在病理条件下，重构则会生成对氧化应激敏感的CL分子种类。Li等^[27]在C2C12小鼠成肌细胞中发现：ALCAT1过表达会选择性地降低C18꞉2这一酰基链组成的CL，而增加了多不饱和脂肪酸长链二十二碳六烯酸链(C22꞉6)的组成比例，从而增加了线粒体膜电位和ROS的生成，最终造成线粒体功能障碍。而CL以多不饱和脂肪酸长链C22꞉6为主，可造成CL过氧化敏感性增加，原因是由于周围双键的存在，与双烯丙基碳结合的氢原子键能较弱，容易被自由基抽离。因此，双烯丙基碳越多，结合的氢原子数目越多，脂肪酸的过氧化敏感性越强，这也是众多疾病的重要发病机制^[28]。除此之外，Li等^[27]还通过实验发现腺病毒在肝癌HepG2细胞中过表达ALCAT1而显著增加了氧化应激和脂质过氧化反应，同时降低线粒体DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)拷贝数，增加mtDNA突变率。mtDNA因为接近IMM，且IMM是ROS产生的主要场所，同时又缺乏保护性组蛋白及损伤的修复机制，所以对氧化损伤极其敏感^[29]。mtDNA编码了氧化磷酸化的13种多肽，包括酶复合体I、III、IV和V，故而mtDNA损伤反过来可造成呼吸链上多肽的合成障碍。

此外，不仅是ALCAT1表达增加会引起线粒体功能变化，ALCAT1缺失也会造成影响。正常情况下受损线粒体可通过自噬作用消除，CL作为识别信号介导线粒体和溶酶体之间的相互作用^[30]，而疾病出现线粒体功能障碍将使得这一作用被破坏。Wang等^[31]将靶向删除ALCAT1的小鼠作为实验组，结果显示：对照组小鼠在高脂饮食18周后出现严重NAFLD，表现为肝肿大、苍白，肝细胞空泡，脂肪变性和纤维化，且肝细胞线粒体严重断裂。相反，实验组小鼠ALCAT1缺失不仅保留了线粒体结构，显著促进了自噬体的生物合成，还使得肝重量和肝三酰甘油水平下降。另外，还发现在原代肝细胞中过高表达ALCAT1会造成自噬缺陷。而在NAFLD小鼠模型中，肝ALCAT1表达显著上调，这表明该酶在NAFLD中的致病作用，即CL重构在NAFLD的发病机制中具有关键性作用。

综上可见，不论是ALCAT1过表达或者缺失，都可能引起肝线粒体CL的含量、脂肪酸侧链的改变，而ALCAT1的过表达将导致肝线粒体功能障碍，最终导致肝损伤甚至NAFLD，而ALCAT1的缺失则有可能减少肝线粒体功能障碍，甚至减少NAFLD的发生，这可能可为NAFLD的治疗提供帮助，但尚待进一步研究。

2.2.2. Tafazzin

不仅是ALCAT1这一重构酶，Tafazzin也被证实其异常将导致CL的变化，从而影响肝线粒体功能。目前，Cole等^[32]将具有可被多西环素(doxycycline，dox)诱导的、TAZ(Tafazzin的蛋白编码基因)特异的短发夹RNA雌性C57BL/6J小鼠与雄性转基因(transgenic，Tg)小鼠交配，其雄性后代作为实验动物，通过喂养dox并抑制其Tafazzin基因(knockdown of Tafazzin，TAZ kd)，从而建立TAZ kd小鼠模型^[33]，发现与阳性对照组相比，TAZ kd小鼠完全不发生肝脂肪变性，肝中三酰甘油的有害积累明显减少，且组织学特征及血浆谷丙转氨酶浓度皆正常。该实验表明沉默了Tafazzin基因，可能同缺失表达ALCAT1一致，可起到保护肝的作用，但是否可通过促进自噬体的生物合成来消除受损的线粒体尚无实验证据。另外，与阳性对照组相比，TAZ kd小鼠肝中CL和L4CL的含量均减少了30%，但对线粒体功能没有明显的负性生理作用：可维持超复合体稳定性，使ROS形成减少，从而可维持线粒体氧化代谢；而与阴性对照组相比，CL和L4CL水平几乎没有差别。而在以往的研究^{[18, 34]}中，当CL和/或L4CL水平降低35%时，肝线粒体即发生功能障碍。TAZ kd小鼠主要通过促进脂肪酸依赖性的耗氧和产热来维持肝的高代谢，同时肝中CL合成酶转位蛋白41(translocator assembly and maintenance protein 41，TAM41)和重塑酶MLCLAT1表达的增加弥补了TAZ表达的减少，同时从TAZ kd小鼠分离的肝细胞中，还发现由醋酸盐和油酸盐合成而来的CL显著增加，这使肝总CL和L4CL水平与阴性对照组小鼠相似。因此，无论总CL和/或L4CL减少多少，都需要先损害线粒体功能，才能进一步使肝受损。而NAFLD的线粒体功能障碍可能在CL重构中起着决定性的作用。

2.2.3. 线粒体酰基辅酶Ａ硫酯酶

除上述3种重构酶外，Zhuravleva等^[35]发现线粒体酰基辅酶Ａ硫酯酶也参与了CL的重构。硫酯酶超家族蛋白-5(thioesterase superfamily member 5，Them5)是一种新型的硫酯酶，对长链不饱和脂肪酸-辅酶A酯具有很强的特异性，与其他3个酶不同的是，Them5并不结合MLCL，而是通过维持酰基来调控CL的上游重构。Them5的缺失会使得辅酶A被困在长酰基辅酶A分子中，这些分子通常不用于CL重构。缺少它们会增加MLCL/CL比率，导致CL在体内失去平衡。该研究还发现在敲除了Them5基因的小鼠中，因为Them5缺失干扰了辅酶A的回收及形成，使得游离脂肪酸减少而进入线粒体，而在细胞溶质堆积时，导致脂肪肝的发展，同时伴随着MLCL的增加及CL的减少。这一实验表明了CL重构及CL含量的变化同时参与了NAFLD的发生。而与上述所提到的研究不同的是，Them5缺失并不能起到保护肝的作用，而是完全相反的负性作用，这可能跟Them5在CL重构中位于上游重构有关，有待进一步深入研究。

3. 治疗的展望

由于CL含量、重构、脂肪酸侧链与线粒体功能障碍所致的NAFLD有关，因此，开发调控CL含量、了解其分子结构可能是研究NAFLD的一种新的药理学方法。其中，Fouret等^[36]发现通过外源性的摄入线粒体靶向抗氧化剂MitoQ(由具由抗氧化作用的辅酶Q和具有靶向作用的三苯基膦组成)，能够使CL含量增加、线粒体ROS生成减少，从而起到保护线粒体功能的作用。而Zhou等^[37]也设计了一种非致瘤性纤维母细胞生长因子(fibroblast growth factor 19，FGF19)类似物M70，它能够调节多途径来传递抗脂肪变性、抗炎和抗纤维化活性，值得注意的是，它能够显著降低有毒脂类的水平、增加未氧化的CL水平，这对NAFLD患者来说是一种潜在的治疗方法。此外，在饮食诱导的脂肪肝小鼠模型中，研究^[38]发现富含核苷酸的三文鱼提取物使线粒体硫氧还蛋白(mitochondrial thioredoxin 2，TXN2)和线粒体合成酶1(cardiolipin synthase 1，CRLS1)显著增加，可以改善肝脂肪变性、肝功能和炎症。其中，TXN2参与调节线粒体膜电位，清除线粒体ROS。而CRLS1是催化合成CL的关键酶。虽然该研究没有测量CL，但三文鱼提取物的补充可能通过上调CRLS1而促进CL的变化，从而保护线粒体。这些都会在临床上具有潜在的应用价值。

4. 结 语

综上所述，NAFLD的发生常伴随着线粒体功能障碍，而CL作为线粒体内膜的重要组成部分，具有重要的生物能量学作用，其含量的变化、重构和脂肪酸侧链的变化都可能参与了线粒体功能障碍所导致的NAFLD。尽管CL在调节线粒体功能中起着重要作用，CL如何被调节的尚不清楚，且与NAFLD的关联并没有被广泛研究。深入研究CL与NAFLD的关系可以为治疗疾病提供新策略。

基金资助

国家自然科学基金(81803595)。

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (81803595).

利益冲突声明

作者声称无任何利益冲突。

原文网址

http://xbyxb.csu.edu.cn/xbwk/fileup/PDF/202106653.pdf