一个PHEX基因新发变异导致的X-连锁低磷性佝偻病家系

Abstract

X-linked hypophosphatemic rickets (XLH) is caused by inactivating mutations in the PHEX gene and is the most common form of hereditary rickets. The treatment is more complicated compared with the general rickets. A family were admitted to the Department of Endocrinology, Hainan General Hospital in 2018. The proband was a 3-year-6-month-old female, Han nationality. She was admitted to hospitalization for bilateral knee valgus and walking instability. The patient’s parents were not in consanguineous marrige，and there was no similar medical history in the family. The patient presented with “O” leg, bracelet sign, chicken breast, and low blood phosphorus. Typical change of rickets also appeared in her X-ray examination. The DNAs of the peripheral blood were extracted from the patient and her parents. All coding exons and flanking regions of PHEX gene in the patient were amplified by PCR, and the mutant sites of the family members were testified by a generation sequencing. A heterozygous variation (c.1482+5G>C) affecting splicing outcome was detected at the splicing region of intron 13 of PHEX gene in the patient. The variation has been included in the human gene mutation database (HGMD). No variation was found in the proband’s parents，the PHEX gene in the patient was a de novo variation. Our research provided reference for the future genetic counseling for this patient and enriched the research data on the relationship between genotype and clinical manifestations.

X-连锁低磷性佝偻病(X-linked hypophosphatemic rickets，XLH)是相对常见的遗传性佝偻病，遗传方式为X-连锁显性遗传，发病率约为1/20 000，女性患者常见^[1]。XLH是由成纤维细胞生长因子23(fibroblast growth factor-23，FGF-23)介导的低血磷引起的，特征为肾小管对磷的重吸收减少，活性维生素D生成不足以及骨矿化不全。多数XLH患者于婴幼儿期发病，表现为身材矮小、双下肢弯曲畸形、四肢肌肉无力、牙釉质发育不良、佝偻病样的骨骼畸形^[2]。实验室检查主要为低磷血症，肾排磷异常增加，血FGF-23水平升高，血甲状旁腺激素(parathyroid hormone，PTH)水平升高或处于参考值范围，儿童期血碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)水平升高，成人后血ALP水平处于参考值范围。

XLH临床表现多样，严重程度不一，临床上不易诊断。因此，尽早地明确基因诊断对临床的诊断、治疗和预后均至关重要。本研究对1例XLH患儿首先采用二代测序技术进行基因检测，发现磷酸盐调节基因(phosphate regulating gene with homologies to endopeptidases on the X chromosome，PHEX)变异c.1482+5G>C；再用一代测序技术验证患儿父母，发现其父母无该基因变异，确诊该变异为PHEX基因新发变异。该变异国外已有相关研究^[3]报道，且已被人类基因突变数据库(human gene mutation database，HGMD)和ClinVar收录，确定为致病变异^[4]。

1. 临床资料

1.1. 一般资料

先证者，女，3岁6个月，2年前被发现双膝关节外翻、行走不稳，生长发育正常，无骨痛、多汗、枕秃、乏力不适，饮食尚可，无挑食，无日照不足，无慢性腹泻，无牙齿畸形及脱落。曾在外院就诊，当时血钙为2.19 mmol/L(参考值范围2.00~2.50 mmol/L)，血磷为0.83 mmol/L(参考值范围0.96~1.60 mmol/L)，左胫腓骨X线提示左侧股骨下段及胫腓骨骨骺异常(图1)，符合佝偻病改变，外院诊断为佝偻病，嘱多接受光照，予间断口服维生素D及葡萄糖酸钙口服溶液治疗；半个月后再次就诊于当地妇幼保健院门诊，查双下肢、骨盆及上肢X线片，提示佝偻病样改变(图2)，予骨化三醇及葡萄糖酸钙锌口服溶液治疗，未见好转；2018年4月就诊于当地妇幼保健院门诊，查骨骼X线片，提示佝偻病样改变(图3)；为进一步治疗来海南省人民医院(以下简称为我院)诊治。体格检查：身高98 cm，上部量55 cm，下部量43 cm，头颅无畸形，前囟闭合，牙齿无缺失、活动及脱落，乳腺发育Tanner 1期，阴毛Tanner 1期，鸡胸(+)，串珠胸(-)，漏斗胸(-)，手镯征(+)，“O”型腿(+)，膝间距3.2 cm。实验室检查：血钙2.46 mmol/L(参考值范围2.50~3.00 mmol/L)，血磷0.81 mmol/L(参考值范围1.45~2.10 mmol/L)，SCr 62.0 μmol/L(参考值范围41.0~73.0 μmol/L)，血PTH 38.7 pg/mL(参考值范围15.0~68.3 pg/mL)，血ALP 468.9 U/L(0~500.0 U/L)，骨ALP阳性(<200 U/L，参考值范围200~250 U/L)，24 h尿钙0.10 mmol/L(参考值范围2.50~3.00 mmol/L)，24 h尿磷16.98 mmol/L(参考值范围13.00~42.00 mmol/L)，24 h尿Cr 3 897 μmol/L，肾磷阈 20.7 mg/L(参考值范围22.0~42.0 mg/L)。患儿父母均无类似症状，其父亲2次血磷检查结果分别为0.83、0.69 mmol/L(参考值范围0.85~1.51 mmol/L)。

图1.

X-连锁低磷性佝偻病患儿1岁时的X线片

Figure 1 X-ray films of the child with X-linked hypophosphatemic rickets at 1 year old

A: Lateral view of the left calf; B: Frontal view of the left calf.

图2.

X-连锁低磷性佝偻病患儿1岁7个月时的X线片

Figure 2 X-ray films of the child with X-linked hypophosphatemic rickets at the age of 1 year and 7 months

A: Frontal view of the chest; B: Dextral view of the chest; C: Frontal view of the left wrist.

图3.

X-连锁低磷性佝偻病患儿3岁5个月时的X线片

Figure 3 X-ray films of the child with X-linked hypophosphatemic rickets at the age of 3 years and 5 months

A: Lateral view of both lower extremities; B: Frontal view of both lower extremities.

既往无恶心、呕吐。患儿的母亲在妊娠期间无妊娠高血压、糖尿病，营养及健康情况良好，分娩方式为剖宫产术。患儿喂养方式与同龄儿相似，产后1个月添加维生素D，产后3个月开始混合喂养，4个月开始添加辅食及牛奶；患儿3个月抬头，6个月出牙，1岁2个月左右会走，智力发育正常。患儿父母非近亲结婚，父母双方均无佝偻病家族史。根据患儿的病史、临床表现、相关实验室检查及影像学检查结果，考虑低磷性佝偻病的可能性大，因家族中无其他成员有此类病史，故诊断考虑为散发性病例。对先证者所在家系进行调查，绘制家系图(图4)。

图4.

X-连锁低磷性佝偻病患儿家系遗传图谱

Figure 4 Genetic map of the X-linked hypophosphatemic rickets proband’s family line

I1: Proband’s father; I-2: Proband’s mother; II-1: Proband.

1.2. 基因诊断

取患儿及其父母外周静脉血各2~3 mL，使用EDTA管抗凝保存并制备样本DNA模板。受检者均签署知情同意书，其中患儿的知情同意书由其父母代签。

对患儿的DNA标本进行DNA酶切使其片段化，构建全基因组文库。使用全外显子杂交捕获探针xGen Exome Research Panel v1.0(Integrated DNA Technologies，Inc.，USA)捕获并构建患儿的全外显子组文库。使用PE150模式在Illumina HiSeq X Ten测序平台(San Diego，CA)上进行双端测序。使用Primer3Plus针对PHEX:NM 000444.5:exon13:c.1482+5G>C位点设计引物(表1)，并使用In-Silico PCR验证引物特异性。

表1.

PHEX基因PCR引物

Table 1 PCR primer of the PHEX gene

引物名称	序列	用途
SG306-F	ACACGACGCTCTTCCGATCTGTTTTCAGATGAAGGGCGCA	PCR扩增正向引物
SG306-R	CCTTGGCACCCGAGAATTCCAGTTAACTCCCAGCAGGCAGA	PCR扩增反向引物
Common-F	ACACGACGCTCTTCCGATCT	测序正向引物
Common-R	CCTTGGCACCCGAGAATTCCA	测序反向引物

在ABI PCR扩增仪上完成患儿父母的DNA标本PHEX基因目标变异位点的PCR扩增。使用ABI3730s型DNA序列自动分析仪(Applied Biosystems公司，美国)对患儿父母的PCR扩增产物进行一代测序，使用CodonCode Aligner软件(CodonCode公司，美国)对测序结果进行序列分析、比对。

经过二代测序技术检测、分析，在患儿PHEX基因13号内含子剪接区域检测到1个可能影响剪接的杂合变异c.1482+5G>C，该变异可能导致mRNA剪接异常。一代验证提示其父母无相关基因变异。患儿二代、一代及患儿父母一代基因分析结果见图5~6。

图 5.

X-连锁低磷性佝偻病患儿2代测序图

Figure 5 Second generation sequencing diagram of the child with X-linked hypophosphatemic rickets proband

图6.

X-连锁低磷性佝偻病患儿及其父母的一代验证图

Figure 6 First generation venification of the child with X-linked hypophosphatemic rickets and her parents

A: Proband mutation site at c.1482+5G>C (arrow); B: Proband’s father is normal (arrow); C: Proband’s mother is normal (arrow).

下划线表示通用序列。

1.3. 治疗及随访

根据临床资料及基因检测结果，患儿被明确诊断为XLH。给予患儿中性磷制剂(磷酸氢二钠235 g和磷酸二氢钾126 g配置成1 000 mL的中性磷制剂) 1 mL，每5 h 1次，骨化三醇胶丸0.25 μg，每天1次，治疗1年。每3个月随访1次，治疗1年后患儿家属诉患儿的症状好转，膝间距由治疗前的3.2 cm缩小至2.5 cm，血钙为2.54 mmol/L(参考值范围2.50~ 3.00 mmol/L)，血磷为0.89 mmol/L(参考值范围1.45~2.10 mmol/L)，血PTH为62.4 pg/mL(参考值范围15.0~68.3 pg/mL)，血ALP为333.8 U/L(参考值范围0~500 U/L)，骨ALP为200~250 U/L(<200 U/L，参考值范围200~250 U/L)，24 h尿钙0.18 mmol/L(参考值范围2.50~3.00 mmol/L)，24 h尿磷为19.77 mmol/L(参考值范围13.00~42.00 mmol/L)。复查双下肢X线片及左腕关节X线片，结果显示：患儿的胫骨弯曲畸形较前好转，干骺端杯口状骨损害较前好转(图7)。

图7.

X-连锁低磷性佝偻病患儿治疗1年后的X线片

Figure 7 X-ray films of the child with X-linked hypophosphatemic rickets at 1 year after treatment A: Frontal view of both lower extremities; B: Frontal view of the left wrist.

2. 讨 论

本例患儿的临床表现包括：1)双膝关节外翻、行走不稳、鸡胸(+)、手镯征(+)，“O”型腿(+)；2)血磷低，尿磷排泄增多，血钙正常，血25-羟维生素D水平和PTH水平正常，血ALP水平升高；3)骨X线片提示干骺端增宽，表面呈毛刷状，局部呈杯口状，胫骨弯曲畸形，胫骨凹侧皮质骨增厚；4)常规补充钙剂及活性维生素D，症状未见明显好转，临床上明确诊断为低磷性佝偻病。

患儿的基因检测提示PHEX基因出现杂合变异(c.1482+5G>C)，该变异已被HGMD和ClinVar收录，且ClinVar将该变异收录为致病性变异，按照美国医学遗传学和基因组学学会(American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG)相关指南，该变异为新发致病性变异，依据如下：1)该变异为新发变异，无家族史且经过双亲验证(PS2)；2)体外功能试验^[5]结果表明该变异可能导致13号外显子跳跃(PS3)；3)该变异为罕见变异，未被gnomAD数据库收录(PM2)；4)生物信息学分析软件预测该变异影响mRNA剪接，基因产物可能造成有害影响(PP3)。

低磷性佝偻病是儿童常见的代谢性骨病，包括遗传性和获得性两大类。其中遗传性低磷性佝偻病有常染色体显性遗传性低磷性佝偻病(autosomal dominant hypophosphatemic rickets，ADHR)、常染色体隐性遗传性低磷性佝偻病(autosomal recessive hypophosphatemic rickets，ARHR)、XLH、伴高钙尿症的遗传性低磷性佝偻病(hereditary hypophosphatemic rickets with hypercalciuria，HHRH)等，获得性的有Fanconi综合征和肿瘤相关性低磷性骨软化症(tumor-induced osteomalacia，TIO)等。遗传性低磷性佝偻病的临床特征相似，给临床诊断带来了困难，尽早地明确基因诊断对临床诊断、治疗及预后至关重要。

XLH是遗传性低磷性佝偻病中最常见的类型，其临床表现不尽相同，患者通常在1~2岁后出现身材矮小、牙齿萌出延迟和骨骼畸形(包括股骨及胫骨弯曲、髋内翻、膝内翻或外翻)^[6]。大部分患者首次就诊的症状是双下肢弯曲畸形^[7]，本例患儿最早因出现双膝关节外翻畸形和行走不稳而就诊。XLH的X线片主要表现为活动性佝偻病的骨骼表现：长骨(胫骨近端、股骨远端、尺桡骨远端)干骺端喇叭口样膨大，呈毛刷状、杯口状改变，骨质疏松，骨皮质变薄；膝关节呈内翻或外翻改变，髋内翻，长骨弓形畸形；下肢改变通常较上肢明显；实验室检查主要表现在血磷水平明显降低，尿磷升高，血钙正常或偏低，血PTH正常或者升高，血25-羟维生素D水平正常，血ALP水平升高(儿童)。

XLH的致病基因为PHEX基因，PHEX基因定位于染色体Xp22.1，由22个外显子组成，编码1个由749个氨基酸组成的蛋白质，与一组肽链内切酶基因具有同源性^[8]。随着临床病例的不断增加，目前(2019年4月21日)，被HGMD收录的PHEX基因突变有529个，包括错义突变、无意义突变、拼接突变、插入突变、移码突变及缺失突变^[5]。PHEX基因突变主要集中在3'端(外显子14~22)^[4]，表明这一区域编码的蛋白质是PHEX的关键蛋白质。本例患儿的基因突变同样发生在3'端，和文献[4]报道的一致，但是突变的位点在3'端第13个内含子，不在文献[4]报道的高发区域内。此位点的突变国内尚未见报道，对本例患儿的报道增加了中国人群PHEX突变的数据库。本例患儿的父母并未检测到PHEX基因突变，提示患儿发生的突变为新发突变。新发突变的来源可能有两种：1)突变可能发生在受精卵形成之后，称为体细胞嵌合；2)突变发生在母亲的生殖细胞(卵子)中，随后形成受精卵，这种情况为生殖细胞嵌合。因此，如患儿父母有继续妊娠的计划，不能完全排除以后胎儿的患病风险，对于这类孕妇一般仍建议行产前诊断。

PHEX蛋白质主要表达在成骨细胞、软骨细胞及牙本质细胞中，在肾中并不表达^[9]，主要调控FGF-23的表达。PHEX发生突变会导致FGF-23在体内堆积^[10]。国外研究^[11]已经证实FGF-23可作为诊断XLH的一个重要指标。FGF-23含有251个氨基酸，主要通过降低钠-磷共转运体蛋白的表达来抑制近端肾小管对磷的重吸收。体内FGF-23水平的升高不仅导致肾对磷酸盐的重吸收减少，而且抑制肾1-α羟化酶的活性，使25-羟维生素D生成减少，从而减少肠道对磷的吸收^[12]。研究^[13]认为：PHEX基因突变会增加FGF-23的表达，从而促进磷的排泄以及减少肠道对磷的吸收，导致低磷血症，但PHEX基因突变增加FGF-23表达的机制及基因的哪个区域负责PHEX的功能仍不清楚。另外，体内FGF-23的水平与XLH病情的严重程度是否相关，目前仍存在争论。国内研究^[14]表明：中国XLH患者人群血清全段FGF-23水平较正常人群显著升高，但个体差异较大，且全段FGF-23水平与患者年龄、PHEX基因突变类型或位置、疾病严重程度并无显著相关性。由于XLH的发病率低，样本量有限，仍需进一步的研究证实。

患儿父亲的实验室检查结果提示存在低磷血症，但无佝偻病及骨软化症的临床表现，反复对其基因进行检测及分析，均未发现与患儿相似的PHEX基因变异，且未检测到导致家族性低磷性佝偻病的相关基因变异，因此考虑患儿父亲出现低磷血症的原因与患儿不同，其低血磷可能与多种基因变异或者其他导致低磷的疾病有关。患儿的佝偻病表现除与PHEX基因变异有关外，可能合并其他的作用机制，后续尚需跟踪患儿父亲血磷变化情况以及扩大家系的研究进一步明确发病机制。

XLH治疗的目的在于减轻骨骼畸形，增加成年期身高及避免并发症的发生。目前的治疗方式主要是补充中性磷制剂及维生素D制剂，但由于血磷水平波动较大，临床不建议用血磷水平作为确定磷的治疗剂量的指标，而是采用临床症状和骨X线改善情况来判断。在低血磷时不适当增加磷的治疗剂量，反而会加重甲状旁腺功能亢进，而无助于血磷的改善^[15]。此患儿在治疗1年后虽然血磷水平未见明显升高，尿磷未见明显的降低，但其临床症状得到了明显的改善，双膝间距明显缩小，骨X线提示佝偻病骨骼表现亦明显改善。随着对低磷性佝偻病研究的深入，新的治疗方法也不断出现。在XLH的小鼠模型中，采用药物抑制24-羟化酶(CYP-24)活性或敲除CYP-24基因后，小鼠佝偻病几乎完全被治愈^[16]，但对人的治疗效果需进一步证实。另外，FGF-23抗体可能成为XLH治疗的新靶点，3期临床试验证实：采用Burosumab治疗X-连锁低磷酸盐血症儿童，能够显著改善佝偻病病情的严重程度^[17]。

综上，XLH临床并非少见，但其诊断和治疗有一定的困难。筛查基因突变不但能够明确诊断，还有利于加深对XLH发病机制和PHEX蛋白质功能的了解。本例患儿自身携带1个致病突变位点，不仅为XLH的诊断提供了分子水平的依据，也为其下一代的遗传咨询提供了理论依据，并且丰富了基因型和临床表现之间的研究资料。

基金资助

海南省卫生健康行业科研项目(20A200160)。

This work was supported by the Scientific Research Projects of Health Industry in Hainan Province, China (20A200160).

利益冲突声明

作者声称无任何利益冲突。

原文网址

http://xbyxb.csu.edu.cn/xbwk/fileup/PDF/202106658.pdf